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第 31 卷第 2 期 2023 年 6 月 纤 维 素 科 学 与 技 术 Journal of Cellulose Science and Technology Vol.31 No.2 Jun.2023 文章编号：1004-8405(2023)02-0010-09 DOI:10.16561/ki.xws.2023.02.06 可电刺激的氧化细菌纤维素复合神经导管可电刺激的氧化细菌纤维素复合神经导管 的制备及其表征的制备及其表征 潘 攀1，洪 枫1,2*（1.东华大学 生物与医学工程学院 微生物工程与医学材料研究组，上海 201620；2.国家先进功能纤维创新中心，江苏 苏州 215000）摘 要：以吡咯为单体，三氯化铁为氧化剂，采用原位氧化聚合技术在复合了壳聚糖微球的细菌纳米纤维素（BNC）网络内部，制备了聚吡咯（Ppy）涂层。使用0.5、1.0 和2.0 g/L 三种不同浓度的吡咯单体，制备得到三种不同 Ppy 涂层的复合管（CSNPs/BNC/Ppy-1、CSNPs/BNC/Ppy-2 和 CSNPs/BNC/Ppy-3），从中筛选出最适宜雪旺细胞生长的 Ppy 浓度为 2 g/L，即材料 CSNPs/BNC/Ppy-3，此时接触角约为68.273.43，电导率可达到 7.3610-3 S/cm。再利用壳聚糖/氧化细菌纤维素复合材料（CSNPs/OBC）包封神经生长因子 NGF，并通过原位氧化聚合技术获得 NGFCSNPs/OBC/Ppy 复合导管，结合聚吡咯的电刺激性，通过 NGF 和 Ppy 在神经因子和支架结构上实现“双刺激法”。结果表明：该NGFCSNPs/OBC/Ppy 神经导管具备多孔微观结构，拥有可降解性和良好生物相容性，在治疗周围神经损伤方面有应用潜力。关键词：细菌纳米纤维素；聚吡咯；电刺激；神经导管；神经生长因子 中图分类号：R318.08 文献标识码：A 周围神经缺损为临床较常见疾病之一，治疗方法复杂。在组织修复领域中，自体移植一直是金标准，但除了供区功能受损和可移植供体来源不足等问题之外，对于一些特殊病例，自体移植术后往往无法获得长期存活，从而使其失去临床价值1。尽管异体移植在一定程度上缓解了这一难题，但异体移植存在免疫排斥风险，导致其应用受到限制。细菌所合成的胞外聚糖产物细菌纳米纤维素（bacterial nanocellulose,BNC），因具有独特的理化性质和生物相容性，在生物医学等领域具有巨大应用潜力2-4，但是，由于人体缺乏纤维素酶，其在体内的降解吸收能力受到一定程度的限制，进而制约了其在组织工程领域的广泛应用。因此，众多研究对 BNC 进行了氧化修饰，以获得氧化细菌纤维素（OBC），实现其在生物体内的可降解吸收。而高碘酸钠法作为一种简单而有效的氧化方法得到广泛应用5。研究表明，电场具有刺激神经突生长、引导细胞定向和极化的能力6。其中，多种导电材料，包括聚吡咯、聚噻吩、碳纳米管和石墨烯等，具有显著的神经冲动传递和神经再生促进作用7-8。而聚吡咯（polypyrrole,Ppy）作为一种带正电荷的杂环导电聚合物，在室温或低温环境下均可使用。该材料具有无毒、低成本、良 收稿日期：2023-06-16 基金项目：国家先进功能纤维创新中心重点项目（HX105210640）。作者简介：潘 攀（1998），女，山东德州人，硕士研究生；研究方向：复合神经导管的制备及表征。通讯作者：洪 枫（1970），男，教授；研究方向：细菌纤维素的低成本制备及其高值应用。 第 2 期 潘 攀等：可电刺激的氧化细菌纤维素复合神经导管的制备及其表征 11 好的导电性能、独特的光、电、声等特性，作为涂层负载到材料上后，可以提高材料的亲水性能，因此是一种非常优秀的导电材料9。尽管聚吡咯存在着不溶不熔、脆性大等缺陷，但其通过原位氧化聚合制备导电材料的方式易于加工，使其成为神经组织工程中广泛应用的导电材料之一10。神经生长因子（nerve growth factor,NGF）作为一类促进生长的因子，是一种生物活性较高的多肽，它可以调节与神经再生有关的多种生理活动。由于神经生长因子的递送需要精准而缓慢的递送系统，因此神经导管成为了一种理想的载体，可满足这一需求11。目前，探索纤维素与导电填料的复合应用已成为学术界的热门研究方向。