苦蒿素改善新生大鼠急性肺损伤的作用机制.pdf

医学分子生物学杂志,2023,20(5):439-443 J Med Mol Biol,2023,20(5):439-443DOI:10.3870/j.issn.1672-8009.2023.05.010资助项目:泉州市科技计划项目(No.2020N058s)通讯作者:林文东(电话:[phone],E-mail:yangyalong0222 )This work was supported by a grant from the Quanzhou Science and Tech-nology Plan Project(No.2020N058s)Corresponding author:LIN Wendong(Tel:[phone],E-mail:yan-)苦蒿素改善新生大鼠急性肺损伤的作用机制杨亚龙,林文东,林清凡泉州医学高等专科学校 福建省泉州市,362100【摘要】目的 分析苦蒿素改善急性肺损伤(acute lung injury,ALI)的机制。方法 60 只新生大鼠随机等分为假手术组、模型组、苦蒿素低、中、高剂量组和地塞米松组。血氧分压(PaO2)和肺干湿重比(W/D)评估肺水肿;HE 染色检测肺组织病理损伤;ELISA 检测大鼠支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavage fluid,BALF)中氧化应激和炎性水平;蛋白质印迹法检测大鼠肺组织高迁移率族蛋白 B1(high mob-ility group box 1 protein,HMGB1)/核因子 B(nuclear factor kappa-B,NF-B)信号通路相关蛋白表达。结果 与模型组相比,苦蒿素高剂量组 PaO2明显上升,W/D 和肺损伤评分、BALF 炎症和氧化应激水平、肺组织 HMGB1、TLR4 和 p-NF-B P65/NF-B P65 表达明显下降(P 0.05)。结论苦蒿素通过提高抗氧化抗炎活性及阻断 HMGB1/NF-B 信号通路改善 ALI。【关键词】苦蒿素;急性肺损伤;高迁移率族蛋白 B1;TOLL 受体 4;核因子 B;氧化应激反应【中图分类号】R563Mechanism of Blinin on Improving Acute Lung Injury in Neonatal RatsYANG Yalong,LIN Wendong,LIN QingfanQuanzhou Medical College,Quanzhou,Fujian,362100,China【Abstract】ObjectiveTo analyze the mechanism of blinin in improving acute lung injury(ALI).Methods A total of 60 neonatal rats were randomly divided into 6 groups,the sham opera-tion group,the model group,the blinin low-,medium-and high-dose groups,and the dexametha-sone group.The pulmonary edema was assessed by the blood partial pressure of oxygen(PaO2)andthe lung wet/dry weight ratio(W/D).The pathological damage of lung tissues was detected by HEstaining.The levels of oxidative stress and inflammation factors in the bronchoalveolar lavage fluid(BALF)were detected by ELISA.The expression levels of the high mobility group box 1 protein(HMGB1)/nuclear factor kappa-B(NF-B)related proteins in lung tissues were detected byWestern