基于BSA-seq和RNA-seq挖掘水稻株高相关QTL.pdf

研究报告生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2023,39(8):173-184收稿日期：2023-04-22基金项目：海南省自然科学基金项目（2021JJLH0075），国际（地区）合作与交流项目（32261143465），海南省重点研发项目（ZDYF2022XDNY260），国家自然科学基金项目（31970237），辽宁省自然科学基金面上项目（2022-MS-309），沈阳师范大学“百人计划”拔尖人才项目（SSDBRJH2002012），沈阳师范大学重大项目孵化工程（ZD202104），省级大学生创新创业训练计划资助项目（S202310166005）作者简介：吴元明，男，硕士研究生，研究方向：生物化学与分子生物学；E-mail:通讯作者：逄洪波，女，博士，副教授，研究方向：植物逆境分子生物学；E-mail:基于 BSA-seq 和 RNA-seq 挖掘水稻株高相关 QTL 吴元明1 林佳怡1 柳雨汐1 李丹婷2 张宗琼2 郑晓明3，4，5 逄洪波1（1.沈阳师范大学生命科学学院，沈阳 110034；2.广西壮族自治区农业科学院水稻研究所 广西水稻遗传育种重点实验室，南宁 530007；3.中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081；4.海南三亚中国农业科学院国家南繁研究院，三亚 571700；5.国际水稻研究所，菲律宾马尼拉 DAPO box 7777）摘 要：株高是影响水稻产量稳定性的重要因素之一，水稻株高相关 QTL 的定位及候选基因的挖掘，有助于深入了解株高分子调控机制，进而为培育理想株型的水稻品种奠定基础。以油占 8 号及广西野生稻为亲本构建的 285 个 CSSL 群体为试验对象，结合 NGS 与 BSA-seq 等方法，利用 SNP 和 InDel 两种分子标记进行关联分析，对可能与株高相关的基因组区段进行定位。结果显示，（SNP-index）分子标记在 Chr.7 和 Chr.10 中分别关联到 3.205 和 1.311 Mb 大小的候选基因组区域。（InDel-index）标记关联到的基因组区域大小分别为 2.848 和 1.292 Mb，且全部包含于（SNP-index）关联到的区间内。结合 GO、KEGG、Uniprot、eggNOG等数据库中的功能注释、高质量多态性位点筛选以及已有的株高相关转录组数据，最终关联到 Chr.7 中的 5 个候选基因，包括功能和机理已知的 OsTCP21。RT-qPCR 结果显示，OsTCP21 在高株和矮株中的表达差异与已有研究结果相一致，LOC_Os07g05050 和LOC_Os07g02850 在高株中表达量较高，LOC_Os07g04220 和 LOC_Os07g02770 在矮株中表达量较高。这 5 个候选基因在水稻株高性状的调控中起重要的作用，OsTCP21 是一个关键调控基因。关键词：水稻；株高；定位；BSA-seq；RNA-seqDOI:10.13560/ki.biotech.bull.1985.2023-0386Identification of Rice Plant Height-associated QTL Using BSA-seq and RNA-seqWU Yuan-ming1 LIN Jia-yi1 LIU Yu-xi1 LI Dan-ting2 ZHANG Zong-qiong2 ZHENG Xiao-ming3,4,5 PANG Hong-bo1（1.College of Life Science,Shenyang Normal University,Shenyang 110034;2.Rice Research Institute,Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanning 530007;3.Institute of Crop Sciences,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081;4.Sanya National Research Institute of Breeding in Hainan,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Sanya 571700;5.International Rice Research Institute,Metro Manila DAPO box 7777,Philippines）Abstract:The stability of rice yield is significantly influenced by plant height,making it as a crucial factor.The identification of plant height-associated QTLs