基于线粒体COI基因对棘胸蛙养殖群体的遗传多样性分析.pdf

江西水产科技2 0 2 3年第4期研究报告/YanjiuBaogao文章编号：10 0 6-318 8（2 0 2 3）0 4-0 0 1-0 5基于线粒体 COI 基因对棘胸蛙养殖群体的遗传多样性分析张燕萍，章海鑫，习宏斌，吴子君，廖再生（1.江西省水产科学研究所，江西南昌330 0 39；2.峡江县农业农村局，江西吉安33140 0）摘要：为研究江西省棘胸蛙的遗传多样性，利用线粒体COI分子标记对采自江西省内峡江、靖安、金溪、明月山、于都5个棘胸蛙养殖群体144个样本进行遗传多样性分析。结果显示：144条棘胸蛙线粒体COI长度为990 bp，共检测出变异位点2 7 0 个，包括简约信息位点2 50 个，单突变位点2 0 个，2 个缺失和插入；共检测到35个不同的单倍型，单倍型多样性为0.92 7；核苷酸多样性为0.0 40 5，平均核苷酸差异数（K）为40.0 18。养殖群体除峡江和于都群体的遗传多样性较高，其余3个群体均较低；群体内发生了极大的分化，群体变异主要来源于群体内（7 8.0 8%）。关键词：棘胸蛙；COI；养殖群体；遗传多样性中图分类号：Q959.53；S96 6.3棘胸蛙（Quasipaa spinosa）又名石蛙、石鸡等，属脊椎动物门、两栖纲、无尾目、叉舌蛙科、棘胸蛙属，具有肉质细嫩、味道甘美、营养丰富的特点，而且具有较高的经济和科研价值，所以受到越来越多的人关注。为了满足市场需求及保护野生资源，江西20世纪8 0 年代初开始人工养殖棘胸蛙，人工养殖过程中近亲繁殖，导致我省棘胸蛙出现生长速度慢、抗病力差、个头小等问题，缺乏对养殖群体进行遗传多样性分析。细胞色素氧化酶亚基I（Cy t o c h r o m e c o x i d a s e s u b-unitI，C O I）是线粒体中13个蛋白编码基因之一，该基因功能比较保守，同时又有一定的进化速率，包含的遗传进化信息量较大，在物种内变异较小，种间变异较大，很少存在插人和缺失，且容易被通用引物所扩增，所以在水生生物种群遗传多样性及遗传结构分析、系统发育等发面得到了广泛应用2-3。O本研究基于线粒体DNACOI，对江西省内5个棘胸蛙养殖群体进行遗传多样性与遗传结构分析，旨在为解决棘胸蛙人工养殖过程中由于遗传多样性下降而导致养殖效益降低的现状，同时为我省棘胸蛙的品种选育与改良工作提供理论基础，为棘胸蛙种质资源恢复与可持续利用提供科学依据。基金项目：江西省重点研发计划项目（2 0 192 BBF60023）作者简介：张燕萍（19 7 9），女，博士，主要从事水产养殖、渔业资源与渔业生态环境研究。Em a il：z h a n-.文献标识码：A1材料与方法1.1样品采集棘胸蛙采自江西省吉安地区峡江群体（XJ）2 2尾、宜春地区明月山群体30 尾、宜春地区靖安群体32尾、赣州地区于都群体30 尾、抚州地区金溪群体30尾。共计144尾，剪肌肉用95%乙醇保存，运回实验室，-2 0 冷冻保存备用。1.2实验方法1.2.1 基因组DNA的提取取少量棘胸蛙的肌肉，利用生工生物工程（上海）有限公司提供的动物基因组提取试剂盒提取。提取后的DNA利用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，-2 0 冷冻保存备用。1.2.2 PCR 扩增用于线粒体COI通用引物，引物序列为F（5-GAAAGACGGGCCTTGATCCC-3）和 R（5-G C-CATTGAGAGGAGTACAGGG3），送至上海生工生物工程有限公司合成。PCR扩增体系为：10 buffer（M g Cl 2）2.5L，d NT P（m i x）（10 m m o l/L）1L,引物（10 mmol/L）各1L，模板DNA（50 n g/L）2L，T a q D NA Po ly m e r a s e（5U/L）0.2 L，加超纯水至2 5L。