离子型磁性COFs负载GOx实现纳米酶与天然酶的级联反应.pdf

第5 4卷 第4期2 0 2 3年7月 太原理工大学学报J OUR NA L O F TA I YUAN UN I V E R S I T Y O F T E CHNO L OG Y V o l.5 4 N o.4 J u l.2 0 2 3 引文格式:张衡,杨帆,任瑞鹏,等.离子型磁性C O F s负载G O x实现纳米酶与天然酶的级联反应J.太原理工大学学报,2 0 2 3,5 4(4):6 1 9-6 2 9.Z HAN G H e n g,YAN F a n,R E N R u i p e n g,e t a l.I o n i c m a g n e t i c C O F s l o a d e d w i t h G O x f o r c a s c a d e r e a c t i o n o f n a n o e n z y m e s a n d n a t u r a l e n z y m e sJ.J o u r n a l o f T a i y u a n U n i v e r s i t y o f T e c h n o l o g y,2 0 2 3,5 4(4):6 1 9-6 2 9.收稿日期:2 0 2 2-0 4-1 9;修回日期:2 0 2 2-0 5-1 3 基金项目:国家自然科学基金资助项目(2 1 7 7 6 1 9 6,5 1 7 7 8 3 9 7);山西省应用基础研究计划(2 0 2 1 0 3 0 2 1 2 4 4 3 1)第一作者:张衡(1 9 9 5-),硕士生,(E-m a i l)z h a n g h e n g 2 0 1 9q q.c o m 通信作者:吕永康(1 9 6 1-),教授,主要从事煤化工、能源化工和废水处理的研究,(E-m a i l)l y k a n g t y u t.e d u.c n离子型磁性C O F s负载G O x实现纳米酶与天然酶的级联反应张 衡,杨 帆,任瑞鹏,吕永康(太原理工大学 省部共建煤基能源清洁高效利用国家重点实验室,太原 0 3 0 0 2 4)摘 要:【目的】一锅反应中将天然酶的高选择性与纳米酶的高稳定性相结合,已成为一种提高生物催化级联多样性/复杂性和多酶系统稳定性的理想解决方案。【方法】设计合成了一种离子型磁性F e3O4E B-C O F s材料,在静电作用诱导下制备了葡萄糖氧化酶(GO x)-磁性共价有机框架材料(GO x/F e3O4E B-C O F s)。【结果】F e3O4E B-C O F s扮演了纳米酶与载体材料的角色,且所得复合材料可用于葡萄糖浓度的比色测定。酸性条件下,GO x/F e3O4E B-C O F s展现出极好的催化葡萄糖氧化与2,2 -联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(A B T S)氧化的级联反应。动力学研究表明,反应遵循L i n e w e a v e r-B u r k方程,说明构建纳米酶与天然酶的级联反应时仍呈现了生物催化的特点。在磁性F e3O4的加持下,GO x/F e3O4E B-C O F s表现出良好的可回收性。【结论】构建纳米酶与天然酶的多酶催化系统对于实现仿生催化具有重要意义。关键词:共价有机框架;F e3O4;葡萄糖氧化酶;静电作用;级联反应中图分类号:Q 8 1 4.2 文献标识码:AD O I:1 0.1 6 3 5 5/j.c n k i.i s s n 1 0 0 7-9 4 3 2 t y u t.2 0 2 3.0 4.0 0 5 文章编号:1 0 0 7-9 4 3 2(2 0 2 3)0 4-0 6 1 9-1 1I o n i c M a g n e t i c C O F s L o a d e d w i t h G O x f o r C a s c a d e R e a c t i o n o f N a n o e n z y m e s a n d N a t u r a l E n z y m e sZ H A N G H e n g,Y A N G F a n,R E N R u i p e n g,L Y U Y o n g k a n g(S t a t e K e y L a b o r a t o r y o f C l e a n a n d E f