and mining of candidate genes are conducive to comprehending the molecular regulatory mechanisms that determines plant height,which may lay a foundation for breeding ideal rice varieties.This study employed 285 CSSL populations derived from the parental strains of Oryza sativa var.Youzhan 8 and wild rice from Guangxi as the experimental cohort.The study utilized SNP and InDel molecular markers,in conjunction with NGS and BSA-seq techniques,to conduct an association analysis aimed at identifying genomic regions that are potentially associated with plant height.As results,the molecular markers（SNP-index）were discovered to have an association with 生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.8174株高是影响水稻（Oryza sativa L.）产量的重要农艺性状之一，自“绿色革命”的兴起1-2以及与株高相关代表基因 sd13和 Rht4被发现并阐明作用机制后，形成了对株高与产量之间关系的正确理解：适度的植株矮化增强了其抗倒伏性，使产量更加稳定。普通野生稻（Oryza rufipogon Griff.）是亚洲栽培稻的祖先，广泛分布于全球各地，遗传多样性丰富，具有较强的适应性和抗逆能力，是栽培稻品种改良和培育的重要种质资源库。染色体片段代换系（chromosome segment substitution lines,CSSLs）群体作为分子育种研究中常用的试验材料之一，其主要特点是来源于亲本的单个染色体段被替换成轮回亲本背景，即每一个 CSSL 除了携带 1 个或少数几个来自供体亲本的代换片段外，其遗传背景均和轮回亲本一致，能有效简化遗传背景，是研究 QTL 的重要群体之一。随着现代生物技术的发展，越来越多与株高性状相关的基因与数量性状基因座（quantitative trait locus,QTL）被成功定位。如 Liu 等5在水稻第 5 染色体定位的抗倒伏基因 SBI，该基因编码 GA-2 氧化酶，通过抑制赤霉素（gibberellins,GAs）的活性控制水稻株高，遗传分析表明，SBI 是控制水稻抗倒伏能力的半显性基因，其等位基因表现出一系列不同的产物活性。Tu 等6通过构建 RILs（recombinant inbred lines）在一个主效 QTL-qPND1 内定位到编码细胞分裂素（cytokinin,CTK）氧化酶的候选基因OsCKX2/Gn1a，该基因第 3 外显子中 11 bp 的缺失使得带有不同亲本型等位基因个体的抗倒伏能力表现出极显著的差异，后续研究发现抗倒伏型 gn1a 与SCM27之间的相互作用可进一步增强水稻的抗倒伏能力。最新发现的 OsFBK48和 DHT19，前者编码具有 F-box 和 kelch repeat 结构的蛋白，通过抑制 GAs 活性进而促进矮化，后者的产物参与构成剪接体使独脚金内酯（strigolactone,SL）受体基因 D14正常表达，D14 促进 SL 信号抑制物 D53 的降解，令SL 正常发挥作用，进而抑制分蘖形成，其突变形式dht1 使 D14 的 mRNA 剪接受阻，SL 无法发挥作用，进而促进分蘖形成以促进矮化。这一系列研究发现株高的本质是受一系列基因与环境因素共同制约的数量性状10-11。GA12和油菜素内酯（brassinolide,BR）13是已知的参与株高调控过程的关键成员，后续发现 SL14和生长素（auxin,IAA）15也参与这一过程。虽然已经在水稻中鉴定到一些与株高相关的QTL 和相关基因，但相比于株高这个复杂的数量性状而言，对于这些基因的功能和调控机制的理解还不充分。需要进行更多的研究来挖掘株高基因，以充分理解它们在株高调控中的作用。本研究使用籼稻油占 8 号和广西普通野生稻构建的 CSSL 群体以及现代分子生物学技术，对广西普通野生稻进行研究，通过二代测序（next generation sequencing,NGS）和混池分析（bulk segregation analysis,BSA）方法，鉴定广西普通野生稻基因组中与株高相关的 QTL，进而筛选出在株高调控中可能起到关键作用的候选基因。