化学酶法对硫酸软骨素类多糖的定量分析.pdf

第 卷 第期 年月合 肥 工 业 大 学 学 报(自 然 科 学 版)J OUR NA LO FHE F E IUN I V E R S I T YO FT E C HN O L O G Y(NA TUR A LS C I E N C E)V o l N o J u l 收稿日期:;修回日期:基金项目:国家自然科学基金资助项目()作者简介:陈婷婷(),女,安徽蚌埠人,合肥工业大学硕士生;周贤轩(),男,湖南湘西人,博士,合肥工业大学教授,硕士生导师;石春红(),女,安徽合肥人,博士,合肥工业大学助理研究员,通信作者,E m a i l:h f u t e d u c n D O I:/j i s s n 化学酶法对硫酸软骨素类多糖的定量分析陈婷婷,李文静,杨桂霞,周贤轩,石春红(合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 )摘要:硫酸软骨素(c h o n d r o i t i ns u l f a t e,C S)类多糖是一类具有多种临床治疗作用的糖胺聚糖.在硫酸软骨素裂解酶作用下,软骨素中葡糖醛酸和N 乙酰半乳糖胺之间的糖苷键发生断裂,可生成不饱和二糖.微生物发酵生产软骨素过程中,多糖定量往往需经过多次纯化以及使用昂贵的仪器进行检测,过程繁琐.文章研究偶联了专一性的酶解法与蒽酮硫酸法,快速测定复杂培养液中的软骨素类多糖质量浓度.该方法通过超滤去除单糖等小分子杂质后,将多糖用专一性硫酸软骨素裂解酶分解为寡糖,再通过超滤去除大分子杂质,得到的寡糖过滤液使用蒽酮硫酸法快速测定多糖质量浓度.该多糖定量方法可以选择不同特异性的裂解酶,适用于复杂培养液中其他多糖的快速定量分析.关键词:硫酸软骨素(C S);软骨素;定量;酶解;蒽酮硫酸法;超滤中图分类号:Q 文献标志码:A文章编号:()C h e m o e n z y m a t i cq u a n t i f i c a t i o no f c h o n d r o i t i ns u l f a t ep o l y s a c c h a r i d e sCHE NT i n g t i n g,L IW e n j i n g,YANGG u i x i a,Z HOUX i a n x u a n,S H IC h u n h o n g(S c h o o l o fF o o da n dB i o l o g i c a lE n g i n e e r i n g,H e f e iU n i v e r s i t yo fT e c h n o l o g y,H e f e i ,C h i n a)A b s t r a c t:C h o n d r o i t i ns u l f a t e(C S)a n d i t sd e r i v a t i v e s a r e ak i n do f g l y c o s a m i n o g l y c a nw i t hv a r i o u s c l i n i c a l t h e r a p e u t i ce f f e c t s C S l y a s ec a na c to nt h eg l y c o s i d i cb o n db e t w e e ng l u c u r o n i ca c i da n dN a c e t y l g a l a c t o s a m i n e i nC St og e n e r a t eu n s a t u r a t e dd i s a c c h a r i d e s T h ec o n c e n t r a t i o nd e t e r m i n a t i o no fc h o n d r o i t i np r o d u c e d f r o mm i c r o b i a l f e r m e n t a t i o nr e q u i r e s s e v e r a l s t e p so f p u r i f i c a t i o na n d t h e e m p l o y m e n to f e x p e n s i v ee q u i p m e n t,w h i c h i sv e r yc u m b e r s o m e I nt h i ss t u d y,t h ec o u p l i n go f s p e c i f i ce n z y m a t i ch y d r o l y s i sa n da n t h r o n e s u l f u r i ca c i dm e t h o dw a sc a r r i e do u t t od e t e r m i n et h ec h o n d r o i t i nc o n c e n t r a t i o n i nt h e c o m p l e xc u l t u r em e d i u mc o n v e n i e n t l y T h e s m a l lm o l e c u l a r i m p u r i t i e s,i n c l u d i n gm o n o s a c c h a r i d e s,w e r er e m o v e db