blotting.Results The PaO2was significantly increased in the blinin high-dose group whencompared with that in the model group,while the W/D and lung injury scores,the levels of inflam-mation and oxidative stress fators in BALF,and the expression levels of HMGB1,TLR4 and p-NF-B p65/NF-B p65 in lung tissues were significantly decreased(P 0.05).ConclusionBlinincan improve ALI by enhancing anti-oxidation and anti-inflammatory activity and blocking theHMGB1/NF-B signaling pathways.【Key words】blinin;acute lung injury;high mobility group box 1 protein;TOLL receptor 4;nuclear factor kappa-B;oxidative stress response 急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是一种由各种原因导致的肺部急性弥漫性浸润性病变,肺水肿为其主要特征,研究表示有多个有关炎症和氧化应激的 信 号 通 路 参 与 了 ALI 的 发 生 发 展 过程1-2。ALI 的具体发病机制尚无临床统一定论,目前临床常用的机械通气法容易刺激患者肺组织,吸入血管舒张剂的治疗效果已不如其他方案,实现ALI 有效治疗的探索脚步从未停歇3-4。现代药理研究表明,苦蒿素是从金龙胆草中提取的具有较强抗炎作用的有效成分,能够发挥清热解毒、止咳化痰,平喘利湿等作用5-6,目前将苦蒿素应用在肺部疾病治疗的相关研究尚少,但基于其药理特性,认为其可能具备改善 ALI 的功效。高迁移率族蛋白/核转录因子(high mobility group box 1 protein/nu-clear transcription factor-B,HMGB1/NF-B)是与炎性反应和免疫抑制密切相关的经典信号通路,调节机体免疫炎性反应几乎都会经过 HMGB1/NF-B信号通路,本研究观察了苦蒿素对 HMGB1/NF-B信号通路的调节作用,判断其是否为作用机制之一。地塞米松具有高效抗炎作用,通过调节胞内相关信号转导途径抑制机体炎性反应7。因此,本研究以地塞米松的抗炎效果作为参考,评估苦蒿素对 ALI 大鼠肺部炎症的改善效果。1 材料与方法1.1 实验动物本研究选用的实验动物为 5 7 周龄的新生Wistar 大鼠 60 只,重约 200 g,上海斯莱克实验动物有限责任公司,SCXK(沪)(2017-0005)。1.2 试剂与仪器主要试剂:苦蒿素标准品(20210526),吉至生化科技有限公司;白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-1 和肿瘤坏死因子 (tumor necrosisfactor,TNF-),QuicKey Elabscience 公司,检测范围:7.81 500 pg/mL;超氧化物歧化酶(su-peroxide dismutase,SOD)、髓过氧化物酶(myeloper-oxidase,MPO)、丙 二 醛(malondialdehyde,MDA)和过氧化氢酶(catalase,CAT),韵泰信息科技有限公司;所有单克隆抗体均购于 Abcam 公司。主要仪器:OLYMPUS BX60 型光学显微镜;Bio-Rad iMark680 多功能酶标检测仪。1.3 动物分组与造模将大鼠随机分为 6 组,每组 10 只,分别为假手术组,模型组,苦蒿素低、中、高剂量组和地塞米松组。假手术组常规饲养,其他组大鼠持续暴露于 25,60%70%湿度,90%95%常压氧气的有机玻璃容器内建立 ALI 模型8。