淋巴结脱细胞支架的构建及效果评价.pdf

宁夏医科大学学报4缘卷近年来，生育期女性恶性肿瘤的发病率逐年升高1，但随着诊疗技术的进步，各种恶性肿瘤的治疗 5 年期存活率也在不断提高。化疗与血管损伤和卵巢皮质纤维化相关2-3，烷基化细胞毒性药物，副反应可导致卵巢早衰（premature ovarianfailure，POF），并伴有提前绝经和不孕。目前癌症患者的生育力保存方法包括胚胎/卵母细胞玻璃化冷冻、卵巢组织移植和卵巢皮质移植4-7，但这些方法仍有一些不良后果8-9。近几年组织工程学的发展推动着再生医学的发展，目前已知组织工程皮肤10、血管11、膀胱12等已经被成功用于临床治疗。但有关人工卵巢的构建鲜有报道，能否通过构建人工卵巢进而保护癌症患者的生育力亟待探究13-14。本研究旨在利用淋巴结代替卵巢作为脱细胞卵巢支架，并运用于组织工程中，验证淋巴结脱细胞支架与卵巢脱细胞支架的相似性，以期为临床中卵巢短缺问题提供研究基础。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物12耀16 周龄的 C57BL/6 小鼠20 只，由宁夏医科大学实验动物中心提供。所有小鼠饲养于 SPF 级动物房 温度（24.0依1.0）益，湿度 55%耀65%，12 h 昼夜循环。1.1.2实验试剂十二烷基硫酸钠（SDS）购于范德（北京）生物科技有限责任公司；羟脯氨酸（HYP）定量试剂盒购于南京建成科技有限公司；基因组DNA 提取试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司；抗荧光淬灭封片剂（含 DAPI）购于百赛生物科技有限公司；Masson 三色染色试剂盒、Al原cian Blue 染色试剂盒均购于北京索莱宝科技有限公司；BX51 正置显微镜购自日本 Olympus 公司；荧光显微镜购自德国 Leica 公司。1.2方法1.2.1脱细胞淋巴结及卵巢支架的制备新鲜的淋巴结（n=20）及卵巢（n=20），置于无菌的容器内，置于 0.5%SDS 溶液中，放入摇床振荡器中搅拌 12 h（120 r min-1），中间换液 1 次，后用 ddH2O清洗至无明显泡沫，加入 PBS 后放入摇床中，持续 24 h，中间换液。再将支架放入无菌的 DNasel（200 U mL-1）中处理 30 min，进一步减少 DNA。收稿日期：2022-12-03基金项目：国家自然科学基金项目（81460230）作者简介：吴梦静（1993），女，在读硕士研究生，研究方向：生育力保持。通信作者：常青，男，教授，硕士研究生导师，从事生育力保持研究。E-mail：淋巴结脱细胞支架的构建及效果评价吴梦静1，2，任贺贺1，2，常青1，2（1.宁夏医科大学基础医学院，银川750004；2.宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室，宁夏生殖与遗传重点实验室，银川750004）摘要：目的对小鼠淋巴结脱细胞和卵巢脱细胞支架进行比较，为人工卵巢的制作提供组织工程材料。方法使用表面活性剂（0.5%SDS）振荡清洗方法脱细胞，再用去离子水（ddH2O）清洗其内残留 SDS，获得脱细胞支架。HE 染色观察脱细胞的形态，DAPI 染色观察细胞的残留情况，Masson 染色观察胶原纤维，阿尔新蓝染色（Alician Blue）观察糖胺聚糖，透射电镜观察支架超微结构，并测定 DNA 和羟脯氨酸含量。结果与新鲜淋巴结及卵巢相比，脱细胞后大体观察组织体积稍缩小，颜色变淡，呈毛玻璃状。HE 染色未见明显细胞残留，可见交织成网的纤维结构。Masson 染色显示淋巴结和卵巢脱细胞支架胶原纤维形态保留完整。Alcian Blue 染色显示卵巢脱细胞支架中蓝色条带较细，淋巴结脱细胞支架中有稍粗不定形基质样结构。DAPI 染色未见明显细胞核。扫描电子显微镜见密集分布的大量纤维以及与纤维相连的较小的片状细胞外基质成分，相互连接成3D 网架结构。DNA 定量分析得出淋巴结及卵巢脱细胞支架仅残留 7.45%及 11.96%（P约0.05），卵巢脱细胞后羟脯氨酸含量减少（P约0.05）。