基于GEO芯片探究槲皮素对银屑病外周血中性粒细胞的分子作用机制.pdf

中 国 科 技核 心 期 刊药 理 研 究方方 药药 2023年第36卷第9期基于 GEO 芯片探究槲皮素对银屑病外周血中性粒细胞的分子作用机制陈广芳1，2，文昌晖21 贵州中医药大学第一临床医学院，贵州 贵阳 550002；2 贵州中医药大学第一附属医院，贵州 贵阳 550002摘 要 目的：通过基因表达数据库（GEO）芯片分析及分子对接方法探讨槲皮素对银屑病外周血中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）的分子机制。方法：从公共GEO下载GSE106087芯片数据，筛选差异靶点基因；收集中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharma-cology database and analysis platform，TCMSP）中槲皮素预测靶点基因，与银屑病外周血NE差异性基因取交集，收集槲皮素干预银屑病外周血NE的靶标基因，并进行String平台验证，同时进行基因本体论功能富集分析（gene ontology，GO）和KEGG富集分析（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG），最后通过分子对接证据支持分析槲皮素干预银屑病NE的作用机制。结果：1）GSE106087基因芯片共包含基因49454个，银屑病外周血NE差异性基因189个（上调36个、下调153个）；GO富集分析为432条生物过程、23条细胞成分、6条分子功能；KEGG富集分析为12条信号通路；2）槲皮素干预银屑病外周血NE差异基因11个（下调7个、上调4个），拓扑网络筛选核心靶标基因为JUN、SSP1（均为银屑病外周血NE上调基因），通过String平台验证为8个，其中能与槲皮素进行分子对接基因共6个，GO富集分析生物过程共291条、细胞成分7个、分子功能14个；KEGG富集分析为34条信号通路。结论：1）GSE106087基因芯片包含基因49454个，银屑病外周血NE的病理机制主要与ARG1等基因、中性粒细胞活化、病毒蛋白与细胞因子、细胞因子受体相互作用等上调，以及SPP1等基因、中性粒细胞脱颗粒生物过程、NOD样受体信号通路等下调关系密切；2）槲皮素干预银屑病外周血NE机制，主要与上调JUN、SSP1和下调IL-17信号通路、TNF信号通路等密切相关。关键词 银屑病；基因表达数据库；中性粒细胞；槲皮素；分子对接；JUN；SSP1；IL-17信号通路；TNF信号通路中图分类号 R223.1+4 文献标识码 A 文章编号 2096-9600（2023）09-0025-10Molecular Mechanism of Intervention Effects of Quercetin on Neutrophile Granulocyte in Peripheral Blood of Psoriasis Based on GEO ChipCHEN Guangfang1,WEN Changhui 21 First Clinical Medical College,Guizhou University of Traditional Chinese Medicine,Guiyang 550002,China;2 First Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine,Guiyang 550002,ChinaAbstractAbstract Objective:To study molecular mechanism of the intervention effects of quercetin on NE in peripheral blood of psoriasis patients through GEO chip analysis and molecular docking method.Methods:GSE106087 chip was downloaded from GEO to screen differential target genes;quercetin predicted target genes were collected from TCMSP,and then the intersection of differential genes with psoriasis NE were gained,target genes of quercetin intervention in psoriasis NE were collected and validated in String platform,meanwhile to perform GO and KEGG enrichment analysis,consequently,the mechanism of quercetin intervention in psoriasis NE was supported and analyzed via molecular docking evidence.Results:1)There