f i c i e n t C o a l U t i l i z a t i o n,T a i y u a n U n i v e r s i t y o f T e c h n o l o g y,T a i y u a n 0 3 0 0 2 4,C h i n a)A b s t r a c t:【P u r p o s e s】C o m b i n i n g t h e h i g h s e l e c t i v i t y o f n a t u r a l e n z y m e s w i t h t h e h i g h s t a b i l i-t y o f n a n o e n z y m e s i n a o n e-p o t r e a c t i o n h a s e m e r g e d a s a n i d e a l s o l u t i o n t o i m p r o v i n g t h e d i v e r s i-t y/c o m p l e x i t y o f b i o c a t a l y t i c c a s c a d e s a n d t h e s t a b i l i t y o f m u l t i-e n z y m e s y s t e m s.【M e t h o d s】I n t h i s p a p e r,w e d e s i g n e d a n d s y n t h e s i z e d a n i o n i c m a g n e t i c F e3O4E B-C O F s m a t e r i a l t o p r e p a r e g l u c o s e o x i d a s e(GO x)-m a g n e t i c c o v a l e n t o r g a n i c f r a m e w o r k m a t e r i a l(GO x/F e3O4E B-C O F s)t h r o u g h e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n i n d u c t i o n.【F i n d i n g s】F e3O4E B-C O F s p l a y e d t h e r o l e o f n a n o-p a r t i c l e e n z y m e a n d c a r r i e r m a t e r i a l,a n d t h e o b t a i n e d c o m p o s i t e c o u l d b e u s e d f o r g l u c o s e c o n-c e n t r a t i o n f o r c o l o r i m e t r i c d e t e r m i n a t i o n.U n d e r a c i d i c c o n d i t i o n s,GO x/F e3O4E B-C O F s e x-h i b i t e d a g o o d c a s c a d e o f c a t a l y t i c g l u c o s e o x i d a t i o n a n d 2,2 -b i a z o-b i s-3-e t h y l b e n z o t h i a z o l i n e-6-s u l f o n i c a c i d o x i d a t i o n.T h e k i n e t i c s t u d y s h o w e d t h a t t h e r e a c t i o n f o l l o w e d t h e L i n e w e a v e r-B u r k e q u a t i o n,i n d i c a t i n g t h a t t h e c a s c a d e r e a c t i o n o f t h e c o n s t r u c t e d n a n o e n z y m e w i t h n a t u r a l e n z y m e s t i l l e x h i b i t e d b i o c a t a l y t i c c h a r a c t e r i s t i c s.GO x/F e3O4E B-C O F s e x h i b i t e d g o o d r e c o v e r a b i l i t y w i t h t h e a d d i t i o n o f m a g n e t i c F e3O4.