yu l t r a f i l t r a t i o n T h e n,t h ep o l y s a c c h a r i d ew a se n z y m a t i c a l l y l y z e d i n t oo l i g o s a c c h a r i d e s,f o l l o w e db yr e m o v i n gm a c r o m o l e c u l a r i m p u r i t i e sv i au l t r a f i l t r a t i o na g a i n T h ec o n c e n t r a t i o no fo b t a i n e do l i g o s a c c h a r i d ef i l t r a t ew a st h e nq u i c k l yd e t e r m i n e db yt h ea n t h r o n e s u l f u r i ca c i dm e t h o d A c c o r d i n gt o t h e s p e c i f i c i t yo f t h e l y a s e a c t i o n,t h i sm e t h o dc a na l s ob e a p p l i e d t o t h eq u a n t i f i c a t i o no fo t h e rp o l y s a c c h a r i d e s i nac o m p l e xc u l t u r em e d i u mK e yw o r d s:c h o n d r o i t i ns u l f a t e(C S);c h o n d r o i t i n;q u a n t i f i c a t i o n;e n z y m a t i ch y d r o l y s i s;a n t h r o n e s u l f u r i ca c i dm e t h o d;u l t r a f i l t r a t i o n硫酸软骨素(c h o n d r o i t i ns u l f a t e,C S)是一类广泛存在于动物结缔组织中的酸性糖胺聚糖类大分子多糖,在生物体内多以蛋白聚糖侧链形式存在 .硫酸软骨素及软骨素的碳链骨架由葡糖醛酸(G l c A)和N 乙酰半乳糖胺(G a l NA c)以,和,糖苷键(G l c A ,G a l NA c )交替连接而成的重复二糖单元组成,一般有二糖单元 个 .软骨素经硫酸化后得到硫酸软骨素,根据其硫酸化位点的不同,可以将硫酸软骨素分为以下不同类型:硫酸化发生在G a l NA c的C 位、G a l NA c的C 位羟基上的分别是硫酸软骨素A、硫酸软骨素C;硫酸软骨素E的G a l NA c的C 位和C 位羟基均发生硫酸化;硫酸软骨素B一般称为硫酸皮肤素(D S),其结构是硫酸软骨素A中G l c A被艾杜糖醛酸取代.硫酸软骨素因其结构多样性而具有各种不同功能,硫酸软骨素及其低分子量衍生物在治疗风湿病、骨质疏松症、关节炎、腰间盘突出等方面具有重要作用 .硫酸软骨素裂解酶(C h S a s e)可以将硫酸软骨素、透明质酸等糖胺聚糖裂解为不饱和二糖及寡糖,主要存在于微生物中.根据其作用底物的不 同 可 以 分 为C h S a s e A B C、C h S a s e A C、C h S a s eB、C h S a s eC等类型.其中:C h S a s eA B C可以降解硫酸软骨素A、硫酸软骨素B、硫酸软骨素C及透明质酸;C h S a s eA C可将软骨素、硫酸软骨素A、硫酸软骨素C及透明质酸降解为不饱和二糖和寡糖;C h S a s eB可以降解硫酸软骨素B和透明质酸;C h S a s eC严格作用于硫酸软骨素C和透明质酸.本研究使用的裂解酶A s C h n A C酶解机制同C h S a s eA C,是一种硫酸软骨素A C外切酶.本研究提供了一种复杂培养液中软骨素类多糖质量浓度的定量检测方法,通过多糖酶解与蒽酮硫酸法相结合,测定软骨素类多糖质量,测定过程如图所示.首先通过超滤去除培养基中小分子杂质,再用相应的裂解酶将多糖分解为不饱和二糖或寡糖,这些低分子量糖可经超滤截留住大分子杂质,最后结合蒽酮硫酸法测定糖质量浓度.图化学酶法定量示意图材料与方法 实验材料 菌株大肠杆菌B L 、大肠杆菌K k f o E、大肠杆菌E c N k f i A K a n、大肠杆菌E c N、大肠杆菌B L /p E T a()A s C h n A C,均 由 本 实 验 室保存.材料与试剂硫酸软骨素C、异 丙基 D 硫代 半 乳 糖 苷(I P T G)、三羟甲基氨基甲烷(T r i s)、氯化钠、咪唑、苯甲基磺酰氟(PM S F)、蒽酮、浓硫酸、重水(DO)、B r a d f o r d试剂、丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠(S D S)、过硫酸铵(A P S)、T EME D、超滤管、透析袋等.实验方法 诱导纯化硫酸软骨素裂解酶A s C h n A C将携带表达硫酸软骨素裂解酶A s C h n A C质粒的大肠杆菌B L /p E T a()A s C h n A C单克隆过夜培养并转移到L新鲜L B培养液中,振荡培养至A .