Ppy 因其卓越的导电性能、优异的生物相容性以及出色的环境稳定性等优点，在商业应用领域拥有广阔前景。为了克服 Ppy 存在的难以溶解和熔化，以及力学性能欠佳等缺陷，本文先以 BNC作为神经导管骨架，以吡咯为单体，复合壳聚糖（CS），制备 CSNPs/BNC/Ppy 复合管，评估复合可行性；再通过氧化复合改性制备 CSNPs/OBC/Ppy，包封 NGF，利用 NGF 和 Ppy“双刺激法”，制备一种可电刺激、生物相容性高、促神经生长和体内可降解的新型神经导管 NGFCSNPs/OBC/Ppy。1 实验 1.1 试剂与材料 细菌纤维素由本实验室保藏木葡糖醋酸杆菌 Komagataeibacter xylinus ATCC 23770 发酵获得，吡咯单体购自美国 Sigma-Aldrich 公司；RPMI1640 培养基购自国药集团试剂有限公司；神经生长因子购自美国Life-Tech 公司；氧气购自上海强立工业气体有限公司。1.2 CSNPs/BNC/Ppy 和 NGFCSNPs/OBC/Ppy 神经导管的制备 BNC 管制备：BNC 制备装置由支架和安装在内支架内的玻璃管内组成12。硅胶管（外径壁厚长度：90.5130 mm）中央固定一根直径长度：3120 mm 玻璃棒，使用硅胶塞对其两端进行密封。菌液 30静置培养 10 d 后，获取 BNC 管。BNC 管浸渍于 1.0%（w/V）NaOH 水溶液中，超纯水调整 pH 为中性，115高压灭菌 30 min 后，初步脱水备用。CSNPs/BNC/Ppy 管制备：使用压力注射法，向 BNC 管内注入壳聚糖（CS）/吡咯（Py）混合溶液。具体步骤如下：吸水滤纸初步吸去多余水分，一端与注射器连接，一端密封，在 0.03 MPa 的压力下将 0.5%壳聚糖吡咯单体混合溶液注入 BNC 管壁至膨胀后，浸入 1%（w/V）Na2SO4水溶液 5 min。其中，按照吡咯单体/氧化剂（氯化铁 FeCl3）/掺杂剂（对甲苯磺酸钠 pTS）121 的体积比例进行氧化聚合反应。吡咯单体浓度为 0.5、1.0 和 2.0 g/L，得到三种导电聚吡咯材料，分别命名为 CSNPs/BNC/Ppy-1、CSNPs/BNC/Ppy-2、CSNPs/BNC/Ppy-3。OBC 管与 NGFCSNPs/OBC/Ppy 管制备：采用高碘酸钠氧化法，即将经过纯化的 BNC 管材置于棕色瓶中，加入 0.05 M 的高碘酸钠溶液，随后在 50、80 r/min 的水浴震荡反应器中进行反应后，将氧化的 BNC（OBC）转移至 1%乙二醇中，室温静置 15 min，材料内剩余的 IO4-离子除尽后，终止氧化。过滤、洗涤，获取 OBC 管。之后使用压力注射法，在牛血清保护下，向 OBC 管内注入 NGF/CS/Py 混合溶液，实现 NGF的材料负载。其余步骤同 CSNPs/BNC/Ppy 制备方法，其中，NGF 浓度为 10 ng/mL，吡咯采用 CSNPs/BNC/Ppy-3中 Py 浓度，最终获得 NGFCSNPs/OBC/Ppy 神经导管。流程见图 1。12 纤 维 素 科 学 与 技 术 第 31 卷 图 1 复合材料的制备路线 1.3 微观结构观察 将冻干好的材料固定在电镜台上，10 mA 喷金处理 60 s，重复三次后在场发射扫描电镜（日立 S4800，日本）上拍照。1.4 X-射线衍射表征 利用 X-射线衍射仪（D/Max-2550，日本 Rigaku）对材料进行扫描得到 X-衍射图谱。其中，CuK 辐射、管电压为 40 kV、管电流为 50 mA、扫描速率为 10/min。1.5 力学性能测试、导电性能测试、亲水性测试 采用万能拉力试验机（HY-0580，上海衡翼精密仪器有限公司）测试导管的机械性能。选择标距 1 cm、50 N 探头、25 mm/min 拉伸速度。将 CSNPs/BNC、CSNPs/BNC/Ppy-1、CSNPs/BNC/Ppy-2 和 CSNPs/BNC/Ppy-3 导管干燥为薄膜后，裁剪为 5 mm5 mm，测量其平均厚度。室温下，采用四探针测试仪（ST2258C，苏州晶格电子有限公司），选择样品 5 个不同位置进行电导率测试。间距 1 mm。根据公式（1）进行电导率计算：L RS （1）其中，L 为样品厚度（cm）；R 为电阻（）；S 为样品横截面积（cm2），为导电率（Scm-1）。