结论脱细胞后淋巴结和卵巢细胞外基质结构具有相似性，具有用于人工卵巢制作的可能性。关键词：细胞外基质；淋巴结脱细胞；人工卵巢中图分类号：R322.8文献标识码：ADOI院10.16050/ki.issn1674-6309.2023.06.004第 45 卷6 期2023 年 6 月宁夏医科大学学报Journal of Ningxia Medical University文章编号：1674-6309（2023）06-560-05论著560窑窑6期再用无菌 ddH2O 浸泡 20 h，后用 PBS 清洗 6 次，每次 5 min。保存时可放入含有抗生素的 PBS中，置于-80 毅C 冰箱中保存。1.2.2脱细胞淋巴结及卵巢支架的鉴定1）大体观察及 HE 染色：观察脱细胞过程中卵巢及淋巴结的颜色及形态变化；正常对照组和脱细胞支架组在 4%多聚甲醛（4 益）中固定 8 h，后入水24 h，下行梯度乙醇中脱水、二甲苯透明，石蜡包埋后切成 5 滋m 厚度切片，脱蜡后行 HE 染色。2）DAPI染色：切片脱蜡后，滴加 10耀20 滋L 的抗荧光淬灭封片剂于组织切片上，盖上盖玻片，让切片充分接触封片剂，荧光显微镜观察组织切片。3）Masson染色：苏木素染色后，用 Masson 复合染色液染色5耀10 min，1%磷钨酸液处理 5 min，不用水洗，直接用苯胺蓝液复染 5 min。4）粤lcian Blue 染色：切片脱蜡后，滴加 Alcian Blue 染色液等待 1530 min，梯度脱水后二甲苯透明，中性树胶封片。1.2.3DNA 含量测定及琼脂糖凝胶核酸电泳利用 DNA 检测试剂盒提取核酸后用 NanoDrop 核酸定量分析仪测定 DNA 浓度并记录，最后将所提 DNA 放置于-20 益冻存。称取 0.25 g 琼脂糖，并加入 25 mL 0.5伊TAE 缓冲液，微波炉加热充分溶解后，室温静置冷却至 60 益左右。向该溶液中加入 2.5 滋L 核酸染料，混匀后倒入制胶盒，插入梳子后拔出上样，在 100 V 电压下电 30 min，凝胶电泳时间结束后用 Bio-Rad 凝胶成像仪观察分析支架残留 DNA 片段长度。1.2.4HYP 含量的测定利用 HYP 检测试剂盒及多功能分光光度计分别测定实验组及对照组HYP 含量。1.2.5扫描电镜观察分别取淋巴结及卵巢脱细胞支架，大小约 8 mm伊8 mm伊 5 mm，置于2.5%戊二醛溶液中固定 24 h。PBS 溶液清洗 3 次，15 min/次，1%锇酸中固定 1 h（室温），PBS 溶液清洗 3 次，15 min/次。利用上行乙醇（70%、80%、90%、100%玉、100%域、乙酸异戊酯各 15 min）进行脱水。将脱细胞支架放至临界点干燥仪内处理；将脱细胞支架放置在导电碳膜双面胶上，并放入离子溅射仪样品台上，进行喷金处理。在电子显微镜下（加速电压 5耀15 kV）下观察并拍照。1.3统计学方法采用 SPSS 22.0 及 GraphPad 8.0 统计学软件进行数据分析，计量资料以均数依标准差（x依s）表示，两组比较采用 t 检验，多组比较采用单因素方差分析。P臆0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1脱细胞支架形态学改变大体观察脱细胞处理后淋巴结组织，颜色由淡粉色变为半透明白色，脱细胞后组织体积稍缩小。脱细胞处理后的卵巢组织，颜色由粉色变为半透明白色，脱细胞后体积缩小但基本保留了完整的外形，见图 1。图 1卵巢脱细胞和淋巴结脱细胞前后的大体形态淋巴结脱细胞淋巴结卵巢脱细胞卵巢2.2组织学观察HE 染色后新鲜淋巴结及卵巢组织可见细胞核蓝染，细胞质红染；脱细胞淋巴结及卵巢组织中未见明显蓝染细胞核，细胞外基质（ECM）破坏不明显，可见明显的孔隙。DAPI 染色结果与 HE染色结果一致，新鲜淋巴结及卵巢组织可见细胞核与 DAPI 染料结合为亮蓝色，脱细胞支架组未见明显阳性表达。Masson 染色显示新鲜淋巴结及卵巢组织可见蓝染的胶原纤维、红染的细胞质。脱细胞处理后的组织可见清晰的蓝染胶原纤维，具有完整的孔隙结构，形态完好，未观察到红染细胞质残留。