were 49454 genes contained in the GSE106087 gene chips,and 189 differential genes of psoriasis genes(36 genes for up regulation,and 153 for down regulation);GO enrichment analysis showed that there were 432 biological processes,23 molecular components and six molecular function;KEGG enrichment analysis covers 12 signaling pathway;2)There were 11 differential genes about quercetin intervention in psoriasis NE(seven genes for up regulation and four ones for down regulation),topology network filtering displayed that the core target genes were JUN and SSP1(up-regulated genes for psoriasis NE),and there were eight genes through String platform validation,among them,six genes could perform molecular docking with quercetin,GO enrichment analysis showed 291 biological processes and seven molecular components and 14 molecular functions;and 34 signal pathways revealed in KEGG enrichment analysis.Conclusion:1)GSE106087 gene chip contains 49454 genes.The pathological mechanism of psoriasis NE is closely related to the up-regulation of ARG1 and other genes,neutrophil activation,the interaction DOI：10.12174/j.issn.2096-9600.2023.09.0625Western Journal of Traditional Chinese Medicine,2023 Vol.36 No.9中 国 科 技核 心 期 刊药 理 研 究方方 药药 between virus protein and cytokines and cytokine receptors,and the down-regulation of SPP1 and other genes,neutrophil degranulation biological process and NOD-like receptor signaling pathway;2)The mechanism of quercetin interfering with psoriasis NE is closely related to up-regulation of JUN and SSP1 and down-regulation of IL-17 signal pathway and TNF signal pathway.KeywordsKeywords psoriasis;GEO;neutrophile granulocyte;quercetin;molecular docking;JUN;SSP1;IL-17 signaling pathway;TNF signal pathway银屑病是一种慢性炎症性和自身免疫性疾病，典型病理学特征为大量中性粒细胞浸润于表皮1，中性粒细胞外诱捕网参与心血管、肾脏损伤等血管内皮损伤过程2，增加心血管事件风险，抑制中性粒细胞活化可减轻银屑病皮损。银屑病尚无根治方案，目前银屑病的中医药治疗确有疗效，相比多数治疗方案，可减轻患者经济负担。前期参照孙逊等3的中药复方网络药理学研究思路及过程，分别分析4位名家验方干预银屑病的主要有效成分，包括赵炳南先生凉血活血汤4、国医大师禤国维教授皮肤解毒汤5、李斌教授益气活血方6、贾敏教授消疕汤7，通过对比分析发现其干预银屑病的有效成分均含有槲皮素。目前无银屑病外周血中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）病理机制以及槲皮素干预银屑病外周血NE作用机制文献报道，本研究通过GEO芯片分析及分子对接原理分析银屑病外周血NE的病理机制，并探究槲皮素干预银屑病外周血NE的作用机制。