模型建立后,将药物溶解于二甲基亚砜中,苦蒿素低、中、高剂量组大鼠分别通过腹腔注射 7 d 苦蒿素苦蒿素12.5、25、50 mg/kg9,地塞米松组大鼠通过腹腔注射 7 d 地塞米松 10 mg/kg10,模型组和假手术组大鼠用生理盐水取代。1.4 标本采集注射试剂后第 8 天,将大鼠麻醉,之后向大鼠气管内注射无菌 PBS 灌洗肺部,获取支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)。在4、2 184 r/min 条件下离心 10 min 以分离 BALF上清液。然后分离大鼠肺组织为两份,一份制备成匀浆组织备用,另一份固定待病理检查。1.5 观测指标1.5.1 肺水肿通过吸入异氟烷麻醉动物,从颈主动脉中采集血样。采用自动血气分析仪测量PaO2;采用干湿重法测定肺湿重/干重比值,右肺称重记录湿重(W),70 下干燥右肺 48 h 至恒重,测量干重(D),计算 W/D。1.5.2 肺组织损伤将上述 1.4 中使用 4%多聚甲醛固定好的肺组织样本进行石蜡包埋,三分之一处连续切片,采用苏木精-伊红染色法(hematoxy-lin-eosin staining,HE),观察肺组织损伤图像。1.5.3 BALF 中 HMGB1、炎性因子和氧化应激水平 大鼠 BALF 中 IL-6、IL-1、TNF-、SOD、MPO、MDA 和 CAT 水平均采用酶联免疫吸附测定(en-zyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法测定。1.5.4 肺组织 NF-B 通路表达 裂解大鼠肺组织匀浆后提取蛋白,随后行 SDS-PAGE 电泳,电子转移到 PVDF 膜,将膜与封闭缓冲液孵育并洗涤,与HMGB1(12 000)、TLR4(12 000)、NF-B P65(12 000)和 p-NF-B P65(12 000)一抗孵育过夜。使用 HRP 偶联二抗(1 4 000,Abcam;14 000,Sigma-Aldrich)孵育膜,室温条件下孵育2 h,电化学发光显像,以磷酸甘油醛脱氢酶(re-duced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase,GAP-DH)作为内参。1.6 统计学分析本研究所有数据均采用 SPSS 21.0 软件进行分析,W/D、肺 损 伤 评 分、PaO2、IL-6、IL-1、TNF-、SOD、MPO、MDA、CAT水 平 以 及HMGB1/NF-B 蛋白表达等计量资料以(x s)表示,单因素方差分析差异性,SNK-q 比较多组两两间差异,P0.05 表示差异有统计学意义。2 结果2.1 苦蒿素对肺水肿的效果通过采用干湿重法对各组大鼠肺水肿进行评估,发现模型组大鼠 PaO2明显低于假手术组,W/D 和肺损伤评分明显高于假手术组(P 0.05),说明 ALI 大鼠肺部水肿更严重,损伤程度更高;与模型组相比,苦蒿素高剂量组和地塞米松组大鼠PaO2明显上升,W/D 和肺损伤评分变化趋势相反,随着苦蒿素剂量增加,效果更明显(P 0.05)。说明苦蒿素对肺水肿的改善效果与地塞米松无显著差异(表 1)。表 1 苦蒿素对 ALI 新生大鼠肺水肿的影响分组剂量(mg/kg)W/D肺损伤评分PaO2(mmHg)假手术组4.48 0.451.84 0.4696.12 10.68模型组5.62 0.6213.16 1.9265.63 5.72苦蒿素低剂量组12.55.46 0.539.71 1.79#71.23 6.36苦蒿素中剂量组255.16 0.437.42 1.37#73.63 5.40#苦蒿素高剂量组504.79 0.43#5.10 1.02#83.67 7.71#地塞米松组104.88 0.42#4.63 1.02#84.35 9.35#与假手术比较,P0.05;与模型组比较,#P0.052.2 HE 染色检测苦蒿素对 ALI 新生大鼠肺组织病理损伤HE 染色结果显示,假手术组大鼠肺组织正常,无水肿等明显病变;模型组和苦蒿素低剂量组细胞结构紊乱,肺泡腔有明显渗出,有炎性细胞浸润,说明低剂量苦蒿素对于 ALI 大鼠肺部损伤无明显作用;苦蒿素中、高剂量组和地塞米松组大鼠肺渗出和浸润情况得以明显改善,说明一定浓度的苦蒿素能够发挥一定抗炎作用(图 1)。