【C o n c l u s i o n s】T h e r e f o r e,t h e c o n s t r u c t i o n o f a m u l t i-e n-z y m e c a t a l y t i c s y s t e m o f n a n o e n z y m e s a n d n a t u r a l e n z y m e s i s i m p o r t a n t f o r t h e r e a l i z a t i o n o f b i o-m i m e t i c c a t a l y s i s.K e y w o r d s:c o v a l e n t o r g a n i c f r a m e w o r k s;F e3O4;g l u c o s e o x i d a s e;e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n;c a s c a d e r e a c t i o n 多酶催化级联反应是一种连续实现酶催化反应和生物转化的一锅级联过程,因反应途中避免了反应中间体的分离与纯化,从而降低了工艺成本1-3。除此之外,酶分子间距离很近,中间产物无需费力就可与下个目标酶的活性位点接触实现反应的快速转化,以获得更高的产量,提高原子经济性4-5。酶促反应条件一般较为温和,能够在常温常压下实现,具有高效性与专一性等优势6-7。然而,酶自身的脆弱性与操作不稳定性严重限制了其在多酶催化系统中的广泛应用。纳米酶因其成本低、比表面积大、在极端条件下具有良好的稳定性而被视为天然酶的替代品8-9。然而,纳米酶的中等活性和有限的选择性阻碍了它们的应用。因此,将天然酶的高选择性与纳米酶的高稳定性相结合,以提高生物催化级联的多样性/复杂性和多酶系统的稳定性,已成为一种理想的解决方案1 0-1 1。目前,多种纳米材料已被发现具有独特的模拟酶催 化 活 性,如 碳 基 纳 米 粒 子1 2、金 属 纳 米 粒子1 3-1 4和金属氧化物纳米粒子1 5-1 7等。其中F e3O4纳米颗粒因其超顺磁性与类过氧化物酶活性而备受关注,被广泛用于药物输送1 8、医学诊断1 9和催化1 5,2 0等领域。然而,F e3O4纳米颗粒对氧化条件的高度敏感性,极大地限制了应用范围1 0。F e3O4纳米颗粒外包覆稳定的壳层材料,或许是一种有效的策略。金属 有 机 框 架2 1-2 3(MO F s)和 共 价 有 机 框架2 4-2 5(C O F s)因高的比表面积、可调的孔隙以及良好的热稳定性等优良特征,已经成为近些年来固定化酶领域炙手可热的载体材料。然而,部分MO F s长期在水中表现出不稳定性和易分解的现象,产生金属离子的浸出,对酶的催化活性造成不利影响。作为MO F s的姊妹材料,C O F s不含有毒金属离子,且长期的水/化学稳定性使其备受青睐2 6。由于F e3O4仅在酸性条件下具备良好催化性能,因此,我们选择化学稳定性更好的C O F s作为F e3O4的壳层,一方面C O F s外壳的高热/化学/机械稳定性可改善F e3O4的稳定性,另一方面C O F s可调的孔径与高孔隙率能够促进酶的固定与底物传质。同时,C O F s中引入F e3O4也为解决C O F s在溶液中分散不均匀和难以回收等难题提供了一个理想方案2 6。本文中,设计合成了一种核壳结构的离子型F e3O4E B-C O F s磁性纳米材料,借助材料表面的正电荷,无需考虑物理吸附时材料孔径与酶尺寸匹配要求,以静电诱导的方式便可将葡萄糖氧化酶(GO x)固定于纳米材料上,实现了纳米酶与天然酶的多酶催化级联反应。其中,F e3O4E B-C O F s担任纳米酶与载体材料的角色,与GO x结合后,生物复合材料表现出优异的催化活性、出色的稳定性与良好的重复使用性,并且实现了葡萄糖的一锅法比色测定,表明其在体外或体内研究中的潜在应用。1 实验部分1.1 实验试剂所有化学品和试剂均从商业来源购买,使用时没有进一步净化。