1 数据库与方法1.1数据库本研究主要运用的数据库和平台包括 GEO 数据库（https：/www.ncbi.nlm.nih.gov/）、GO数据库（gene ontology，http：/geneo-ntology.org/）、KEGG数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，https：/www.kegg.jp/）、中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology da-tabase and analysis platform，TCMSP，http：/ CANCER GENOME数据库（https：/www.mycancergenome.org/）、SwissTargetPre-diction 数 据 库（http：/www.swisstargetpre-diction.ch/）、String平台（https：/string-db.org/）及RCSB PDB（https：/www.rcsb.org/）等。1.2疾病GEO芯片热图绘制通过GEO数据库收集GSE106087芯片与平台数据信息，通过R软件及edgeR、pheatmap等插件，设定P0.05，FDR1，将差异基因导入Excel表格，绘制热图。1.3疾病差异性基因基因本体论功能富集分析（gene ontology，GO）和 KEGG 富 集 分 析（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）运用 R 软件及 enrichplot、ggplot2、DOSE、clusterProfiler、colorspace、stringi等插件，上传银屑病NE差异性基因至GO和KEGG数据库，按照P0.01和 q0.05标准筛选，将槲皮素干预银屑病外周血NE的靶点基因富集分析结果分别导入Excel表格，绘制气泡图及圈图。1.4化合物靶标基因收集通过 TCMSP、Drug-Bank8、DGIdb 和 MY CANCER GENOME 数据库收集槲皮素预测靶点基因，与Excel表格取交集基因，汇总到txt文件中。1.5槲皮素干预银屑病外周血NE的拓扑网络构建及验证将槲皮素与银屑病外周血NE的差异基因取交集后导入Cytoscape 3.7.2中，依次运用Bisogenet和CytoNCA插件，设置计算中心度（DC）61，构建蛋白互助拓扑网络，收集核心基因。运用String平台验证槲皮素干预银屑病外周血NE差异性基因，构建蛋白-蛋白相互作用网络(protein-protein interactions，PPI)，剔除PPI网络中游离蛋白，收集核心差异性蛋白及基因。1.6分子对接证据支持收集 Pubchem数据库中槲皮素结构，通过RCSB PDB数据库下载槲皮素干预银屑病外周血 NE 核心差异性蛋白结构，运用PyMOL软件去除水分子、小分子配体，并运用AutoDock软件加氢等处理后，运用Vina进行分子对接模拟并获取对接能量，通过PyMOL获得受体与配体分子对接可视化图。2 结果2.1银屑病外周血 NE 的 GEO 芯片热图从 GEO数据库下载GSE106087芯片与平台数据，共6个样本，获得下调基因36个，上调基因153个。展示上调基因和下调基因各30个，颜色深度代表基因表达程度，颜色越红，基因表达越显著；颜色越绿，基因表达越不显著。Con代表健康人NE样本基因、Treat代表银屑病患者样本基因。见图1。26中 国 科 技核 心 期 刊药 理 研 究方方 药药 2023年第36卷第9期2.2银屑病外周血NE差异性基因GO富集分析银屑病外周血NE差异性基因GO富集分析包括生物过程（biological process，BP）、分子功能（mo-lecular function，MF）和 细 胞 组 成（cellular component，CC），按照P0.01和P.adjust0.05筛选，共461种生物功能，其中432条BP、23条CC、6条MF，均展示前10条。综合P值及富集程度，绘制圈图，fold change0 为上调，反之为下调。主要与生物过程中性粒细胞活化、对细菌来源分子反应等上调，以及与生物过程嗜中性粒细胞脱颗粒、中性粒细胞激活参与免疫反应、中性粒细胞介导的免疫等下调密切相关。见图23。图2 银屑病患者外周血NE的GO富集分析气泡图图1正常人与银屑病患者外周血NE差异基因热图27Western Journal of Traditional Chinese Medicine,2023 Vol.36 No.9中 国 科 技核 心 期 刊药 理 研 究方方 药药 2.3银屑病外周血 NE 差异性基因 KEGG 富集分析按照P0.01和P.adjust0.05筛选，共12条信号通路。综合P值及富集程度，绘制气泡图和圈图，fold change0为上调，反之为下调，结果显示银屑病外周血NE的病理机制主要与ECHDC3、ARG1、OLFM4、CLEC12A基因及中性粒细胞活化、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用等信号通路等上调，以及XIST、BTNL3、CCR3、SPP1 基因和中性粒细胞脱颗粒生物过程、NOD样受体信号通路等下调关系密切。见图45。