1:假手术组;2:模型组;3:苦蒿素低剂量组;4:苦蒿素中剂量组;5:苦蒿素高剂量组;6:地塞米松组图 1 HE 染色检测 ALI 新生大鼠肺组织病理损伤(HE 染色,400)2.3 苦蒿素对 ALI 新生大鼠 BALF 中炎症指标的影响ELISA 检测结果显示,模型组大鼠 BALF 中炎症水平明显高于假手术组(P 0.05),说明大鼠发生 ALI 后,肺部炎症水平增加;苦蒿素高剂量组大鼠和地塞米松组大鼠 BALF 中炎症水平明显低于模型组,随着苦蒿素剂量增加,作用更为明显(P 0.05),说明随着苦蒿素剂量增加,其抗炎效果更明显,当达到一定浓度后,其效果与地塞米松作用相似(表 2)。表 2 苦蒿素对 ALI 新生大鼠 BALF 中炎症指标的影响分组剂量(mg/kg)IL-6(pg/mL)IL-1(pg/mL)TNF-(pg/mL)假手术组49.47 5.2326.25 4.6847.07 5.53模型组118.74 11.9288.13 14.67129.30 13.08苦蒿素低剂量组12.5107.20 11.72#77.31 13.54113.11 11.14#苦蒿素中剂量组2585.01 9.20#58.12 11.48#88.81 9.25#苦蒿素高剂量组5068.41 9.57#37.76 7.19#80.32 10.29#地塞米松组1064.94 8.68#40.84 9.60#72.53 9.25#与假手术比较,P0.05;与模型组比较,#P0.052.4 苦蒿素对氧化应激的影响ELISA 检测结果显示,模型组新生大鼠 SOD和 CAT 水平明显低于假手术组,MPO 和 MDA 水平明显高于假手术组(P 0.05),以上结果说明大鼠发生 ALI 后,肺部氧化应激水平增加;与模型组相比,苦蒿素高剂量组大鼠和地塞米松组大鼠SOD 和 CAT 水平明显上升,MPO 和 MDA 水平明显下降,随着苦蒿素剂量增加,上述指标变化更为明显(P 0.05)(表 3)。144医学分子生物学杂志,2023,20(5):439-443 J Med Mol Biol,2023,20(5):439-443表 3 苦蒿素对 ALI 新生大鼠 BALF 中氧化应激指标影响分组剂量(mg/kg)SOD(U/L)MDA(nmol/mL)MPO(U/g)CAT(U/mg)假手术组68.19 10.573.71 0.773.51 0.423.01 0.74模型组48.45 8.185.36 0.838.13 1.471.04 0.22苦蒿素低剂量组12.552.94 7.024.75 1.056.72 1.03#1.30 0.26#苦蒿素中剂量组2560.95 7.78#4.33 0.59#5.51 0.46#1.73 0.31#苦蒿素高剂量组5067.74 9.06#4.04 0.62#4.24 0.60#2.69 0.65#地塞米松组1061.78 10.81#4.16 0.58#4.65 0.53#2.16 0.53#与假手术比较,P0.05;与模型组比较,#P0.052.5 苦蒿素调节 ALI 新生大鼠肺组织 NF-B 信号通路通过 WB 实 验 发 现,模 型 组 大 鼠 肺 组 织HMGB1、TLR4 和 p-NF-B P65/NF-B P65 表达水平明显高于假手术组(P0.05),说明大鼠发生 ALI后,相关信号通路的蛋白表达发生改变;苦蒿素高、中剂量组大鼠和地塞米松组大鼠肺组织 HMGB1、TLR4和 p-NF-B P65/NF-B P65 表达水平明显低于模型组(P0.05),随着苦蒿素剂量增加,其作用更明显,说明苦蒿素可以抑制该信号通路可以下调相关蛋白表达,且浓度越高,抑制作用更明显(图2)。1:假手术组;2:模型组;3:苦蒿素低剂量组;4:苦蒿素中剂量组;5:苦蒿素高剂量;6:地塞米松组。与假手术组比较,P0.05;与模型组比较,#P0.05图 2 各组 ALI 新生大鼠肺组织 HMGB1/NF-B 信号通路蛋白表达水平3 讨论ALI 是多原因引起的肺部弥漫性损害临床综合征,与体内异常的炎症水平和过度氧化应激有关,本研究主要探究了苦蒿素对 ALI 的作用效果以及发挥效应可能参与的生理过程11-14。HE 染色结果说明中、高剂量苦蒿素对 ALI 大鼠肺组织损伤具有一定治疗效果,对比未经苦蒿素干预的大鼠,高剂量苦蒿素干预的大鼠肺组织炎性细胞浸润的情况得以改善,说明一定浓度的苦蒿素能够发挥一定抗炎作用。