将材料置于矩形载玻片上，采用接触角测试仪（OCA40，德国 Dataphysics 公司）进行测量。表面施加2 L 的蒸馏水滴，设定拍摄记录的时间间隔为 0.09 s，测量范围为 0 至 180。1.6 细胞毒性、分化评估 在神经组织工程中，神经细胞是其中最重要的因素之一。雪旺细胞（schwann cells,SC）是一类独特的神经胶质细胞，它们在周围神经系统中扮演着重要的角色，同时也被称为神经膜细胞。其主要职责在于维护神经轴突的形态和功能，特别是在神经缺损的修复过程中扮演着至关重要的角色。因此，选择 SC 表征材料的生物相容性，制备 SC 悬液，随后在铺有材料的孔板中进行每孔 500 L 的细胞悬液的种植。控制恒定电压为 100 mV/cm，在孔板的每个孔两侧施加电刺激，经过 1、3、5 d 的细胞培养后，使用 CCK-8 试剂盒对细胞毒性进行评估，以确定其活性细胞数量。第 2 期 潘 攀等：可电刺激的氧化细菌纤维素复合神经导管的制备及其表征 13 PC12 是肾上腺嗜铬瘤细胞瘤克隆的神经细胞株。由于其对 NGF 高度敏感的特性以及在分化前后显著的形态差异，该细胞常被用作模式细胞，以研究神经导管支架对神经细胞分化的影响和作用，因此选择PC12表征复合材料对细胞分化的影响。孵育 4 小时，将培养液吸出。洗吹 PC12 细胞，制备菌悬液，在进行为期 5 d 的细胞培养后，用 PBS 溶液进行三次清洗，接着加入经过稀释的 400 L 荧光染料，37下孵育 30 min。1.7 体外降解实验 模拟生理条件，记录降解前样品质量（W0），将 50 mg 的冻干样品浸泡在装有 10 mL PBS（pH 7.4）的EP 管中，水浴震荡（37和 100 r/min）。第 2、4、8 和 12 周时取出离心管，去离子水冲洗，冻干后称重（Wt）。体外降解率W 计算公式如（2）所示。W/%（W0Wt）/W0100 （2）其中，初始时样品质量为 W0。1.8 NGF 的缓释行为 取 2 cm 长的 NGFCSNPs/OBC/Ppy 神经导管置于 EP 管中，加入 5 mL 的 PBS 溶液（含 0.1 mg/mL叠氮化钠）。NGF 浓度为 10 ng/mL。接着，在 37和 100 r/min 的条件下，测试 NGF 缓慢释放至恒温水浴振荡锅中的情况。分别于 1、2、4、6、9、13、17、22 天取 0.5 mL 至 EP 管中，取样结束后，补充等量的PBS 溶液后放回水浴锅继续缓释。在此基础上进行 3 组平行试验，NGF 试剂盒检测不同时间点的药物释放情况，利用公式（3）计算 NGF 累积缓释效率，并绘制缓释效率曲线。R/%VCnCi n-1i=1ViR0100 （3）R 为累积缓释率，R0为实际药物量，Cn与Ci分别为第 n 次和第 i 次取样的 NGF 浓度，V 为缓释溶液总体积（mL），Vi为取样体积（mL）。2 结果与讨论 2.1 CSNPs/BNC/Ppy 复合材料的微观形貌 图 2 所示为四种复合材料的 SEM 照片，CSNPs/BNC/Ppy 支架的表面呈现出很清晰的纤维脉络，纤维表面沉积有一层均匀的聚吡咯，且表现为颗粒状，随着吡咯单体浓度的增加，不连续的 PPy 粒子逐渐演化成一个连续的纳米鞘结构，纳米颗粒的数量也随之呈现出不断扩大的趋势，其中 CSNPs/BNC/Ppy-3 表面的纳米颗粒数量最为丰富。随着吡咯用量的增加，吡咯单体的聚合将导致聚合产物颗粒扩大，而多余的分子聚合则会在纤维表面形成颗粒状产物。同时，在适当浓度内随着聚吡咯与 BNC 的复合，没有破坏 BNC 原有的三维网络结构。初步表明，聚吡咯在保持支架原本结构的基础上，已成功地实现了 CSNPs/BNC 纳米纤维表面的涂层。14 纤 维 素 科 学 与 技 术 第 31 卷 图 2 四种复合材料的 SEM 照片 2.2 CSNPs/BNC/Ppy 的理化性能 图 3a 显示，CSNPs/BNC 的三个主要 X-射线衍射峰分别位于 19.1、22.3、28.9。而在 CSNPs/BNC/Ppy-1，CSNPs/BNC/Ppy-2 和 CSNPs/BNC/Ppy-3 的谱图中仅在 25 处观察到一个主要衍射峰，对应 Ppy 的主要峰。这是由于 BNC 纤维芯材完全被无定形 Ppy 鞘包裹，BNC 纤维芯的结晶行为受到阻碍而无法显示出 BNC的结晶峰。