同时，运用 RNA-seq 分析进一步验证这些候选基因在株高调控过程中的表达量与水平，为进一步探究水稻株高调控机制提供了重要的理论指导和研究思路，为培育理想株型的水稻提供理论依据。candidate genomic regions of 3.205 and 1.311 Mb in Chr.7 and Chr.10,respectively.The genomic regions linked with（InDel-index）markers were of sizes 2.848 and 1.292 Mb,and were entirely encompassed within the intervals associated with（SNP-index）.Through the integration of functional annotation in GO,KEGG,Uniprot,and eggNOG databases,as well as high-quality polymorphic site screening and existing transcriptome data pertaining to plant height,five candidate genes located in Chr.7 were ultimately linked to this trait,including the previously characterized OsTCP21 function and mechanism.The qRT-PCR findings were consistent with prior research,revealing differential expression of OsTCP21 in tall and dwarf plants.Specifically,LOC_Os07g05050 and LOC_Os07g02850 demonstrated elevated expressions in tall plants,whereas LOC_Os07g04220 and LOC_Os07g02770 had higher expressions in dwarf plants.The regulation of rice plant height is significantly influenced by five candidate genes,with OsTCP21 being identified as a pivotal regulatory gene.Key words:rice;plant height;mapping;BSA-seq;RNA-seq2023,39(8)175吴元明等：基于 BSA-seq 和 RNA-seq 挖掘水稻株高相关 QTL 1 材料与方法 1.1 材料以 广 西 普 通 野 生 稻（Oryza rufipogon Griff.）（Guangxi common wild Rice,GCWR）和籼稻油占 8 号（Oryza sativa L.）（Youzhan8,YZ8）分别作为供体和受体，按照图 1 所示流程，采用单粒传法构建得到285 个 CSSL 群体，由广西壮族自治区农业科学院水稻研究所提供。2012?2012,winter,Guangxi2013?2013,summer,Guangxi2013?2013,winter,Guangxi2014?2014,summer,Guangxi2014?2014,winter,Guangxi2015?2015,summer,Guangxi2018?2018,summer,GuangxiGCWR?YZ8?F1?YZ8BC1F1YZ8YZ8YZ8BC2F1BC3F1BC4F1BC4F7?GCWR：广西野生稻；YZ8：油占 8 号GCWR:Guangxi Common Wild Rice;YZ8:Youzhan8图 1 本研究所用的回交群体的构建过程Fig.1 Construction process of the backcross populations used in this study1.2 方法1.2.1 株高表型鉴定与极端性状混池的构建 每个CSSL 群体随机选取 20 粒种子种植于海南省三亚市国家南繁研究院的试验田中，亲本与子代各群体均随机选取 5 株用于测量抽穗期株高。分别选取最高株和最矮株的 20 个系构建高株池（H-pool）和矮株池（L-pool），收集其叶鞘和节间组织，液氮快速冷冻后，提取其基因组 DNA 和总 RNA。1.2.2 总 DNA 的提取及 NGS 测序 采用 CTAB 法从每个极端群体提取总量为 1.5 g 的基因组 DNA作为构建文库的原料，按照生产商提供的标准使用Truseq Nano DNA HT Sample preparation Kit（Illumina USA）构建测序文库。大致流程为：总 DNA 由超声波处理形成长度为 350 bp 的片段，对其进行末端修复、3 末端添加 A 尾、连接接头等处理用于后续的Illumina 测序和 PCR 扩增。