Alcian Blue 染色糖胺聚糖染色为蓝色。见图 2、图 3、图 4。2.3脱细胞支架扫描电镜结果扫描电镜下脱细胞支架三维结构完整，卵巢脱细胞支架显示含有卵泡、颗粒细胞和膜细胞的吴梦静，等.淋巴结脱细胞支架的构建及效果评价561窑窑宁夏医科大学学报4缘卷空腔，在脱细胞过程后，这些空腔仍然被保留；淋巴结脱细胞支架显示连接良好和定向的胶原网络，没有因脱细胞过程而产生变形或纤维断裂，见图 缘。2.4DNA 含量分析卵巢组织内的 DNA 干重含量为（4 189.98依529.88）ng mg-1，经过脱细胞处理之后，卵巢脱细胞支架的 DNA 干重含量为（501.23依97.31）ng mg-1（P0.05），残留率占天然卵巢组织 11.96%；淋巴 结 组 织 内 的 DNA 干 重 含 量 为（4 700.74依540.30）ng mg-1，经过脱细胞处理后，淋巴结脱细胞支架的 DNA 干重含量为（350.22依126.51）ng mg-1（n=5，P约0.05），残留率占淋巴结组织的 7.45%。琼脂糖核酸电泳表示卵巢及淋巴结天然组织中的 DNA 片段均超过 1 000 bp，但在脱细胞支架中未发现超过 200 bp 的条带，见图6。A.淋巴结 HE 染色；B.淋巴结 Masson 染色；C.淋巴结Alcian Blue 染色；D.脱细胞淋巴结HE 染色；E.脱细胞淋巴结 Masson 染色；F.脱细胞淋巴结 Alcian Blue 染色。图 2脱细胞前后淋巴结光镜下组织学染色观察（bar=50 滋m）A.卵巢 HE 染色；B.卵巢 Masson 染色；C.卵巢 AlcianBlue 染色；D.脱细胞卵巢 HE 染色；E.脱细胞卵巢 Masson染色；F.脱细胞卵巢 Alcian Blue 染色。图 3脱细胞前后卵巢光镜下组织学染色观察（bar=50 滋m）A、B：淋巴结脱细胞支架；C、D：卵巢脱细胞支架；B、D 分别为 A、C 图的放大图。图 5卵巢与淋巴结电镜观察ADBECFADBECFA.卵巢 DAPI 染色；B.脱细胞卵巢 DAPI 染色；C.淋巴结DAPI 染色；D.脱细胞淋巴结 DAPI 染色。图 4脱细胞前后卵巢及淋巴结荧光显微镜下 DAPI 染色观察（bar=100 滋m）ABCDADBCA.脱细胞前后组织内 DNA 的定量，与卵巢相比*P0.05，与淋巴结相比#P0.05；B.脱细胞前后组织内 DNA 琼脂糖凝胶电泳。图 6卵巢及淋巴结天然组织内的 DNA 分析AB6 0004 0002 0000*#伊2 000伊2 000伊12 000伊12 000562窑窑6期2.5HYP 含量分析卵巢组织内的HYP含量为（0.741依0.048）滋g mg-1，经过脱细胞处理之后，卵巢脱细胞支架的 HYP含量为（0.564依0.040）滋g mg-1；淋巴结组织内的HYP 含量为（0.409依0.012）滋g mg-1，经过脱细胞处理之后，淋巴结脱细胞支架的 HYP 含量为（0.398依0.003）滋g mg-1（n=5，P约0.05），见图7。*1.00.80.60.40.20.0与卵巢相比*P0.05。图 7淋巴结和卵巢脱细胞前后 HYP 含量分析3讨论恶性肿瘤后放疗、化疗、病毒感染、遗传因素等原因导致的卵巢功能衰竭，是育龄期妇女不孕的一个重要原因。其中激素替代疗法（HRT）是临床最常用的治疗方法，但是存在局限性，在恢复卵巢功能方面并不完全有效15，因此迫切需要一种新的替代方案。以组织工程为代表的“人工卵巢”是一种安全可行的替代方案，可以移植到患者体内重建生殖功能。人工卵巢是指在生物材料构成的半固体骨架结构内种植未成熟卵泡、卵巢基质细胞和内皮细胞后形成的复合物16。组织工程是旨在修复、维护或改善损伤组织功能的生物替代物的一门新兴学科。组织工程的 3 个基本要素包括种子细胞、生物材料、组织构建。生物材料支架是组织工程研究的关键点。理想的组织工程材料应具备以下几点：良好的生物相容性、生物降解性和多孔的三维立体结构。去除细胞后的ECM 可作为生物材料用于组织工程中，脱细胞ECM 缺乏细胞和免疫原性低，更适合用于同种异体移植甚至异种移植，并且其中含有多样的生物活性物质，可以为后期种子细胞再生提供良好的内部环境，促使细胞在支架中更为良好地生长17。