加 Lm o l/LI P T G于 过夜诱导.诱导后的菌液在转速 r/m i n下 离心 m i n,收集菌体.用B u f f e r A(mm o l/L T r i s,mm o l/L N a C l,mm o l/L咪 唑)重 悬 菌 体.向 上 述 溶 液 加 mm o l/LPM S F后超声破碎,破碎的细胞液于 r/m i n、离心 m i n,收集上清液.上清液以m L/m i n的流速通过N i NT A柱,用B u f f e r A(mm o l/L T r i s,mm o l/L N a C l,mm o l/L咪 唑)洗 杂,B u f f e r B(mm o l/LT r i s,mm o l/L N a C l,mm o l/L咪 唑)洗脱.在 mm o l/LT r i s、mm o l/LN a C l溶液中透析,收集蛋白组分.纯化后的蛋白进行S D S P AG E电泳,并使用B r a d f o r d法测其蛋白质量浓度.蒽酮硫酸法样品与蒽酮反应试剂(含 蒽酮和 浓硫酸)以体积比混匀,每种样品设置个平行组,将混合液于 水浴 m i n、冰浴 m i n,测定 n m处吸光度值.硫酸软骨素C标准曲线的绘制称取 硫 酸 软 骨 素C溶 于d d HO,配 制 成 m g/m L的母液,将硫酸软骨素C稀释至、m g/m L,每个质量浓度梯度设置个平行组,蒽酮硫酸法测 n m处吸光度值,O r i g i n P r o绘制标准曲线,计算线性回归方程.A s C h n A C裂解硫酸软骨素C定量分析将 m g/m l硫酸软骨素C(溶于 mm o l/LT r i s HC l,p H值 为)与 m g/m L A s 合肥工业大学学报(自然科学版)第 卷C h n A C等体积混合,在 下分别水浴反应、m i n,煮沸m i n,g离心m i n,收集上清液.取 L上清液加入 m L k D a超滤管,g离心 m i n,收集过滤液.倒置超滤管,g离心m i n,收集浓缩液.蒽酮硫酸法测硫酸软骨素C质量.核磁共振氢谱分析称取 m g硫酸软骨素C溶于 LDO,将待测样品装入 mm核磁管进行核磁共振氢谱(p r o t o nn u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e,H NMR)检测.分别称取 m g硫酸软骨素C溶于 m LL B培养液和m LB L 菌液上清,干燥完全后,溶于 L DO,将待测样品装入 mm核磁管进行H NMR检测.质谱分析将 m g/m L硫酸软骨素C与 m g/m LA s C h n A C等体积混合,水浴反应 h.反应液于 煮沸m i n,g离心m i n,收集上清.上清用透析膜(MWC Ok D a)在去离子水中透析h.将上述样品进行质谱分析.硫酸软骨素C和软骨素质量浓度测定分别 挑 取 大 肠 杆 菌K k f o E、大 肠 杆 菌E c N、大肠杆菌E c N k f i A K a n单克隆于m LM C中,振荡过夜.分别将上述菌液按的量转接至 m L M C中,振荡培养约 h.菌液于 r/m i n离心 m i n收集上清.称取硫酸软骨素C溶于E c N k f i A K a n菌液上清中配制成 m g/m L的溶液.分别取m L上述硫酸软骨素C溶液、K k f o E菌液上清、E c N菌液上清、E c N k f i A K a n菌液上清与 L mm o l/LT r i s HC l(p H值为)溶液混匀.混匀后分别用 m滤器过滤,以去 除 残 余 菌 体.取 上 述 过 滤 后 的 溶 液 加 入 k D a m L超滤管,一次 L,g离心 m i n后弃滤液,重复此过程直至m L溶液加完.加 L mm o l/LT r i s HC l,g离心 m i n,重复次,去除培养液中小分子杂质.向超滤管 加 L mm o l/L T r i s HC l(p H值为),冲洗膜两侧,倒置超滤管,g离心m i n,再加 mm o l/LT r i s HC l(p H值为)定容至 L.加 Lm g/m L A s C h n A C于定容后的溶液中,水浴反应 h后,煮m i n,g离心m i n,收集上清.将上清加入 k D a m L超滤管,g离心 m i n,得到过滤液.过滤液干燥完全,加 Ld d HO重悬,重悬液用蒽酮硫酸法测其多糖质量浓度.样品损失率及软骨素质量浓度的计算以硫酸软骨素C溶液计算样品损失率,公式如下:损失率 A .软骨素质量浓度计算公式为:软骨素A (损失率).结果与分析 H NMR结果分析将硫酸软骨素C进行H NMR检测,结果如图所示.图硫酸软骨素C的H NMR分析从图可以看出,图谱无杂峰,且C SC共有个特征峰,其中化学位移在 处是硫酸软骨素C中N 乙酰基甲基的特征峰,通常可以用来粗略定量该糖质量.L B培养液中硫酸软骨素C的核磁共振图谱和大肠杆菌B L 培养液中硫酸软骨素C的核磁共振图谱与硫酸软骨素C标准品的图谱对比,发现复杂培养基中的硫酸软骨素C的核磁共振图谱有较多杂峰,特别是N 乙酰基甲基的特征峰信号受到严重干扰,说明其中复杂成分干扰了NMR对硫酸软骨素C的定量分析.因此,H NMR法不能用于测定复杂培养基第期陈婷婷,等:化学酶法对硫酸软骨素类多糖的定量分析L B培养液中的硫酸软骨素C质量浓度.