PCR 产物在 AMPure XP system 中进行纯化，文库经 Agilent2100 Bioanalyzer和 real-time PCR 完成定量分析。经上述方法构建完成的文库在Illumina HiSeq 4000 platform中完成测序，最终生成全长为 350 bp 的双端测序片段。1.2.3 测序数据质控及比对 原始测序数据需要经过一系列质量控制程序的处理，去除人为误差后可用于参考基因组比对和后续分析。质量控制标准包含以下 3 个方面：（1）去除未知碱基含量 10%的片段；（2）去除碱基质量值 10 nt 的片段，该过程允许的最高错误匹配几率为 10%。将上述质控处理后的样品测序数据用 Burrows-Wheeler Aligner（BWA）16软件对比至 Nipponbare（NIP）基因组中（settings:mem-t 4-k 32-M-R），参考基因组 MSU 7.0 下载自 http:/rice.plantbiology.msu.edu/pub/data/Eukaryotic_Projects/o_sativa/annotation_dbs/pseudomolecules/version_7.0/all.dir/。SAMtools software17用于将比对结果转化为 bam 文件（settings:-bS-t）。1.2.4 基于 NGS 测序的 BSA-seq 分析与候选基因挖掘 GATK18软件中的 Unified Genotyper function用于完成对各样品 SNP 和 InDel 的检测，并分别使用 GATK 中 不 同 的 参 数 对 SNP（settings:-cluster-WindowSize 4,-filter Expression“QD60.0|M-Q40.0”,-G_filter“GQ20”）和 InDel（set-tings:-filter Expression“QD200.0|Read PosRankSum-20.0|Inbreeding Coeff-0.8”）进行过滤以防止低质量和无效的分子标记对后续分析造成影响。用 ANNOVA19将过滤后的 SNP 和 InDel 在参考基因组文件中进行注释。以日本晴基因组 MSU 7.0 作为参考，比对子代池中与参考基因组在特定碱基位点相同或不同的reads 数量，计算不相同 reads 数量占总数的比例，即 为 SNP-index。InDel-index 的 计 算 方 法 与 SNP-index 基本相同，只是 InDel 涉及长度不等的 DNA 片段而非单个碱基。若两个子代池中出现 SNP/InDel-index0.3 的位点，则将其过滤掉，以减少测序和比对误差造成的影响20。选用 1 Mb 为窗口大小、1 kb生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.8176为步长作为滑动窗口方法的标准参数，并用该方法对 SNP/InDel-index 在染色体上的分布进行作图。计算 2 个子代池中的 SNP/InDel-index 的差值，结果即为（SNP/InDel-index）。SNP/InDel-index 关联分析所需的统计学置信区间按照标准方法设置为 95%和99%。根据计算的 SNP/InDel-index 和 SNP/InDel-index，挑选出 SNP/InDel-index 在 2 个池中差异较大，SNP/InDel-index 在一定置信水平下的窗口即为候选区间。在候选区间中挑选出 SNP/InDel index 在一个池中为 1，另一个池中为 0 的 SNP/InDel 作为原始的候选 SNP，根据这些 SNP 的注释信息，挑选在外显子上，且是非同义突变、stop gain、stop loss 等重要突变的 SNP，这些 SNP 作为候选 SNP，这些 SNP所在的基因作为候选基因。使用 BLAST 方法将候选区间内的编码基因在GO、KEGG、Uniprot、NOG 数据库中进行详细注释，以注释结果为基础对候选基因进行筛选，初步确定参与水稻株高调控的候选基因。1.2.5 转录组数据分析 根据水稻 GH998 已有的水稻抽穗期株高转录组数据，对高株和矮株的差异表达基因进行分析，所用的转录组数据库从 NCBI 数据库中下载（GH998 MU,SRR16686933-SRR16686935和 GH998 WT,SRR16686936,SRR16686938,SRR16686939），不同版本的基因 ID 编号借助 The Rice Annotation Project Database21中的 ID Converter功能完成，利用 TBtools22软件从 RNA-seq 原始数据中提取株高差异表达基因并绘制热图。