近几年来，有研究14采用人和牛的 ECM 与小鼠卵巢原代细胞进行共培养，移植至小鼠体内后可恢复其内分泌功能。但脱细胞卵巢存在供体短缺的问题。淋巴结外包以致密结缔组织被膜，被膜向淋巴结内伸入，形成许多间隔或小梁，构成淋巴结的网状支架，这些紧密的网状结构利于后期种子细胞再细胞化。因此，淋巴结替代可解决人工卵巢生物材料供体短缺的问题。本实验利用 SDS 溶液在摇床振荡器上洗涤，制备了卵巢与淋巴结脱细胞支架，并对其进行了鉴定评估。为了探索淋巴结脱细胞支架在卵巢组织工程中应用的可能性，本研究比较了淋巴结脱细胞支架和卵巢脱细胞支架。脱细胞后形成的卵巢及淋巴结支架呈现白色半透明状，与 Hassanpour 等18报道的人卵巢脱细胞支架的颜色类似，同时他发现卵巢脱细胞后，细胞含量明显下降。显微结构显示HE 染色下的卵巢脱细胞 ECM 支架与淋巴结脱细胞 ECM 支架均未见明显细胞残留，与 DAPI 染色结果一致。扫描电镜结果显示卵巢脱细胞ECM 支架纤维交织成网，淋巴结脱细胞 ECM 支架可见交织成网的 3D 样结构，尚保留了一些基质成分。说明淋巴结和卵巢脱细胞 ECM 支架均保留了较为完整且结构相似的 ECM 结构。这些ECM 结构的保留为后续淋巴结与卵巢细胞再细胞化提供了基础。Masson 染色显示淋巴结和卵巢脱细胞 ECM 支架胶原纤维形态保留完整。Al原cian Blue 染色显示卵巢脱细胞ECM 支架中蓝色条带较细，淋巴结脱细胞 ECM 支架中有稍粗不定形基质样结构。这些结果与 Alshaikh 等19使用小鼠卵巢脱细胞后得到的结果基本一致。本研究制作的淋巴结脱细胞 ECM 支架和卵巢脱细胞ECM 支架在去除了细胞的同时，保留了细胞外基质的主要结构，并且两者在显微结构上存在着一定的相似性，这为淋巴结脱细胞 ECM 支架在卵巢组织工程中的应用提供了实验依据。DNA 残留量的检测是脱细胞 ECM 支架必须检测的指标之一。组织工程学中，直到现在也没有一个有效的脱细胞定量标准。但脱细胞的标准可以以剩余核酸量作为参考，包括：1）每毫克干重组织内的 DNA 含量约50 ng；2）DNA 片段约200 bp；3）HE 染色和 DAPI 染色缺乏可见的细胞和细胞核20。本试验结果显示卵巢脱细胞支架的DNA 干重含量为（501.23依97.31）ngmg-1，淋巴结脱细胞支架的 DNA 干重含量为（350.22依126.51）ng mg-1，未达到支架标准 50 ng mg-120。残留率占天然卵巢组织的 11.96%，占淋巴结组织的 7.45%，与文献中所示残留率 15.01%相比较小，而文献显示残留率 15.01%的脱细胞支架无明显免疫反应，且可成功与小鼠卵巢细胞进行共培养14。由 HYP 检测可以看出淋巴结与卵巢脱细吴梦静，等.淋巴结脱细胞支架的构建及效果评价563窑窑宁夏医科大学学报4缘卷胞前后胶原蛋白含量差异不大，为后续再细胞化提供了基础。总之，淋巴结脱细胞支架在显微结构方面与卵巢脱细胞支架存在相似性，具有在卵巢组织工程中应用的可能性。参考文献：1 Group EBCTC.Long-term outcomes for neoadjuvantversus adjuvant chemotherapy in early breast cancer：meta-analysis of individual patient data from ten ran原domised trials J.Lancet Oncol，2018，19（1）：27-39.2 Ben-Aharon I，Granot 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method，and then the residual SDS was cleaned withdeionized water.The morphology of the acellular scaffold was observed by HE staining，the residual