硫酸软骨素裂解酶的诱导表达与纯化将表 达 得 到 的 蛋 白 收 集 纯 化,进 行S D S P AG E电泳,A s C h n A C酶蛋白S D S P AG E分析结果 如 图所 示,图中:泳 道为P r o t e i nM a r k e r;泳道为A s C h n A C蛋白.由图可知,纯化后得到较单一的目的蛋白,纯化后收集的A s C h n A C蛋白用B r a d f o r d法测得,其质量浓度为m g/m L.图A s C h n A C酶蛋白S D S P A G E电泳图 硫酸软骨素C标准曲线绘制浓硫酸将多糖水解为单糖,与蒽酮反应生成深绿色复合物,在 n m处有最大吸光度值,吸光度值与糖质量存在明显线性关系.以硫酸软骨素C质量为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线.硫酸软骨素C的标准曲线如图所示.图硫酸软骨素C标准曲线由图可知,在所测质量浓度范围内,硫酸软骨素C质量与吸光度值呈正相关.硫酸软骨素C裂解的定量分析硫酸软骨素C在不同消化时间点超滤收集的寡糖质量如图 a所示.由图 a可知,硫酸软骨素C与A s C h n A C裂解酶等体积混合,于 水浴反应不同时间,酶解液上清经超滤得到的过滤液用蒽酮硫酸法定量.硫酸软骨 素C在被A s C h n A C分 解 m i n后 寡 糖 质 量 不 再 明 显增加.倒置超滤管得到未被分解的硫酸软骨素C,未分解的硫酸软骨素C质量占总硫酸软骨素C质量的比例与时间呈负相关,如图 b所示.由图 b可知,随时间的增加,未分解的硫酸软骨素C质量占总硫酸软骨素C质量的比例逐渐下降,表明硫酸软骨素C被A s C h n A C裂解为寡糖.在酶解 m i n后,酶解率可达 .图不同消化时间硫酸软骨素C定量分析 硫酸软骨素C和软骨素质量浓度分析硫酸软骨素C经A s C h n A C酶解后的质谱分析如图所示.由图可知,所得实测二糖的m/z值为 、,符合 预期二糖的m/z值(和 ).质谱分析结果显示,高分子硫酸软骨素被酶切成了二糖,其他寡糖成分极少,在质谱分析中没有明显信号.通过A s C h n A C酶解法和蒽酮硫酸法,测定了复杂培养基中的硫酸软骨素C质量浓度以及E c N、K k f o E菌株上清液中未纯化的软骨素质合肥工业大学学报(自然科学版)第 卷量浓度.大肠杆菌E c N k f i A K a n为敲除了k f i A基因的E c N菌株,为本实验室保存.由于k f i A基因的敲除,该菌株无法合成荚膜多糖,因此可以作为阴性对照.以硫酸软骨素C标准品溶液作为外标,反映了待测样品的损失率,根据损失率算出软骨素类多糖的质量浓度如图所示.图硫酸软骨素C酶解后质谱分析图培养液中软骨素类多糖的质量浓度将硫酸软骨素C溶液的A 代入损失率计算公式,得到损失率为 .将E c N、K k f o E上清的A 代入软骨素质量浓度计算公式,得到E c N上清中软骨 素类多糖质 量浓度 为 m g/L,K k f o E上清中软骨素的质量浓度为 m g/L.讨论硫酸软骨素的传统制备方法主要是从动物的软骨组织中提取,存在结构不均匀、动物源致病菌等问题.软骨素与大肠杆菌K 的荚膜多糖结构类似.近年来,通过微生物发酵生产软骨素,并进一步制备出硫酸软骨素,逐渐成为研究热点.该方案具有潜在的显著降低成本、低污染、工艺简单、产品质量稳定等优点.大肠杆菌K 是软骨素类似物的主要生产菌株,其产物是果糖软骨素.本研究使用敲除了k f o E基因的K k f o E菌株,其产物去除了该菌荚膜多糖中的果糖基团,是制备硫酸软骨素的重要原材料.但是在测定该菌产生的软骨素质量时,微生物培养液中的复杂成分(如培养基单糖成分、代谢产物、肽聚糖成份等)会干扰软骨素多糖的定量分析.因此,有必要开发一种方法快速定量检测发酵液中硫酸软骨素类多糖质量浓度.硫酸软骨素的分子量范围为 k D a,A s C h n A C酶蛋白属于硫酸软骨素裂解酶A C,在葡糖醛酸C 位断裂,糖苷键,生成不饱和双键,.本文使用专一性的酶解方法去除杂质的干扰,结合蒽酮硫酸法可以简便准确地测定复杂培养液中的多糖质量浓度.使用截留分子量为 k D a的超滤管先将培养液中的小分子干扰物去除,再用裂解酶A s C h n A C将硫酸软骨素类多糖降解为不饱和寡糖.通过超滤得到寡糖过滤液,进一步排除了大分子杂质的干扰,最后使用蒽酮硫酸法可以方便地测出软 骨素类多糖 质量浓度.该方法提供了一种发酵液中软骨素类多糖质量浓度的定量检测方法.该方法偶联了酶专一性分解软骨素与化学分析方法,只需通过个步骤,即可将复杂成分中造成定量干扰的小分子、大分子杂质去除,可以快速地测定复杂培养液中的软骨素类多糖质量浓度.该方法具有普适性,利用不同专一性的多糖裂解酶,该方法也可以扩展使用于其他多糖的定量分析.参考文献VA R K IA,C UMM I N G SR D,A E B IM,e ta l S y m b o ln o m e n c l a t u r e f o r g r a p h i c a l r e p r e s e n t a t i o n s o f g l y c a n sJ G l y c o b i o l o g y,():R E S TA I N OOF,F I NAMO R ER,D I ANAP,e t a l Am u l t i a n a l y t i c a l a p p r o a c ht ob e t t e r a s s e s s t h ek e r a t a ns u l f a t e c o n t a m i n a t i o n