六水合氯化铁(F e C l36 H2O)、溴化 乙 锭(E B)、2,4,6-三 羟 基-1,3,5-苯 三 甲 醛(T p)、葡萄糖氧化酶(GO x)、2,2 -联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(A B T S)、葡萄糖、异硫氰酸荧光素购自中国上海阿拉丁化学有限公司。B r a d f o r d蛋白浓度测定试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司。所 有 溶 液 均 采 用 超 纯 水(比 电 阻 率1 8 M/c m)配制。1.2 实验仪器X射线衍射仪(X R D)测试是在B r u k e r D 8 A d-v a n c e衍射仪上进行的,该衍射仪采用C u-K 辐射,工作电压为4 0 k V,电流为4 0 mA.分为两段扫描,2 1 0 时扫描速率为1()/m i n,1 0 8 0 扫描速率为4()/m i n.Q u a n t a c h r o m e A u t o s o r b I Q2分析仪进行了N2吸附测试,固定化酶前样品预处理温度为1 2 0,持续1 2 h.为了避免高温引起的酶变性构026太 原 理 工 大 学 学 报 第5 4卷 象的改变,固定化酶后的样品脱气温度由1 2 0 降低到3 0,持续1 2 h.在H i t a c h i S 4 8 0 0扫描电子显微镜上进行了1 5 k V加速电压下的扫描电子显微镜测量。扫描前,试样表面喷金,以增强试样的导电性。Z e t a电 位 测 试 是 在M a l v e r n Z e t a s i z e r N a n o Z S 9 0电位仪进行的,将1 m g样品分散于1 m L去离子水中,超声3 m i n,用N a OH或者HC l将溶液p H值调至7,测量材料的Z e t a电位,三次测试结果取平均值。1.3 F e3O4E B-C O F s的合成F e3O4的 合 成:将 六 水 合 氯 化 铁(F e C l36 H2O,2.0 2 5 g)溶于5 0 m L乙二醇,不断搅拌完全溶解后,再加入二水合柠檬酸钠(N a3C i t22 H2O),继续搅拌,然后缓慢加入乙酸钠(CH3C OON a),剧烈搅拌3 0 m i n,最后转移到1 0 0 m L的聚四氟乙烯内衬反应釜中,在2 0 0 烘箱中反应1 2 h.待反应釜冷却至室温后,将其中固液混合物倒出,黑色产物反复用水和乙醇洗涤,用磁铁回收,最后在6 0 真空烘箱中干燥6 h,即可得到产物。F e3O4E B-C O F s合成:将F e3O4(6 9.5 m g,0.3 mm o l)加入到装有1.5 m L 1,4-二氧六环与1.5 m L均三苯混合溶液的P y r e x管,超声5 m i n,加入溴化乙锭(E B,1 7 7.3 m g,0.4 5 mm o l),超声5 m i n,继续加入2,4,6-三羟基-1,3,5-苯三甲醛(T P,6 3 m g,0.3 mm o l),超声1 0 m i n,加入0.5 m L 3 m o l/L乙酸水溶液中,然后将P y r e x管放入液氮中经冷冻-抽真空-解冻循环脱气三次,除去管中的空气。最后将管密封在1 2 0 烘箱中反应7 2 h.反应完成后,将P y r e x管自然冷却至室温,所得产物用四氢呋 喃(TH F)洗涤3次,使用磁铁帮助回收产物,再经2 0 0 m L甲醇TH F(体积比11)混合液索氏提取1 2 h,最后在1 0 0 真空干燥1 2 h得到红色粉末。1.4 GO x/F e3O4E B-C O F s的制备及固定化最优条件的探索 将5 m g F e3O4E B-C O F s超声悬浮在5 m L磷酸缓冲液(5 0 mm o l/L,p H=7.0),然后加入5 m L GO x溶液(2.5 m g/m L),放置于2 0 0 r/m i n摇床中混合2 h保证吸附饱和。通过外加磁铁获得固定化酶材料,然后分散至2 m L水在混匀仪中震荡3 0 s洗掉吸附松散的酶,再磁回收材料,重复上述洗涤过程3次,收集滤液,然后用紫外-可见分光光度计,通过B r a d f o r d法测定溶液中酶的浓度。平衡吸附量qe(m g/m g):qe=(0-e)Vm.式中:0与e分别为固定化前后酶溶液的质量浓度,V为酶溶液的体积,m为C O F s的质量。