而且随着 Ppy 含量的增加，25 处无定形峰的强度越来越高。102030405060强度/(a.u.)2q/()CSNPs/BNC CSNPs/BNC/Ppy-3 CSNPs/BNC/Ppy-2 CSNPs/BNC/Ppy-1a 030609002004006008001000应力/KPa应变/%CSNPs/BNC CSNPs/BNC/Ppy-1 CSNPs/BNC/Ppy-2 CSNPs/BNC/Ppy-3b 图 3 四种复合材料材料的 X-射线衍射图（a），应力应变曲线（b）表 1 四种复合材料的水接触角与电导率 样品名称 接触角/()电导率/(Scm-1)CSNPs/BNC 83.843.19/CSNPs/BNC/Ppy-1 80.704.21 5.4110-4 CSNPs/BNC/Ppy-2 78.273.43 3.1710-3 CSNPs/BNC/Ppy-3 68.273.43 7.3610-3 随着吡咯浓度的增加，材料的应力应变曲线逐渐下降，图 3b 中，应力从大到小依次排序如下：CSNPs/BNCCSNPs/BNC/Ppy-1CSNPs/BNC/Ppy-2CSNPs/BNC/Ppy-3。CSNPs/BNC/Ppy 的力学性能相较于 CSNPs/BNC 而言，呈现出明显的下降趋势，但仍处于作为支架材料可允许的力学性能范围内。结合之前的 SEM，可以清晰地看到聚吡咯在细菌纤维素的三维结构中，BNC 作为支架的内部结构并没有被破坏。因此，将聚吡咯分布在 BNC 的 3D 网络结构中时，BNC 赋予了聚吡咯作为神经导管所需的力学性能。同时细菌纤维素表面被聚吡咯包覆，随着聚吡咯浓度增大，形成纳米鞘结构的同时，纤维素氢键等相互作用力降低，导致聚吡咯对细菌纤维素的结晶结构造成了一定程度的破坏，从而降低了其结晶度与力学性能。第 2 期 潘 攀等：可电刺激的氧化细菌纤维素复合神经导管的制备及其表征 15 表 1 所示，随着聚吡咯浓度增加，接触角逐渐减小。可能是 Ppy 和掺杂剂对甲苯磺酸钠 pTS 分子上的亲水性基团氨基和磺酸基导致的，而聚吡咯涂层本身的亲水性则进一步提升了材料的亲水性。表1中，聚吡咯涂覆后的复合材料表现出了一定的导电性，其中，聚吡咯浓度最大的 CSNPs/BNC/Ppy-3 的电导率最大。但若在实验中继续增加聚吡咯浓度，导电率并不会一直增大，这可能是因为复合材料达到饱和，无法再与 BNC 进行复合。在前期研究中，可以知道在细胞培养过程中，若介质的导电性过高，会导致外界刺激电流过高，进而造成细胞非正常死亡，因此电导率也不是越高越好。2.3 CSNPs/BNC/Ppy 的生物相容性 生物材料应当具备出色的生物相容性，以确保其在不同环境下的适应性和稳定性。为了探究细胞生长的差异，选择神经细胞雪旺细胞 SC 作为种子细胞，以 CSNPs/BNC 作为对照组，CSNPs/BNC/Ppy-1、CSNPs/BNC/Ppy-2、CSNPs/BNC/Ppy-3作为实验组，进行SCs的接种以及在电刺激和无刺激条件下的培养。图 4a 显示经过 5 d 的培养，SCs 在所有样品上持续增殖，这表明所有样品生物相容性较好。选取第 5 天的材料进行荧光染色结果如图 4b 所示，相较于其他组，电刺激下 CSNPs/BNC/Ppy-3 上的活细胞数量最多，这表明 Ppy 导电涂层能够显著提高 SC 细胞在 CSNPs/BNC 复合材料材料表面的增殖，在电刺激条件下更为明显。综上，在神经细胞 SC 增殖的过程中，无论是 Ppy 涂层，还是电刺激，均发挥了重要的功效。将两者进行结合，利用 Ppy 涂层进行电刺激，明显增大了细胞增殖能力。因此，为更好的适宜细胞生长，选择 CSNPs/BNC/Ppy-3 用于后期研究。DAY1DAY3DAY50.00.30.60.91.21.5492 nm吸光度 CSNPs/BNC CSNPs/BNC/Ppy-1 CSNPs/BNC(ES)CSNPs/BNC/Ppy-1(ES)CSNPs/BNC/Ppy-2 CSNPs/BNC/Ppy-3 CSNPs/BNC/Ppy-2(ES)CSNPs/BNC/Ppy-3(ES)a 图 4 SC 细胞 CCK-8 值（a），第五天内荧光染色图（b），ES：电刺激 2.4 CSNPs/OBC/Ppy 的神经导管的降解性能 在神经修复过程中，为达到更好的修复再生效果，人工神经导管支架材料的降解性能需要与神经修复速率相匹配。