1.2.6 总 RNA 的提取和候选基因表达模式的验证 TRIzol 法 提 取 叶 鞘 和 节 间 组 织 总 RNA，按照 如 下 步 骤 完 成 质 量 检 测：（1）1%琼 脂 糖 凝胶电泳检测总 RNA 是否存在降解和污染；（2）NanoPhotometer spectrophotometer（IMPLEN,CA,USA）检 测 纯 度；（3）Qubit RNA Assay Kit in Qubit 2.0 Flurometer（Life Technologies,CA,USA）测定 RNA 浓度；（4）RNA Nano 6000 Assay Kit of the Agilent Bioanalyzer 2100 system（Agilent Technologies,CA,USA）检测 RNA 样品的完整性。随机六碱基引物和 M-MuLV 反转录酶（New England Biolabs,Ipswich,MA）用于合成 cDNA 的第一链，DNA聚合酶I和RNase H合成cDNA的第二链。Invitrogen 试剂盒完成双链 cDNA 的末端修复、加尾和接头添加。选用肌动蛋白作为内参基因。所有用于 RT-qPCR 的引物均采用 Primer 3（https:/primer3.ut.ee）软件设计（表 1）。各基因设置 3 次生物学重复以减少误差。相对表达模式经由 2-Ct方法23计算获得。表 1 用于 RT-qPCR 分析的引物列表Table 1 List of primers for RT-qPCR analysis基因Gene引物序列Primer sequence（5-3）产物大小Product size/bpLOC_Os07g02770F:GAGAGCATGGCAAGGAAGGT130R:TAGTGCGGTGCATTTGTCCTLOC_Os07g02850F:GCGTCTGCAGGAAGAAGTCC125R:CTGCACCAGCCACATGAATCLOC_Os07g04220F:CCCGCCATTAGTCCACAGAG128R:TTGCTGGTGGGCCTGATATGLOC_Os07g05050F:CGAACTCCCAAACACCTCGG241R:GGTTCTTGGGCTTCCAGCTAALOC_Os07g05720F:TCTCCATGTCCTCGGGTCTT175R:GGGCTGAAGAGGAACGGAATOsActinF:AGACCTTCAACACCCCTGCT110R:GTGGCTGACACCATCACCAG1.2.7 数据分析 将测量得到的 CSSL 群体株高求平均值分析分布频率，用 Students t-test 检验 RT-qPCR 结果的差异显著性，用 GraphPad Prism v8.4.2软件绘制图形。2 结果2.1 株高性状评估通过对 285 个 CSSL 群体平均株高表型进行鉴定（图 2）。所有 CSSL 群体的平均抽穗期株高分布范围为 101.9-128.2 cm，GCWR 抽穗期株高为 127.4 cm，YZ8 抽穗期株高为 103 cm。频率分布表明，株高在 CSSL 群体中的分布基本符合正态分布的特征，即满足数量性状的定义，因此，这些 CSSL 群体可用于 BSA-seq 分析。2.2 NGS数据质控与比对亲本与极端性状子代池的基因组 DNA 经 Il-lumina 平台测序后（表 2），供体亲本 GCWR 和受2023,39(8)177吴元明等：基于 BSA-seq 和 RNA-seq 挖掘水稻株高相关 QTL 体 亲 本 YZ8 分 别 产 生 11.92 Gb（Q20 97.75%，Q30 93.72%，GC 含 量 为 44.23%）和 11.13 Gb（Q20 97.57%，Q30 93.31%，GC 含 量 为44.6%）的原始数据。2 个子代池 H-pool 和 L-pool 分别 产 生 14.38 Gb（Q20 97.34%，Q30 92.92%，GC 含 量 为 46.54%）和 14.27 Gb（Q20 97.1%，Q30 92.45%，GC 含量为 44.38%）的原始数据。每组样品的测序数据经整理和过滤后至少有 97.89%成功比对至日本晴（Oryza sativa var Nipponbare）基因组 MSU 7.0 中。各样本的测序数据量足够，质量合格，所有样本的比对结果正常，可用于后续分析。2.3 基于NGS的BSA-seq数据分析SNP-index 和 InDel-index 两种算法被用于鉴定与株高相关的基因组区域。来自 H-pool 与 L-pool 的测序数据分别经 BWA、GATK 和 ANNOVAR 比对、分子标记检测和注释后，共得到 3 955 417 个 SNP和 571 046 个 InDels，过滤后得到 13 362 个 SNP（其中包含 1 088 个非同义 SNP）和 1 746 个 InDels。利用（SNP-index）算法在 Chr.7 和 Chr.10 上分 别 鉴 定 到 3.205（1-3 205 000 bp）和 1.311 Mb（3 782 001-5 093 000 bp）的候选基因组区域（图 3）。根 据（InDel-index）算 法，在 Chr.7 和 Chr.10 上分别鉴定到大小为 2.848（1-2 848 000 bp）和 1.292 Mb（3 796 001-5 088 000 bp）的候选基因组区域（图4）。