i na n i m a l o r i g i nc h o n d r o i t i ns u l f a t eJ A n a l y t i c aC h i m i c aA c t a,:C I M I N ID,D E R O S A M,V I G G I AN IA,e ta l I m p r o v e df r u c t o s y l a t e dc h o n d r o i t i np r o d u c t i o nb yk f o Co v e r e x p r e s s i o ni nEc o l iK J J o u r n a lo fB i o t e c h n o l o g y,():D E AN G E L I SPL,P A D G E T T MC C U E AJ I d e n t i f i c a t i o na n dm o l e c u l a rc l o n i n go fac h o n d r o i t i ns y n t h a s ef r o mP a s t e u r e l l am u l t o c i d at y p eFJ T h eJ o u r n a lo fB i o l o g i c a lC h e m i s t r y,():S UGAHA R AK,M I KAM IT,UYAMAT,e t a l R e c e n t a d 第期陈婷婷,等:化学酶法对硫酸软骨素类多糖的定量分析v a n c e s i nt h es t r u c t u r a lb i o l o g yo fc h o n d r o i t i ns u l f a t ea n dd e r m a t a ns u l f a t eJ C u r r e n tO p i n i o n i nS t r u c t u r a l B i o l o g y,():T R OWB R I D G EJM,GA L L O RL D e r m a t a ns u l f a t e:n e wf u n c t i o n s f r o ma no l dg l y c o s a m i n o g l y c a nJ G l y c o b i o l o g y,():HAN W,WAN G W,Z HA O M,e ta l A n o v e le l i m i n a s ef r o m a m a r i n eb a c t e r i u m t h a td e g r a d e s h y a l u r o n a n a n dc h o n d r o i t i ns u l f a t eJ J o u r n a lo fB i o l o g i c a lC h e m i s t r y,():L IL,L IY,I J A Z M,e ta l R e v i e wo nc o m p l e m e n ta n a l y s i sm e t h o da n dt h er o l e so fg l y c o s a m i n o g l y c a n s i nt h ec o m p l e m e n ts y s t e mJ C a r b o h y d r a t e P o l y m e r s:S c i e n t i f i ca n dT e c h n o l o g i c a lA s p e c t so fI n d u s t r i a l l yI m p o r t a n tP o l y s a c c h a r i d e s,:L I UJ,P E D E R S E NLC A n t i c o a g u l a n th e p a r a ns u l f a t e:s t r u c t u r a l s p e c i f i c i t ya n db i o s y n t h e s i sJ A p p l i e dM i c r o b i o l o g ya n dB i o t e c h n o l o g y,():Z HA N GQ,L I J,L I UC,e t a l P r o t e c t i v e e f f e c t s o f l o wm o l e c u l a rw e i g h t c h o n d r o i t i ns u l f a t eo na m y l o i db e t a(A)i n d u c e dd a m a g e i nv i t r oa n di nv i v oJ N e u r o s c i e n c e,:L IY,C HE NZY,Z HOUZ,e ta l E x p r e s s i o n,p u r i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fGA P DH C h S a s eA B CIf r o mP r o t e u sv u l g a r i si nE s c h e r i c h i ac o l iJ P r o t e i nE x p r e s s i o na n dP u r i f i c a t i o n,:Y