通过逐步改变固定化过程中的影响酶负载的因素,如溶液p H(58),葡萄糖氧化酶(GO x)的质量浓度(0.55 m g/m L)与固定化时间(03 h),得出F e3O4E B-C O F s固定化GO x的最优条件。1.5 GO x/F e3O4与GO x/F e3O4E B-C O F s级联活性测试及最优催化条件探索 GO x/F e3O4E B-C O F s活 性 测 试:将1 m g GO x/F e3O4E B-C O F s加入到1 m L乙酸-乙酸钠缓冲溶液(5 0 mm o l/L,p H=3.5)混匀后,取0.1 m L加 至1 m L葡 萄 糖 溶 液(5 0 mm o l/L,p H=3.5)、1 m L 2,2 -联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸溶液(A B T S,2 mm o l/L,p H=3.5)与0.9 m L乙酸-乙酸钠缓冲溶液中,5 5 孵育3 0 m i n,然后用磁铁在外部回收生物复合材料,采用紫外分光光度计在4 1 5 n m处测试所得溶液的吸光度值。A B T S摩尔消光系数为4 1 5=3 6 0 0 0 Lm o l-1c m-1,酶活单位(U)定义为每分钟催化生成1 m o l A B T S+的酶的量。级联反应的催化活性以三次重复测量结果的平均值计算。GO x/F e3O4活性测试:将上述GO x/F e3O4E B-C O F s换做等量的F e3O4与GO x,然后按照上述方法测试级联反应活性。通过 改 变 上 述 反 应 葡 萄 糖 浓 度(11 0 0 mm o l/L)、温度(3 58 5)、p H值(39)得出GO x/F e3O4E B-C O F s的最优级联反应条件。1.6 GO x/F e3O4E B-C O F s动力学参数的测定通过在最优工艺下改变级联反应中A B T S浓度(0.42 mm o l/L),测试GO x/F e3O4E B-C O F s的反应活性,得出各A B T S浓度(c)下反应初始速率(v),绘制出1/c与1/v的双倒数图,然后通过L i n e w e a v e r-B u r k方程计算出反应的Km与Vm a x:1v=Kmvm a x 1c+1vm a x.式中:c为A B T S浓度,mm o l/L;v为初始反应速率,mm o l/(Lm i n);Km为米氏常数,mm o l/L,反映了酶与底物的亲和力大小,vm a x为最大反应速率。1.7 GO x/F e3O4E B-C O F s稳定性测试首次测试GO x/F e3O4E B-C O F s级联反应催化活性后,通过外加磁场实现材料的回收,经乙酸-乙酸钠缓冲溶液(5 0 mm o l/L,p H=3.5)洗涤一次126 第4期 张 衡,等:离子型磁性C O F s负载G O x实现纳米酶与天然酶的级联反应后,继续用于下次循环。首次循环中,GO x/F e3O4E B-C O F s的催化活性被认为是1 0 0%.1.8 葡萄糖比色测定1 m g GO x/F e3O4E B-C O F s加 入到含有1 m L不 同 浓 度 的 葡 萄 糖 溶 液(5 0 mm o l/L,p H=3.5)、1 m L A B T S溶液(2 mm o l/L,p H=3.5)与1 m L乙酸-乙酸钠缓冲溶液(5 0 mm o l/L,p H=3.5)的1 0 m L离心管中,然后在5 5 孵育3 0 m i n,外加磁铁回收GO x/F e3O4E B-C O F s,使用紫外分光光度计测定所得溶液在4 1 5 n m处的吸光度值,绘制出葡萄糖浓度与吸光度值曲线,得出GO x/F e3O4E B-C O F s对葡萄糖的检测范围与最低检测限。为测试GO x对底物的专一性,进行了一组对照实验,使用5 mm o l/L麦芽糖、5 mm o l/L半乳糖、5 mm o l/L蔗糖和5 mm o l/L果糖代替葡萄糖,在相同的反应条件下观察溶液的吸光度值变化。2 结果与讨论2.1 F e3O4 E B-C O F s与GO x/F e3O4 E B-C O F s的制备与结构表征 GO x/F e3O4E B-C O F s的制备流程如图1所示。首先,通 过 水 热 法 合 成 了 柠 檬 酸 盐 稳 定 的F e3O4纳米颗粒,颗粒表面带有丰富的羧酸盐基团使其表面带有少量负电荷,促进了其溶液中的分散稳定性,这使得阳离子型C O F s(E B-C O F s)在其外表面生长成为了可能。