值得注意的是，利用（InDel-index）算法得到的候选区间完全包含在（SNP-index）算法鉴定到的候选区间内。上述所有候选基因组区域的置信阈值均大于 99%（P0.01）。为了缩小定位株高相关的基因组区域，将这两种算法所得到的候选区间的共有部分作为最终的关联区段，相关信息如表 3 所示，分布于第 7 和第 10 染色体上的最终区段长度分别为 2.848 和 1.292 Mb，共包含 276 个已注释的基因。值得注意的是，在 Chr.7 的候选区段中包含有已报道的与水稻株高调控相关的基因 LOC_Os07g05900（PROG1）和 LOC_Os07g05720（OsTCP21）。2.4 候选区间内基因的功能注释与富集分析根据候选基因组区间内 SNP、InDel 调用和注释的结果，共有 413 个高质量的非同义突变 SNP（4个 nsSNP 被定位在日本晴参考基因组的 Chr.10 内，其余 nsSNP 位于 Chr.7 内）包含在 92 个基因内（3个基因位于参考基因组的 Chr.10 内，其余基因位于Chr.7 内），139 个高质量 InDels（125 个属于上游类 别，其余被归类于移码突变）被定位到 85 个基因内（除了位于 Chr.10 内的 1 个基因外，剩余基因全部位于 Chr.7 内）。将利用两种分子标记所关联到的可AB100105110115120125020406080100?Plant height/cm?NumberoflinesYZ8GCWRA：CSSL 群体中最高株和最矮株表型（Bar=25 cm）；B：CSSL 群体平均株高的分布频率A:The tallest and shortest individuals in CSSL populations（Bar=25 cm）.B:Distribution of average plant heights of CSSL populations 图 2 CSSL 群体的株高表型分析Fig.2 Plant height phenotype analysis of CSSL populations表 2 用于 BSA-seq 分析的 NGS 测序数据统计概况Table 2 Summary of NGS data for BSA-seq analysis样品Sample原始数据Raw base/bp过滤后的有效数据Clean base/bp比对率Mapping rate/%平均测序深度Average depth（）至少覆盖 1 个碱基的位点的比例 Coverage at least 1/%至少覆盖 4 个碱基的位点的比例Coverage at least 4/%Phred 数值大于 20 的碱基比例Q20/%Phred 数值大于 30 的碱基比例Q30/%碱基 G 和C 的含量GC/%YZ811 134 196 10011 134 054 80099.0023.8182.4679.0697.5793.3144.60GCWR14 338 273 20014 338 088 70098.6528.8285.2682.6797.7893.7944.23H-pool5 067 688 2005 067 637 20099.0411.3682.2774.0897.1192.1543.59L-pool4 969 848 3004 969 806 00099.0211.4381.8174.1497.1492.1343.61生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.8178能的候选基因列表取交集，得到 78 个共有基因，这些基因即为与株高潜在相关的候选基因。将 78 个基因在 GO、KEGG、Uniprot、eggNOG数据库中进行功能注释以缩小候选基因的选区范围（表 4）。在所有注释到的高质量 nsSNPs 和 upstream类 SNP 中 分 别 有 15 个 nsSNP 和 20 个 upstream 类SNP 都位于相同的 5 个基因内，这些位点的（SNP-index）均等于 1。此外，这 5 个基因还包含有 6 个（InDel-index）=1 的 upstream 类 InDels，其 具 体的功能注释信息如表 5 所示。LOC_Os07g02770 在参考基因组中被注释为含有 F-box 结构域的蛋白，这是一类广泛分布于真核生物中的蛋白，具有丰富的多样性，以参与泛素化蛋白酶体途径为主要功能。LOC_Os07g02850 被注释为含 DUF538 结构域的蛋白，该类蛋白为植物所独有，在双子叶植物与单子叶植物中均有分布。目前，已鉴定到相当数量的DUF538 类蛋白，但其具体的生物学功能仍然未知。LOC_Os07g04220 被注释为与水稻中唯一的红光和远红光感受器光敏色素信号通路相关的受体类激酶。