图3 银屑病患者外周血NE的GO富集分析圈图图4 银屑病患者外周血NE的KEGG富集分析气泡图28中 国 科 技核 心 期 刊药 理 研 究方方 药药 2023年第36卷第9期2.4槲皮素干预银屑病外周血NE基因的拓扑网络将槲皮素与银屑病外周血NE的差异基因取交集后，共收集11个差异性基因于txt文件中，导入 Cytoscape 3.7.2 软 件，使 用 Bisogenet 和Cyto NCA，设置计算中心度（DC）61，构建蛋白互助拓扑网络。拓扑网络共得到JUN、SSP1等28个候选基因，其中 JUN处于最核心位置。将 txt与Excel进行交集分析，获得槲皮素下调银屑病外周血 NE 基因为 MAOA、FLT3、MPO、CYP1B1、CDK5R1、ARG1、NQO2，上调银屑病 NE 基因为 CCL2、IL1B、JUN、SPP1。此外，将JUN、SPP1等11个差异性基因上传至String平台，进行PPI分析，可见下调银屑病外周血NE基因FLT3、MPO、CDK5R1、ARG1以及上调银屑病外周血NE基因CCL2、IL1B、JUN、SPP1处于核心位置。综上可知JUN、SPP1靶标处于核心地位。见图67。图5 银屑病患者外周血NE的KEGG富集分析圈图图6 槲皮素干预银屑病外周血NE的基因拓扑网络图29Western Journal of Traditional Chinese Medicine,2023 Vol.36 No.9中 国 科 技核 心 期 刊药 理 研 究方方 药药 2.5槲皮素干预银屑病外周血NE靶点基因GO富集分析使用R软件，根据槲皮素干预银屑病外周血NE靶点基因，进行GO富集分析，并分别以BP、CC和MF归类收集，以P0.01和q0.05标准筛选，共收集291条BP、7条CC、14条MF。根据基因富集数目与显著程度，绘制气泡图和圈图，fold change0为上调，反之为下调，可知，槲皮素干预银屑病外周血NE主要与ERK1和ERK2级联调控、对脂多糖的反应、JAK-STAT信号通路的脂多糖和受体等上调，以及ERK1和ERK2级联反应、对细菌来源分子的反应等下调密切相关。见图89。2.6槲皮素干预银屑病外周血NE靶点基因KEGG富集分析取P0.02 和P0.05，共筛选出 34条（展示前20条），主要涉及：可卡因成瘾、类风湿性关节炎、IL-17信号通路、糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路、美洲锥虫病、Toll样受体信号通路、TNF信号通路、耶尔森菌感染、液体剪切应力和动脉粥样硬化、色氨酸代谢、NOD样受体信号通路。综合P值及富集程度，绘制气泡图，fold change0为上调，反之为下调。结果显示槲皮素干预银屑病外周血NE主要与类风湿性关节炎、糖尿病并发症中AGE-RAGE信号通路、NOD样受体信号通路等上调，以及可卡因成瘾、IL-17 信号通路、TNF信号通路等下调密切相关，logFC0为上调信息，反之为下调信息。见图1013。2.7分子对接证据支持通过 RCSB PDB 数据库，分别收集槲皮素可下调的FLT3、MPO、CDK5R1、ARG1以及上调CCL2、IL1B、JUN、SPP1蛋白（受体）结构信息，运用 PyMOL、AutoDock、Vina 等软件处理受体与配体（槲皮素）结构信息并进行分子对接模拟，分别收集分子对接模拟的最佳对接能量，绘制可视化图，以能量最低的结构为最佳结构，能量小于0说明配体和受体可自主结合，绘制槲皮素与JUN、SPP1等6种受体的分子对接可视化图，而槲皮素与FLT3、CDK5R1蛋白无法进行分子对接。图中红色箭头处为槲皮素与蛋白分子对接最佳结构。见图14、表1。图7 蛋白质-蛋白质相互作用信息图8 槲皮素干预银屑病患者外周血NE的GO富集分析气泡图30中 国 科 技核 心 期 刊药 理 研 究方方 药药 2023年第36卷第9期图11 槲皮素干预银屑病患者外周血NE的KEGG富集分析圈图图9 槲皮素干预银屑病患者外周血NE的GO富集分析圈图图10 槲皮素干预银屑病患者外周血NE的KEGG富集分析气泡图31Western Journal of Traditional Chinese Medicine,2023 Vol.36 No.9中 国 科 技核 心 期 刊药 理 研 究方方 药药 图12 白细胞介素17信号通路图13 肿瘤坏死因子信号通路32中 国 科 技核 心 期 刊药 理 研 究方方 药药 2023年第36卷第9期以上结果表明，槲皮素干预银屑病外周血NE机制主要与下调 MPO、ARG1 和上调 CCL2、IL1B、JUN、SPP1及其影响的病理过程密切相关，进而下调IL-17信号通路、TNF信号通路，以及上调类风湿性关节炎、糖尿病并发症中 AGE-RAGE 信号通路、NOD样受体信号通路等，其中与下调IL-17信号通路、TNF信号通路关系最大。3 讨论银屑病是一种慢性炎症性和自身免疫性疾病，目前病理机制尚不清楚，文献认为IL-23/Th17轴深度参与了银屑病的发病机制，调节IL-23/Th17轴可以减轻银屑病皮损1。中性粒细胞是含量最多的固有免疫细胞，其致病机制主要与慢性炎症性、自身免疫性疾病相关9，中性粒细胞浸润与银屑病的初始和维持阶段有关1。