其次,在均三甲苯/1,4-二氧六环溶液中,F e3O4(0.3 mm o l)作为磁芯,溴化乙锭(E B,0.4 5 mm o l)和2,4,6-三羟基-1,3,5-苯三甲醛(T P,0.3 mm o l)作为构建单体,热力学可逆聚合后便在F e3O4外形成E B-C O F s外壳,得到F e3O4Dloxane/Mesltylene120?72?hOHCHOCHOOHOHCHONH2NH2N+Br-+Fe3O4EB-COFsGOXFe3O4EB-COFsStirringGOX/Fe3O4EB-COFs图1 GO x/F e3O4E B-C O F s的制备示意图F i g.1 P r e p a r a t i o n s c h e m a t i c d i a g r a m o f GO x/F e3O4E B-C O F sE B-C O F s.索氏提取、干燥后称取适量的F e3O4E B-C O F s浸入葡萄糖氧化酶(GO x,6.0 n m5.2 n m7.7 n m,P I=4.2)溶液中,在2 5 2 0 0 r/m i n的摇床中孵育2 h,用磁铁回收后即可得到GO x/F e3O4E B-C O F s,超纯水洗涤3次后,通过B r a d-f o r d法测得GO x的固定化量为4 5 g/m g.为证实E B-C O F s的包覆与GO x的固定化,首先对复合材料进行了Z e t a电位测试,如图2所示。GO x的Z e t a电位为-7.4 5 mV,F e3O4的Z e t a电位为-2.0 9 mV,这可能是由于表面含有羧基。然而F e3O4E B-C O F s的Z e t a电位为3 2.4 mV,证实 了E B-C O F s的 成 功 包 覆。固 定 化GO x后,GO x/F e3O4E B-C O F s的Z e t a电 位 降 至1 9.8 mV,归因于葡萄糖氧化酶在材料表面的吸附。结果表明正负电荷产生的静电作用能够促进GO x吸附至F e3O4E B-C O F s的表面。Fe3O4Fe3O4EB-COFsGOX?/Fe3O4EB-COFsGOX?3020100-10Zeta?potential?/?mV图2 样品的Z e t a电位图F i g.2 Z e t a p o t e n t i a l p l o t s o f s a m p l e s通过扫描电子显微镜(S EM)和透射电子显微镜(T EM)对F e3O4、F e3O4E B-C O F s与GO x/F e3O4E B-C O F s的形貌与尺寸进行分析。S EM图像观察到,F e3O4(图3(a)为分散均匀的、表面粗糙的纳米颗粒,尺寸为1 0 01 5 0 n m,包裹C O F s外层后F e3O4E B-C O F s的形貌(图3(b)并未发生226太 原 理 工 大 学 学 报 第5 4卷 很大变化,尺寸增大到1 2 01 7 0 n m.固定化脂肪酶后GO x/F e3O4E B-C O F s(图3(c)的表面形貌未发生明 显 变 化。T EM图 像 显 示 出,F e3O4E B-C O F s(图3(e)为核壳结构,其中F e3O4(图3(d)核心约为1 5 0 n m,C O F s壳层厚度约为2 0 n m,固定化GO x后(图3(f),尺寸略微增大5 n m左右,可能归因于GO x吸附在C O F s表面而不是进入孔道。300?nm300?nm300?nm50?nm50?nm50?nm（a）（b）（c）（f）（e）（d）(a)F e3O4,(b)F e3O4E B-C O F s,(c)GO x/F e3O4E B-C O F s的S EM图,(d)F e3O4,(e)F e3O4E B-C O F s,(f)GO x/F e3O4E B-C O F s的T EM图图3 不同样品的电镜图F i g.3 S EM a n d T EM i m a g e s o f s a m p l e s 为 证 实 所 合 成 的 复 合 材 料 为F e3O4E B-C O F s,采用了傅里叶变换红外光谱(F T-I R)分析了复合材 料的官能团 结 构。