LOC_Os07g05050 被注释为含有 DEAD-box 结构SNP-index1.00.80.60.40.20.0Chr.1Chr.2Chr.3Chr.4Chr.5Chr.6Chr.7Chr.8Chr.9Chr.10 Chr.11Chr.12Chr.12L-pool Manhattanplot?ChromosomeH-pool Manhattanplot1.00.80.60.40.20.0SNP-indexChr.1Chr.2Chr.3Chr.3SNP-indexChr.1Chr.2Chr.4Chr.4?ChromosomeChr.6Chr.6?ChromosomeChr.5Chr.5Chr.7Chr.7Chr.8Chr.8Chr.9Chr.9Chr.10Chr.10Chr.11Chr.11Chr.12Chr.12Chr.12Chr.121.00.50.0-0.5-1.0Manhattan plot3.205Mb1.311MbABC图 3 基于 BSA-seq 分析的矮株（A）和高株（B）的 SNP-index 图以及（SNP-index）图（C）Fig.3 SNP-index graphs of bulk-L（A）and bulk-H（B）,as well as（SNP-index）graph（C）based on BSA-seq analysis2023,39(8)179吴元明等：基于 BSA-seq 和 RNA-seq 挖掘水稻株高相关 QTL 域的蛋白，其广泛分布于动物与植物中，在植物中的已知主要功能是参与对多种胁迫因素的响应过程。LOC_Os07g05720 的产物是功能和作用机制已知的OsTCP21 转录因子蛋白。2.5 关联区间内候选基因表达模式分析与验证对已有的株高转录组数据（GH998MU_S 和GH998WT_S）进行分析，结果（图 5）表明，两种分子标记筛选到的 78 个共有基因中，有 54 个在InDel-index1.00.80.60.40.20.0Chr.1Chr.2Chr.3Chr.4Chr.5Chr.6Chr.7Chr.8Chr.9Chr.10 Chr.11Chr.12Chr.12L-poolmanhattanplot?ChromosomeH-pool manhattanplot1.00.80.60.40.20.0Chr.1Chr.2Chr.3Chr.3 InDel-indexChr.1Chr.2Chr.4Chr.4?ChromosomeChr.6Chr.6?ChromosomeChr.5Chr.5Chr.7Chr.7Chr.8Chr.8Chr.9Chr.9Chr.10Chr.10Chr.11Chr.11Chr.12Chr.12Chr.12Chr.121.00.50.0-0.5-1.0Manhattan plot2.848Mb1.292MbInDel-indexABC图 4 基于 BSA-seq 分析的矮株（A）和高株（B）的 InDel-index 图以及（InDel-index）图（C）Fig.4 InDel-index graphs of bulk-L（A）and bulk-H（B）,as well as（InDel-index）graph（C）based on BSA-seq analysis表 3 （SNP-index）和（InDel-index）定位与株高相关的候选基因组区段Table 3 Candidate genome regions related to plant height mapping by （SNP-index）and （InDel-index）染色体Chromosome起始位置 Start/bp终止位置End/bp大小 Size/Mb基因数量Gene number712 848 0002.848141103 796 0015 088 0001.292135总计 Total-4.140276生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.8180转录组数据中可以找到。其中，编码 F-box 蛋白的LOC_Os07g02770（Os07g0118900）和编码 OsTCP21转录因子的 LOC_Os07g05720（Os07g0152000）在转录组数据中呈现差异表达，而剩余 3 个基因在转录组数据中表达量较低且无明显差别。为了检验候选基因的表达模式，利用两种极端性状个体的总 RNA 进行 RT-qPCR 试验。结果（图6）显示，5 个基因的表达模式在两种个体中均呈差异性表达，表明它们在株高调控过程中均具有一定的功能。3 个基因（LOC_Os07g02770、LOC_Os07g04220 和 LOC_Os07g05720）在矮株中的表达量上调，说明这些基因促进了矮株的形成。2 个基因（LOC_Os07g02850 和 LOC_Os07g05050）则 在高株个体中表达量更高，表明其参与株高的正向调控。此外，在 5 个用于 RT-qPCR 验证试验的基因中，LOC_Os07g05720 的产物为功能已知的 TCP 家族的转录因子，与 miRNA 互作以负向调控株高。该基因的 RT-qPCR 验证结果与已有研究相一致，证明本研究中 BSA-seq 结果的可靠性。3 讨论3.1 InDels与