PCR反应程序：95预变性5min；94变性30 s，6 3退火30 s，7 2 延伸30 s，10 个循研究报告/Yanjiu Baogao江西水产科技2 0 2 3年第4期环；95变性30 s，58 退火30 s，7 2 延伸30 s，30个循环；7 2 延伸10 min，4保存。1.2.3PCR产物检测和测序PCR产物取5uL用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的长度和浓度合格后，将PCR产物送往生工生物工程（上海）有限公司纯化与双向测序，测序引物同上。1.3数据处理与分析测得的上下游序列利用DNA序列用SeqMan软件进行拼接并手工校对。ClustalW（1.8 3）软件41分析比对；利用DNAsp5.05软统计单倍型及变异位点(S）、计算单倍型多样性（Hd）、核苷酸多样性(Pi）、平均核苷酸差异（K）等多样性参数。用MEGA（v e r s i o n 6.0）软件6 中的Kimura双参数法计算各单倍型间的遗传距离；采用NJ（Ne i g h b o r j o i n-ing）法，Bootstrap置信值估算重复次数10 0 0 次，对基因序列数据进行系统分析。用Ariequin3.117软件计算两两群体间的分化指数（Fst），进行分子方差分析（analysis of molecular variance，A M O VA)。2结果与分析2.1棘胸蛙COI基因序列PCR扩增PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测，见图1。由图1可知，棘胸蛙COI序列条带电泳图谱条带清晰、明亮，线粒体COI序的片段大于10 0 0 bp。这可说明提取的棘胸蛙肌肉DNA质量较高，能够用于后期的群体遗传学研究（见图1）。图1PCR产物的琼脂糖凝胶电泳2.2棘胸蛙线粒粒体COI序列特征序列经比对后，获得的棘胸蛙样品的线粒体COI序列长度为990 bp，检测到插人和缺失位点2 个，检测到变异位点2 7 0 个，其中简约信息位点2 50 个，单突变位点2 0 个（图2）。碱基平均含量：A（2 7.1%）、T（31.3%）、G（16.8%）和C（2 4.8%），A+T 含量（58.4%）显著高于G+C含量（41.6%），表现为明显的碱基组成偏倚性，与一2般脊椎动物线粒体DNA序列特征基本一致。2.3单倍型分析基于5个棘胸蛙养殖群体144条COI序列，共界定出35种单倍型，结果见表1，各群体包含单倍型类型差异较大，于都群体分布的单倍型最多（13种）、金溪群体分布的单倍型最少（9种）。分布最广泛的Hap_5、H a p _6 以及Hap_9单倍型分别出现为15次、2 9次和13次，其中Hap_6为共有单倍型。表1棘胸蛙单倍型在群体中的分布群体单倍型数目XJMYYDJAHap_ 15Hap_ 23Hap_ 38Hap_ 43Hap_ 515Hap_ 629Hap_ 71Hap_8Hap_ 913Hap_ 101Hap_ 112Hap_ 124Hap_ 133Hap_ 141Hap_ 151Hap_ 1611Hap_17Hap_18Hap_ 19Hap_ 20Hap_ 21Hap_22Hap_ 23Hap_ 24Hap_ 25Hap_ 26Hap_ 27Hap_ 28Hap_ 29Hap_ 30Hap_ 31 Hap_ 32Hap_ 33Hap_ 34Hap_ 35JX5231331111114411161515221411111126121131111326613141112151781210345221411111江西水产科技2 0 2 3年第4期研究报告/Yanjiu Baogao注：XJ吉安地区峡江群体、MY宜春地区明月山群体；YD赣州地区于都群体、JA宜春地区靖安群体、抚州地区金溪JX群体。同下。2.3遗传多样性分析群体内的遗传多样性可以通过单倍型多样性、核苷酸多样性和平均核苷酸差异数等数据来体现。通过DnaSP5软件计算各群体的遗传多样性参数见表2。