IL-23/Th17轴由中性粒细胞浸润和角质形成细胞相互作用产生10，中性粒细胞可诱导肥大细胞、T细胞、胞浆细胞、受损皮肤和滑膜液中的固有淋巴样细胞分泌 IL-17A11，IL-17A 上调角质形成细胞表达CCL20水平，CCL20可与趋化因子受体CCR6结合；浸润的中性粒细胞的外泌体诱导角质形成细胞表达HSP70，TLR4与其受体HSP70结合后产生IL-23，IL-23 促进 Th17 细胞的活化并分泌 IL-17A、IL-17F和IL-22，IL-17A和IL-22诱导角质形成细胞增殖12；活化的角质形成细胞可释放外泌体，负反馈促进中性粒细胞活化13；同时，在CCR6影响下，天然Th17细胞被招募到银屑病表皮，并在IL-23和IL-1辅助下浸润于表皮下，创建IL-23/Th17轴框架，加重银屑病皮损。在关节中，IL-17A可作用于成纤维细胞、破骨细胞、软骨细胞和成骨细胞等，上调抗菌肽、趋化因子、促炎和增殖细胞因子水平，促进组织炎症和骨重塑，引发银屑病关节炎11。SHAO等14认为，中性粒细胞外泌体诱导角质形成细胞中炎症基因表达，通过上调NF-B和MAPK信号通路，上调IL-1、IL-36G、IL-18、TNF-和趋化因子（C-X-C基序）配体等表达水平，并募集于皮肤中，且活化的IL-36可抑制弹性酶、组织蛋白酶G和丝氨酸蛋白酶抑制剂A1和A315，最终引发脓皮病型银屑病。另外，活化的NF-B信号诱导角质细胞角蛋白6和16表达，减少细胞代谢周期12，进而促进角化不全。IL-17A和IL-22可上调TNF-表达，银屑病皮损中过表达抗菌肽LL-37，均可激活树突状细胞，加速中性粒细胞等炎性细胞从外周血向皮肤浸润12。因此，有效干预银屑病中性粒细胞活化及浸润可减轻银屑病皮损，中性粒细胞成为干预银屑病的有效靶点之一。槲皮素是一种黄酮类物质，广泛存在于中药材及食物中，具有抗炎、抗氧化、保护血管及免疫调节等多种生物特性，可被用于干预中性粒细胞介导的炎症性疾病16。槲皮素通过下调Th17细胞活性17-18，进而下调 IL-1、IL-6、IL-17、IL-36G、TNF-和趋化因子配体等表达，抑制中性粒细胞从外周血浸润于皮肤；同时，下调IL-17A、IL-17F和IL-22表达，抑制角质形成细胞增殖，从而减轻银屑病皮损。槲皮素减少脂多糖（lipopolysac-图14槲皮素与相关蛋白分子对接模拟结构图表1槲皮素及其相关蛋白分子对接模拟能量序号ABCDEF受体 MPO ARG1 CCL2 IL1B JUN SPP1logFC-1.119480195-3.0411997321.1537555342.0810025481.1415467482.130731678能量（kcal/mol）-8.9-8.9-7.9-7.2-9.4-7.733Western Journal of Traditional Chinese Medicine,2023 Vol.36 No.9中 国 科 技核 心 期 刊药 理 研 究方方 药药 charide，LPS）对角化细胞的刺激，进而释放趋化因子19。槲皮素通过炎症相关信号通路抑制中性粒细胞活性20，同时，抑制中性粒细胞自噬及NETs形成，并抑制中性粒细胞浸润，降低外周血炎症细胞因子水平，最终促进活化的中性粒细胞凋亡21。此外，ZHU等22研究发现槲皮素抑制UVB照射诱导毒性引起角质形成细胞释放ROS短暂性升高，并促进细胞膜流动性和抑制线粒体膜去极化，进而减轻ROS对细胞膜和线粒体的损害。综上所述，槲皮素干预银屑病外周血NE主要与6个核心靶点基因有关，分别是下调MPO、ARG1和上调CCL2、IL1B、JUN、SPP1靶标基因，而JUN、SSP1处于核心地位，说明槲皮素主要通过下调IL-17信号通路、TNF信号通路，以及调节银屑病1L-23/Th17轴，达到干预银屑病外周血NE水平，抑制中性粒细胞在银屑病皮损区的浸润，减轻银屑病皮损。此外，槲皮素可减轻 UVB 对皮肤照射的损伤，因此，将含槲皮素的中药作为干预银屑病的单体或一种防晒剂值得进一步研究。参考文献1CHIANG C C，CHENG W J，KORINEK M，et al.Neutrophils in psoriasis J.Front Immunol，2019，10：2376.2李若琳，王萍，陈爱军.中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）在银屑病中的作用及机制 J.中国皮肤性病学杂志，2021，35（12）：1417-1421.3孙逊，陶嘉磊，许少菊，等.基于网络药理学探究化湿败毒方治疗新型冠状病毒肺炎的分子机制 J.中药材，2020，43（8）：2047-2052.4周冬梅.赵炳南从血论治银屑病探源 N.中国中医药报，2015-01-23（04）.5欧阳卫权，范瑞强，李红毅.禤国维教授运用皮肤解毒汤治疗银屑病经验介绍 J.新中医，2014，46（6）：28-29.6罗月，蒯仂，茹意，等.李斌治疗寻常型银屑病血瘀证经验 J.中华中医药杂志，2019，34（12）：5748-5751.7文昌晖，张硕，贾敏，等.消疕汤对血热风燥型银屑病患者血清IL-8、IL-10水平的影响 J.贵州医药，2019，43（2）：196-198.8WISHART D 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