如 图4所 示,E B在3 1 8 5 c m-1和3 3 0 9 c m-1处的特征吸收峰归因于NH的伸缩振动,1 6 4 3 c m-1和2 8 8 9 c m-1处的谱带分别归属于T P的CO和CH的伸缩振动,5 8 7 c m-1的谱带属于特征F eOF e伸缩,位于1 3 9 6 c m-1和1 6 4 5 c m-1的吸收峰归因于 F e3O4表面的羧基的羰基拉伸,证明了羧基的存在。与F e3O4的光谱相比,F e3O4E B-C O F s的光谱中也观察到相似的特征谱带。此外,还发现了在1 5 9 3 c m-1处存在的CC伸缩的强吸收峰以及Fe3O4EB-COFsFe3O4EBTPTransmittance?/?%3?0003?5002?0002?5001?0001?500500Wavenumber?/?cm-1图4 E B、T P、F e3O4与F e3O4E B-C O F s F I T R谱图F i g.4 F I T R s p e c t r a o f F e3O4,T P,F e3O4,a n d F e3O4E B-C O F s羟基(OH)和亚胺键(CN)拉伸的缺失,证实了酮式E B-C O F s的存在。结果表明,E B-C O F s壳层通过席夫碱缩合反应成功覆盖在F e3O4外表面。X射线衍射仪(X R D)进一步分析确定了F e3O4E B-C O F s纳米颗粒的晶体结构。如图5所示,F e3O4E B-C O F s的X R D图像在3 0.2 8、3 5.4 6、4 3.4 0、5 3.2 8、5 7.1 4 和6 2.7 6 处显示出6个2衍射峰,分别对应于F e3O4的(2 2 0)、(3 1 1)、(4 0 0)、(4 2 2)、(5 1 1)和(4 4 0)晶面,这与磁铁矿的P D F卡片(8 8-0 8 6 6)一致,表明F e3O4结晶良好,即使在包Intensity201040306050802/?（）703456789 102/?（）IntensityFe3O4Fe3O4EB-COFsGOX?/Fe3O4EB-COFs图5 F e3O4、F e3O4E B-C O F s与GO x/F e3O4E B-C O F s的X R D图F i g.5 X R D p a t t e r n s o f F e3O4,F e3O4E B-C O F s,a n d GO x/F e3O4E B-C O F s326 第4期 张 衡,等:离子型磁性C O F s负载G O x实现纳米酶与天然酶的级联反应覆E B-C O F s壳层后也具有高结晶度。对于C O F s,特征峰出现在2的3.6 与2 7 左右,归因于原始六方晶格的(1 0 0)与(0 0 1)晶面,证实了E B-C O F s晶体的形成。此外,在固定化GO x后,F e3O4E B-C O F s晶体结构未发生明显变化,表现出较好的结晶度。为了解复合材料的热稳定性与C O F s壳层占比,对F e3O4与F e3O4E B-C O F s进行了热重测试(图6).与纯F e3O4相比,F e3O4E B-C O F s在3 0 0 以上的重量损失几乎为6 0%,可能是C O F s壳层开始瓦解,这意味着壳层的C O F s占比很高。同时,F e3O4E B-C O F s在3 0 0 以下的长程平台也表现出良好的稳定性。Weight?remain?/?%100Temperature?/?Fe3O4Fe3O4EB-COFs20030040050060070080090010080604020图6 F e3O4与F e3O4E B-C O F s的热重曲线F i g.6 T h e r m o g r a v i m e t r i c c u r v e s o f F e3O4 a n d F e3O4E B-C O F s随后,使用振动样品磁强计(V S M)对纳米颗粒的磁性进行了表征。磁滞曲线(图7)显示出F e3O4与F e3O4E B-C O F s饱和磁化强度值分别为6 7.5 2 e m u/g和3 1.2 0 e m u/g.说明包裹C O F s壳层后,复合材料仍具有超顺磁性,可对外部磁场实现快速响应。固定化GO x后,GO x/F e3O4E B-C O F s的饱和磁化强度值降至1 6.2 8 e m u/g.尽管如此,在外部Magnetization?/?（emu g-1）-20Magnetic?field?/?kOeFe3O4Fe3O4EB-COFsGOX?