而通过高碘酸钠法对 BNC 进行氧化修饰，可有效实现材料的可降解性，基于此原理，进而制备了可体内降解的 CSNPs/OBC、CSNPs/OBC/Ppy 和 NGFCSNPs/OBC/Ppy 三种复合材料。通过体外模拟生理环境，进行体外降解以获得不同复合材料的降解性能。经过十二周的实验时间，分别在第 2、4、6、8、10、12 周时测量降解曲线，结果见图 5。12 周后，CSNPs/OBC/Ppy-3 和 NGFCSNPs/OBC/Ppy-3 质量损失基本相同，而且降解速率明显要低于 CSNPs/OBC，可能是因为随着聚吡咯浓度的增加，与材料骨架形成协同关系，减缓了材料的降解速率。16 纤 维 素 科 学 与 技 术 第 31 卷 024681012010203040体外降解率/%降解时间/周 CSNPs/OBC NGFCSNPs/OBC/Ppy CSNPs/OBC/Ppy 0510152025020406080缓释率/%缓释时间/d 缓释率/%缓释量/ng012345缓释量/ng 图 5 三种复合神经导管的降解曲线 图 6 NGF 的缓释曲线 2.5 NGF 缓释行为 根据图 6 所示的曲线，第一天的缓释率约为 7.23%，随着时间的推移，NGF 的释放呈现出快速缓释的趋势；直至第 9 天酰胺键发生水解断裂，导致 CSNPs 逐渐崩解，内部 NGF 得以释放，缓释率约为 62.9%；同时，NGF 的缓释速率在第 9 天开始逐渐减缓，直至第 13 天达到 70.7%的缓释量，随后持续缓慢释放；当 NGF 的缓释率在 22 天达到 71.7%并趋于稳定时，可以推断其释放已经接近尾声。2.6 NGFCSNPs/OBC/Ppy 的生物相容性 选择 SC 细胞为种子细胞，CSNPs/OBC 组为对照组，CSNPs/OBC/Ppy 和 NGFCSNPs/OBC/Ppy 为实验组。图 7a 展示了在第 1、3、5 天，SC 细胞增速较慢，但是在第 5 天之后，三种材料中细胞数目皆有明显增加。为进一步观察细胞增殖情况，选取培养 5 天后的各组材料，进行免疫荧光染色。如图 7b 所示，NGFCSNPs/OBC/Ppy 材料中细胞增殖明显，可能是因为 NGF 在第 5 天逐渐缓释出来，发挥其生物活性，促进细胞增殖。这与之前所作的 NGF 缓释实验对应。DAY1DAY3DAY50.00.20.40.60.81.01.2492 nm吸光度 CSNPs/OBC CSNPs/OBC/Ppy NGFCSNPs/OBC/Ppya 图 7 SC 细胞 CCK-8 值（a），第五天内荧光染色图（b）2.7 细胞分化行为 在电刺激条件下，可以观察到随着聚吡咯浓度的增加，PC12 细胞数目逐渐增多，如图 8a 所示，这说明适当浓度的 Ppy 和 NGF 有利于 PC12 细胞的增殖繁殖，在 Ppy 单独存在时，也可以促进 PC12 细胞的生长，但是效果低于可以实现 Ppy 和 NGF“双刺激”的 NGFCSNPs/OBC/Ppy。图 8b 展示了电刺激下，三组之中都出现了分化细胞，NGFCSNPs/OBC/Ppy 组中 PC12 细胞分化数目最多。证明 NGFCSNPs/OBC/Ppy 中的 NGF 有利于细胞分化，同时，在 CSNPs/OBC 组也可以发现少 第 2 期 潘 攀等：可电刺激的氧化细菌纤维素复合神经导管的制备及其表征 17 量分化细胞，这说明，在没有生长因子、导电材料的前提下，给 CSNPs/OBC 施加简单的电刺激，也可以有效诱导部分 PC12 细胞进行分化。这可能是因为即便没有额外加入导电材料，但是细胞培养基中包含大量导电离子，变相搭建了导电的桥梁。CSNPs/OBCCSNPs/OBC/Ppy NGFCSNPs/OBC/Ppy020406080100PC12增殖能力/%a CSNPs/OBC/PpyCSNPs/OBC/PpyNGFCSNPs/OBC/Ppy020406080100PC12F分化能力/%b 图 8 PC12 细胞在不同复合材料上的增殖情况（a）和分化程度（b）3 总结 由于周围神经缺损的治疗方案十分复杂，并且在治疗中的致残率较高，术后的效果较差，为树立神经组织修复新的研究思路和方向，结合神经细胞、神经因子和电刺激等多个领域，提出了一种新型神经导管支架。