144个样本合计，单倍型多态性（Hd）为0.92 7，核苷酸多样性（Pi）为0.0 40 50，5个养殖群体的Pi值均超过0.0 1，说明这五个养殖群体的变异程度均较大；平均核苷酸差异数（K）为40.0 18，各群体平均核苷酸差异在2 1.0 6 0 39.391。2.4遗传结构通过利用MEGA4.0软件中的Kimura2-parame-ter模型，计算出5个棘胸蛙群体之间以及群体内部的遗传距离（D），结果如表3所示。5个棘胸蛙养殖Hap_1CGTATAATTT CACATCTTAT ATCCGACGTA CCATCCTATA CCTTCAGCCT TACACTGCCC TCCCTGATGC GATCTATACAHap_2Hap_3Hap_4Hap_5Hap_6Hap_7Hap_8Hap_9Hap_10Hap_11Hap_12Hap_13Hap_14Hap_15Hap_16Hap_17Hap_18Hap_19Hap_20Hap_21Hap_22Hap_23Hap_24Hap_25Hap_26Hap_27Hap_28Hap_29Hap_30Hap_31Hap_32Hap_33Hap_34Hap_35群体内的遗传距离在0.0 2 5 0.0 49之间分布，内部平均遗传距离为0.0 45。在5个养殖群体中，遗传距离最近的为于都群体和金溪群体，遗传距离最远的为明月山群体和靖安群体。2.5遗传差异及遗传分化通过运用Arequin3.5软件计算5个棘胸蛙养殖群体的遗传分化，结果见表4。结果表明棘胸蛙两两群体间遗传分化系数（FST）值在0.0 0 38 2 0.40 0 90之间，其中宜春地区的明月山群体（MY）与宜春地区靖安群体（JA）发生的遗传分化最大，而与抚州地区金溪群体（JX）发生的遗传分化最小，YD、MY、JA 群体间，JA与JX群体间，XJ与JA群体间均发生极大的分化（FST0.25，P 0.0 0 1），但XJ与YD及JX群体间遗传分化处于中等水平（0.1FST0.25,P0.05)。T.CGCGGC.GT.T.GG.CT.AGT.CTTC.T.C.CGGC.GT.T.GG.CT.AGT.CTTC.CC.T.TC.G.A.T C.TC.CAT.C.T.C.CGGC.T.T.T.GG.CTTAGT.CTTC.TCC.T.T.T.C.CGGC.GT.T.GG.CT.AGT.CTTC.CC.T.T.C.T.TAC.CG.C.T.T.GG.CT.AG.A.TTC.T.C.TTT.T.C.CGGC.T.T.T.GG.CTTAGT.CTTC.TCC.T.T.T.CGCGGC.GT.T.GG.CT.AGT.CTTC.T.C.CGGC.T.T.T.GG.CTTAGT.CTTC.TCC.T.T.T.C.CGGC.GT.T.GG.CT.AGT.CTTC.T.C.CGGC.T.T.T.GG.CTTAGT.CTTC.TCC.T.T.T.TCA.T C.TC.CAT.C.T.C.CGGC.GT.T.GG.CT.AGT.CTTC.T.C.CGGC.GT.T.GG.CT.AGT.CTTC.G.C.G.CTC.GCC.TA.ACG.CG.T.T.T.T.G.G.T.C.CGGC.T.T.GG.CT.AGT.CTTC.CC.T.T.C.T.T.G.T.G.G.C.G.CTC.GC C.TA.ACG.T.G.T.G.T.C.CGGC.T.T.T.GG.CTTAGT.G.C.G.CTC.GCC.TA.ACG.T.C.CGG.GT.T.GG.CT.AGT.T.C.CGGC.GT.T.G.CT.AGT.T.CTTC.G.C.G.CTC.GCC.TA.ACGT.C.CGGC.GT.T.GG.CT.AGT.T.C.CGGC.GT.T.GG.CT.A.T.T.C.CGGC.GT.T.GG.CT.AGT.CTTC.CC.T.T.T.C.CGGC.T.T.T.GG.CT.AGT.CTTC.CC.T.T.G.C.CGGC.T.T.T.GG.CTTAGT.CTTC.TCC.T.T.T.C.CGGC.T.T.T.GG.CTTAGT.CTTC.TCC.T.T.TCA.T C.TC.CAT.C.