本研究中,苦蒿素高剂量组大鼠 PaO2水平明显高于模型组,W/D 和肺损伤评分明显低于模型组,并且随着苦蒿素剂量增加,效果更明显。说明高剂量苦蒿素可以改善大鼠肺水肿情况,PaO2水平升高提示肺毛细血管摄氧状况好转,肺外呼吸状况得以改善。研究表明,肺组织损伤后肺水含量增加,其 W/D 值较正常肺组织明显升高,肺泡-毛细血管膜通透性增大,体液和蛋白通过血管腔进入间质间隙,引发肺水肿13-14。苦蒿素干预后,W/D 值下降说明中、高剂量苦蒿素可以减轻肺组织水肿,其效果具有浓度依赖性。本研究结果显示,苦蒿素高剂量组和地塞米松组大鼠 BALF 中 IL-1、IL-6 和 TNF-水平明显低于模型组,苦蒿素剂量增加,效果更明显,当达到一定浓度后,其效果与地塞米松作用相似。普遍研究认为,TNF-是介导 ALI 的主要细胞因子,是 ALI 发生期间最早释放的炎性因子之一,抑制其生成可以减轻肺血管内皮细胞损伤15-17;TNF-和 IL-1 可以介导中性粒细胞活化,活化的中性粒细胞黏附于血管内皮细胞并在炎性反应部位聚集,使肺泡上皮细胞和肺血管内皮细胞间隙增大,大量血管内容物渗出,造成肺损伤;IL-6 能够通过激活淋巴细胞介导免疫反应,同时其刺激造血干细胞生长和增加急性期蛋白合成的特性使之在 ALI 中占有重要地位。IL-6水平下降表示苦蒿素能够抑制炎性因子释放,改善血管通透性,抑制渗出。已知地塞米松是一种具有强大抗炎作用的糖皮质激素,将其作为抗炎效应的参照物可以对苦蒿素的抗炎能力进行对照,本研究244杨亚龙,等.苦蒿素改善新生大鼠急性肺损伤的作用机制结果中两者对炎性因子的调控效果无明显差异,一定程度上说明苦蒿素具备强大的抗炎能力,能够通过抑制炎症水平,一定程度上改善大鼠肺损伤情况。SOD 平衡机体氧化与抗氧化;MPO 破坏多种靶物质,产生炎性反应;CAT 清除氧自由基,通过降解过氧化氢为无毒的 H2O 和 O2以降低自由基对肺组织的损伤;MDA 是具有细胞毒性的氧化终产物,其水平与细胞受损程度相关18-19。ELISA 检测结果显示,苦蒿素高、中剂量组大鼠和地塞米松组大鼠SOD 和 CAT 水平明显高于模型组,MPO 和 MDA 水平明显低于模型组,说明中、高剂量苦蒿素具有强大的抗氧化作用,苦蒿素可能通过减轻大鼠肺组织中氧化应激水平,降低自由基对肺组织的损伤,改善大鼠 ALI 症状。蛋白质印迹检测结果显示,苦蒿素高、中剂量组大鼠和地塞米松组大鼠肺组织 HMGB1、TLR4 和 p-NF-B P65/NF-B P65 表达水平明显低于模型组。NF-B 普遍存在于胞浆,其激活是肺部炎症疾病的重要特征之一,NF-B P65 是 NF-B 的亚基组成形式,HMGB1 作为促炎因子可以结合TLR4 等细胞受体,通过激活受体以激活 NF-B,释放大量 IL-1、IL-6 和 TNF-等炎性因子,诱导肺组织细胞凋亡20。因此,抑制该信号通路可以下调相关蛋白表达,从而抑制相关炎性因子释放,发挥抗炎作用。综上所述,苦蒿素可以通过提高抗炎抗氧化能力以及抑制 HMGB1/NF-B 信号通路来减轻由 LPS诱导的 ALI,但本研究仅初步探讨了苦蒿素对抗治疗 ALI 的可能作用机制。虽然其对 ALI 的治疗效果具有浓度依赖,但最佳治疗剂量还有待进一步的研究证明。参考文献1 刘兰瑞,孙进华,李梅,等.乌司他丁联合支气管镜肺泡灌洗防治大面积烧伤合并呼吸道损伤患者肺部感染的效果及对氧化应激、炎性反应的影响J.临床误诊误治,2020,33(3):57-62.2 凌林,佟晶,曾良.芍药苷通过激活 Nrf2/Keap1 信号通路改善脓毒症急性肺损伤的研究J.四川大学学报(医学版),2020,51(5):664-669.3 BLAGEV D P,HARRIS D,DUNN A C,et al.Clinical pr-esentation,treatment,and short-term outcomes of lung in-jury associated with e-cigarettes or vaping:a prospectiveobservationalcohortstudy J.Lancet,2019,394(10214):2073-2083.4 王寅生,聂亮,方亮等.金龙胆草提取液体外抑菌活性分析J.基因组学与应用生物学,2019,38(5):2200-2206.5 肖义蓉,王寅生,李南臻,等.