首先，以吡咯为单体，采用纤维网络原位氧化聚合技术，在与壳聚糖微球复合的 BNC 表面制备了Ppy 涂层。电刺激条件下，在三种不同浓度的聚吡咯涂层材料中，筛选出最适宜雪旺细胞生长的 Ppy 浓度为 2 g/L，即材料 CSNPs/BNC/Ppy-3，此时接触角约为 68.273.43，电导率可达到 7.3610-3 S/cm，对雪旺细胞的增殖有着积极影响。其次，为进一步提高材料的神经修复能力，利用 CSNPs/OBC 包封神经生长因子 NGF，通过 NGF 和 Ppy“双刺激法”制备了具备良好生物相容性且可体内降解吸收的NGFCSNPs/OBC/Ppy 神经导管。实验证明，NGF 可通过该复合神经导管进行缓慢释放，为神经轴突再生提供生物线索，电刺激和 NGF 的“双刺激”引入有利于促进 SC 和 PC12 细胞的增殖和分化，极大地提升了神经修复的效能，在医学领域具有重要意义。目前研究仅局限于细胞水平，后续将开展动物实验，以进一步检测材料的神经修复效果。同时，影响聚吡咯导电性能的因素众多，如掺杂剂的种类、体系体积比、施加电压种类与大小等，今后将进一步探讨影响复合神经导管导电率的各种因素。参考文献：1 MA K H,SVAREN J.Epigenetic control of schwann cellsJ.The Neuroscientist,2018,24(6):627-638.2 CHEN J,FENG L,YANG X P,et al.Research progress of preparation and application of bacterial celluloseJ.Cellulose Science and Technology,2014,22(2):58-63.3 WEI 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nanocellulose(BNC)composite using pyrrole as monomer.Three different Ppy coating composites(CSNPs/BNC/Ppy-1,CSNPs/BNC/Ppy-2 and CSNPs/BNC/Ppy-3)were prepared by using three different concentrations of pyrrole monomers.The most suitable concentration of Ppy for the growth of Schwann cells was 2 g/L,namely,CSNPs/BNC/Ppy-3,with a contact angle of 68.273.43 and a conductivity of 7.3210-3 S/cm.Then chitosan microspheres/oxidized bacterial cellulose composite(CSNPs/OBC)was used to encapsulate nerve growth factor NGF.Combined with the electrical stimulation of polypyrrole,the“double stimulation method”was realized through NGF and Ppy based on nerve factor and scaffold structure.The results showed that the NGFCSNPs/OBC/Ppy nerve conduit had porous microstructure,degradability and good biocompatibility,showing significant application potential in the treatment of peripheral nerve injury.Key words:bacterial nano-cellulose;polypyrrole;electrical stimulation;nerve conduit;nerve growth factor