图2棘胸蛙养殖群体单倍型线粒体COI基因的部分变异位点图.CC.,T.T.CC.T.T.CC.T.T.C.CC.T.T.CC.T.T.C.GT.CG.T.T.T.T.G.G.T.C.GT.TG.G.CT.C.TCC.T.T.CG.T.T.T.T.G.G.CTTC.CC.T.T.G.A.T C.TC.CAT.C.CC.T.T.A.T C.TC.CAT.C.CG.T.T.TTT.G.G.TT.A.CA.CTTC.CC.T.T.G.A.T C.TC.CAT.C.CTTC.CC.T.T.A.T C.TC.CAT.C.A.TC.TC.CAT.C.A.T C.TC.CAT.C.G.A.TT C.T.A.TCA.T C.TC.CAT.C.A.T C.TC.CAT.C.A.T C.TC.CAT.C.A.TC.TC.CAT.C.A.TC.TC.CAT.C.CTATAC.A.T C.TC.CAT.C.TT.A.CA.AT.T C.TC.CAT.C.A.TT.A.CA.G.A.A.A.TC.TC.CAT.C.TTT.A.CA.A.TC.TC.CAT.CC.A.T C.TC.CAT.C.AT.T C.TC.CAT.C.A.TC.TC.CAT.C.CT.G.A.A.GG.G.G3研究报告Yanjiu Baogao江西水产科技2 0 2 3年第4期表2棘胸蛙群体的遗传多样性参数参数XJ样本数22单倍型数11(种）多态位点数(S)(个)单倍型多态性0.913 0.035指数(Hd)核苷酸多样性0.02876 0.00289 0.03983 0.02195 0.03455 0.00209 0.02974 0.00290 0.02129 0.01496指数(Pi)平均核苷酸差异数(K)Kumar遗传距离Fu and LisDtest statisticTajimas Dtest statistic表3江西棘胸蛙养殖群体间遗传距离（对角线下）、群体内遗传距离（对角线）和遗传分化系数Fsr值（对角线上）遗传距离（对角线上）遗传分化系数（对角线下）群体XJXJ0.030MY0.047YD0.034JA0.045JX0.035注：平均遗传距离为0.0 45。*P0.05，*P 0.10)(ns,P 0.10)(ns,p 0.10)MY0.15794*0.0490.0580.0660.037方差和739.5952121.7242861.319YD3013970.913 0.02734.1660.0361.45649*(ns,p 0.10)YD0.028480.27017*0.0360.0440.046变异成分/方差组分5.91176va15.26420vb21.17596单系，独有单倍型hap14、h a p 15、h a p 35形成一小单系，属于明月山和金溪群体；独有单倍型hapl、hap2、h a p 7、h a p 18、h a p 19、h a p 2 0、h a p 2 1、h a p 2 3、hap24、h a p 2 6、h a p 2 9和共享单倍型hap16、h a p 2 2 形成一大单系，属于于都、峡江、靖安群体。共享单倍型hap9、h a p 13、h a p 5、h a p 2 5、h a p l 1和独有单倍型hap34形成一单系，属于峡江、明月山、金溪、靖安群体。其他单倍型聚为一大单系，来自所有群体。JA3210670.859 0.04029.4130.0321.55938*(ns,P 0.02)2.86827*(ns,P0.01)JA0.31650*0.40090*0.23225*0.0320.050变异比例(%)遗传分化指数FsT27.920.27917*72.08100JX3091580.844 0.03521.0600.025-5.1964*(ns,P0.02)-2.63110*(ns,p0.001)JX0.22251*0.003820.33698*0.48307*0.025江西水产科技2 0 2 3年第4期研究报告YanjiuBaogao9deH&HapHap2HapHap1J4278Hap1996Hap2410098Hap20023Hap2Hap21图35个棘胸蛙养殖群体的NJ系统发育3讨论3.1棘胸蛙的序列特征本文中5个144尾棘胸蛙群体mtDNACOI基因序列中，碱基A、T、G、C 的平均含量分别为2 7.1%、31.2%、16.8%、2 4.8%，5个群体中A+T碱基的平均含量（58.4%）大于G+C碱基平均含量（41.6 8%），在水产动物中此类现象比较常见，符合脊椎动物mIDNA碱基组成分布不均一的特点。