cells wereobserved by DAPI staining，the collagen fibers were observed by Masson staining，the glycosaminoglycan wasobserved by Alcian blue staining，and the ultrastructure of the scaffold was observed by transmission electronmicroscope.The content of DNA and hydroxyproline was determined.ResultsCompared with the fresh lymphnodes and ovaries，the decellularized lymph nodes showed slightly smaller volume，lighter color and ground glassappearance.HE staining showed no obvious cell residue，and fibrous structure interwoven into a network wasobserved.Masson staining showed that the morphology of collagen fibers in the dethinning ECM scaffold oflymph nodes and ovaries was intact.Alcian Blue staining showed thin blue bands in ovarian acellular ECM scaf-folds，and slightly thick amorphous matrix-like structures in lymph node acellular ECM scaffolds.DAPI stainingshowed no obvious nuclei.Scanning electron microscopy showed that a large number of fibers were densely dis-tributed，and smaller sheets of extracellular matrix components connected with the fibers，which connected toeach other to form a 3D grid structure.DNA quantitative analysis showed that only 7.45%of lymph node and11.96%of ovarian acellular scaffolds remained（P0.05）.Decellularized ovarian scaffolds were reduced afterhydroxyproline decellularization（P0.05）.The expression of granzyme B gene was significantly increased（P0.01）.ConclusionCD8+T cells may kill microglia co-expressed by MHC classand MHC class by releasing granzyme B，and indirectly inhibit the inflammatory response in the relapse stage by suppressing the activation of CD4+Tcells by MHC class，and play a negative immunoregulatory role.Key words：experimental autoimmune encephalomyelitis；multiple sclerosis；CD8+T cells（上接第 564 页）572窑窑