金龙胆草产苦蒿素内生真菌的筛选鉴定J.基因组学与应用生物学,2020,39(9):133-138.6 VILLAR J,FERRANDO C,MARTNEZ D,et al.Dexam-ethasone in ARDS network.Dexamethasone treatment forthe acute respiratory distress syndrome:a multicentre,ran-domised controlled trialJ.Lancet Respir Med,2020,8(3):267-276.7 黄宇,林传涛,王玉苹,等.盐酸戊乙奎醚对幼鼠高氧急性肺损伤的影响及其与内质网应激途径细胞凋亡的关系J.中华麻醉学杂志,2019,39(5):625-628.8 王婷,童荣生,邹静,等.HPLC-MS/MS 法测定大鼠血浆中苦蒿素质量浓度及药动学研究J.中国新药杂志,2019,28(24):3024-3029.9 李学勤,郝长锁,付迎新.穿心莲内酯对 LPS 吸入性肺炎新生大鼠 NLRP3、ASC 及 caspase-1 表达的影响J.重庆医学,2020,13:2071-2076,2081.10 李晓峰,李英杰,佟凯.丙泊酚联合热毒宁注射液对内毒素所致大鼠急性肺损伤及 ERK1/2-NF-B 通路的影响J.解放军医药杂志,2020,32(5):14-18.11 樊菲菲,谢建刚,赵丹珲等.雾化吸入高渗盐水对脓毒症大鼠肺损伤的影响J.解放军医药杂志,2020,32(11):1-5.12 JU M,LIU B,HE H,et al.microRNA-27a alleviates LPS-inducedacutelunginjuryinmiceviainhibitinginflammation and apoptosis through modulating TLR4/MyD88/NF-B pathwayJ.Cell Cycle,2018,17(16):2001-2018.13 李波,尹国芳,范贤明.粪菌移植对大鼠内毒素性急性肺损伤的作用及其机制研究J.中华微生物学和免疫学杂志,2019,39(11):812-820.14 吴俊学,李毓灵,陈路.IL-6,肿瘤坏死因子 及 CRP对下肢创伤患者合并感染的预测价值分析J.分子诊断与治疗杂志,2020,1273(9):43-46.15 郭璇,宋瑶,阿布来提阿不都哈尔.肺炎支原体感染合并川崎病患儿血清 IL-6,IL-8 及 IL-10 水平与冠状动脉损伤的相关性J.分子诊断与治疗杂志,2020,12(8):91-94,116.16 钱薇,熊昊.罗氟司特对慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者炎症及氧化应激反应的影响J.空军医学杂志,2021,37(1):63-66.17 刘兰瑞,孙进华,李梅,等.乌司他丁联合支气管镜肺泡灌洗防治大面积烧伤合并呼吸道损伤患者肺部感染的效果及对氧化应激,炎性反应的影响J.临床误诊误治,2020,33(3):63-68.18 GE X,MENG X,FEI D,et al.Lycorine attenuates lipopo-lysaccharide-inducedacutelunginjurythroughtheHMGB1/TLRs/NF-B pathwayJ.3 Biotech,2020,10(8):369.19 WANG Z Z,CHEN S C,ZOU X B,et al.Nesfatin-1 allevi-ates acute lung injury through reducing inflammation andoxidative stress via the regulation of HMGB1J.Eur RevMed Pharmacol Sci,2020,24(9):5071-5081.20 欧利,秦克,杨子宵,等.双氢青蒿素对甲型流感病毒H1 N1 诱导人支气管上皮细胞 TNF-和 IL-6 表达的影响及机制研究J.四川大学学报(医学版),2020,51(2):171-177.(2023-03-02 收稿)344医学分子生物学杂志,2023,20(5):439-443 J Med Mol Biol,2023,20(5):439-443