3.2棘胸蛙的遗传多样性本试验中测定的棘胸蛙5个群体的COI序列中共检测2 7 0 个变异位点，占全部序列的2 7.2 7%，共定义了35个单倍型。本研究中单倍型多样性指数和核苷酸多样性指数分别为0.92 7、0.0 40 5，与路庆芳9（2 0 0 8）研究的野生群体（Hd：0.9 6 8，Pi：0.116 8）相比，Hd和Pi均有下降，这一点与魏朝宇10 研究的养殖群体（Hd：0.9 456 8，Pi：0.0 341）比野生群体低的结果一致。养殖群体遗传多样性下降，可能是因为人工养殖过程中，存在近亲繁殖的现象，导致养殖群体遗传多样性下降。3.3棘胸蛙群体的遗传变异根据COI序列变异得到的NJ系统进化树结果显示（图3），共享单倍型hap6分布于5个群体中，所含样本数最多2 9个，推测为古老单倍型。总体来说，江西省各个县区棘胸蛙养殖群体的单倍型呈现出一种混杂的分布格局，错综交织。群体间的遗传分化指数（Fst）用来表示群体间的遗传分化程度，Fst值越大，表明两个群体间的分化程度越高；反之，分化程度越低8 。根据各群体的854100EapHap3Hap80二Fst值，判断峡江与于都群体间、明月山与靖安群体间遗传分化很小，可以忽略不计；峡江与明月山、金Hap3溪群体间遗传分化处于较高水平；明月山与于都、靖Hap 10安群体间，于都与靖安、金溪群体间，靖安与金溪群Hap 27体间遗传分化很大。Hap4群体间的遗传距离能反映群体间的亲缘关系，值5567Hap30Hap12Hap 1783H.ap33Hap9Hap1338HapS越大亲缘关系越疏远。利用MEGA软件计算群体间遗传距离（表3），XJ与YD（0.0 34）、XJ与JX（0.0 35）、JX与MY（0.0 37）之间的遗传距离较小，表明亲缘关系较近，而MY与YD、JA 2 群体间的遗传距离较远，说明MY群体与YD群体及JA群体之间的亲缘关系较远。参考文献1詹忠根,刘悦,黄伟素,秦钢,程宏毅,郑荣泉.棘胸蛙种质资源研究进展J中国农学通报,2 0 16，32(02):77 81.2毕相东，杨雷，侯俊利，白东清，董少杰,孙金辉,李永仁,侯林.COIs基因在海洋动物分子系统学研究中的应用J水产科学,2 0 0 8（0 2：10 510 8.3梁宏伟,孟彦,罗相忠，李忠,邹桂伟。基于线粒体COI基因的6 个黄鳝群体遗传多样性J中国水产科学,2 0 18,2 5(0 4):8 37-8 46.4 Thompson J D,Gibson T J,Plewwniak F,et al.The Clustal X windows interface:flexible strategies for mul-tiple sequence alignment aided by quality analysis toolsJ.Nucleic Acids Research,1997,25(24):4876-4882.5 J HarrisonRG.AnimalmitochondrialDNAasageneticmarkerin populationand evolutionary biology.TrendsEcolEvol,1989,4:6-11.6 Tamura K,Dudley J,Nei M and Kumar S(2007).MEGA4:Molecular Evolutionary Genetics Analy-sis（M EG A）s 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