/Fe3O4EB-COFs-1001020806040200-20-40-60-80图7 F e3O4、F e3O4E B-C O F s与GO x/F e3O4E B-C O F s的磁滞饱和曲线F i g.7 M a g n e t i c h y s t e r e s i s s a t u r a t i o n c u r v e s o f F e3O4,F e3O4E B-C O F s,a n d GO x/F e3O4E B-C O F s磁铁的帮助下,仍观察到生物复合材料从悬浮液的快速聚集(1 m i n),有效避免了离心回收材料导致的损失与离心过程中酶泄漏问题,表明磁性C O F s可作为固定化酶的理想载体。通过7 7 K下的N2吸附测试进 一步评价了F e3O4C O F s固定化GO x前后比表面积(B E T)与孔隙结构的变化。由N2吸附-脱附等温线(图8(a)可 得 到,F e3O4比 表 面 积 为2 5 m2/g,包 覆C O F s壳层后迅速增大至4 7 0 m2/g.另外,F e3O4E B-C O F s为典型的I型曲线,表明该材料的微孔特性。固定GO x后,F e3O4E B-C O F s的比表面积从4 7 0 m2/g减 少 到3 8 7 m2/g.使 用D F T方 法 对F e3O4E B-C O F s和GO x/F e3O4E B-C O F s的孔径分布(图8(b)分析表明,两种样品的孔径都集中在约1.6 8 n m,孔体积从0.3 4 0 c m3/g下降到0.3 0 3 c m3/g,固定化GO x后,F e3O4E B-C O F s的主体孔隙仅略微减小,可能归因于测试中低预处理温度未能将材料中的水完全干燥。结果证实了GO x是吸附在复合材料表面,这将有利于产物与底物在孔隙中传质。N2?uptake?/?（cm3 g-1）0p/?p0Fe3O4Fe3O4EB-COFsGOX?/Fe3O4EB-COFs0.23002502001501005000.40.60.81.0（a）N2吸脱附等温线501015202530Pore?size?/?nm0.30.20.10Pore?volume?/?（cm3 g-1）Fe3O4EB-COFsGOX?/Fe3O4EB-COFs（b）孔径分布图8 样品的孔结构表征F i g.8 P o r e s t r u c t u r e o f s a m p l e s为了进一步观察葡萄糖氧化酶(GO x)在载体上的分布,荧光素标记酶是证明其存在并确定其分426太 原 理 工 大 学 学 报 第5 4卷 布的一种光学方法,荧光探针荧光素异硫氰酸酯(f l u o r e s c e i n i s o t h i o c y a n a t e,F I T C)标记酶分子2 6。由于GO x本身不发荧光,首先GO x与F I T C共价官能化,然后吸附于F e3O4E B-C O F s上得到荧光素标记的生物复合材料F I T C-GO x/F e3O4E B-C O F s,用水反复洗涤3次以去除未吸附的酶,选用4 8 8 n m作为激发波长使用C L S M对样品进行成像。C L S M图像(图9)显示出绿色荧光效果,这一结果有力地证实了GO x成功吸附至F e3O4E B-C O F s表面。10?m10?m10?m（a）暗场（b）明场（c）混合场图9 F I T C-GO x/F e3O4E B-C O F s的C L S M图像F i g.9 C L S M i m a g e s o f F I T C-GO x/F e3O4E B-C O F s2.2 GO x/F e3O4E B-C O F s的固定化条件优化物理吸附法固定化酶时,不同的固定化条件会影响酶的负载,因此探究不同负载条件下(如溶液p H、GO x浓度与固定化时间)F e3O4E B-C O F s对GO x的负载量变化情况,以实现F e3O4E B-C O F s负载GO x的固定化条件优化。首先,对固定化时间的影响展开研究(图1 0(a),随着固定化时间的延长,F e3O4E B-C O F s表 面 吸 附 了 越 来 越 多 的GO x,直至时间到达2 h附近后GO x吸附量增长得较为缓慢,可能是此时材料已经吸附饱和,所以将固定化时间选为2 h.溶液p H值的变化会导致酶表面的电荷属性发生变化,从而对酶的固定化产生影响,因此继续考察了不同p H值(58)溶液中GO x的吸附情况(图1 0(b),溶液p H=5与p H=7时GO x的吸附量较高