I NFX,WAN GFS,S HE N GJZ U n c o v e r i n gt h ec a t a l y t i cd i r e c t i o no f c h o n d r o i t i nA Ce x o l y a s e:f r o mt h e r e d u c i n ge n dt o w a r d st h en o n r e d u c i n ge n dJ J o u r n a lo fB i o l o g i c a lC h e m i s t r y,():C HE NL,S H ICQ,Y I NFX,e t a l C l o n i n ga n dc h a r a c t e r i z a t i o no f a c h o n d r o i t i nA Ce x o l y a s e f r o mA r t h r o b a c t e rs p S D JM o l e c u l a r B i o t e c h n o l o g y,():YUYY,Y EHF,WUDD,e t a l C h e m o e n z y m a t i c q u a n t i f i c a t i o nf o r m o n i t o r i n gu n p u r i f i e dp o l y s a c c h a r i d ei nr i c hm e d i u mJA p p l i e d M i c r o b i o l o g y a n d B i o t e c h n o l o g y,():K I E L KO P FCL,B AU E R W,UR B A T S C HIL B r a d f o r da s s a yf o r d e t e r m i n i n g p r o t e i n c o n c e n t r a t i o nJ C o l dS p r i n gH a r bP r o t o c,():L AMA R IF N,KA R AMAN O SN K S t r u c t u r eo fc h o n d r o i t i ns u l f a t eJ A d v a n c e si nP h a r m a c o l o g y,:RA I N S F O R DKD I m p o r t a n c eo f p h a r m a c e u t i c a l c o m p o s i t i o na n de v i d e n c ef r o mc l i n i c a lt r i a l sa n dp h a r m a c o l o g i c a ls t u d i e s i nd e t e r m i n i n ge f f e c t i v e n e s s o f c h o n d r o i t i ns u l p h a t ea n do t h e rg l y c o s a m i n o g l y c a n s:ac r i t i q u eJ T h eJ o u r n a lo fP h a r m a c ya n dP h a r m a c o l o g y,():R O D R I GU E Z M L,J ANNB,J ANN K S t r u c t u r ea n ds e r o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so ft h ec a p s u l a r K a n t i g e n o fE s c h e r i c h i ac o l iO:K:H,a f r u c t o s e c o n t a i n i n gp o l y s a c c h a r i d ew i t hac h o n d r o i t i nb a c k b o n eJ E u r o p e a nJ o u r n a lo fB i o c h e m i s t r y,():S C H I R A L D IC,C I M I N ID,R O S A M D P r o d u c t i o no fc h o n d r o i t i ns u l f a t ea n dc h o n d r o i t i nJ A p p l i e dM i c r o b i o l o g ya n dB i o t e c h n o l o g y,():L I UJ,YAN GAH,L I UJ,e t a l K f o Ee n c o d e s a f r u c t o s y l t r a n s f e r a s e i n v o l v e di nc a p s u l a rp o l y s a c c h a r i d eb i o s y n t h e s i si nE s c h e r i c h i ac o l iK J B i o t e c h n o l o g y L e t t e r s,():L I NHA R D TRJ,AV C IFY,T O I D A T,e ta l C Sl y a s e s:s t r u c t u r e,a c t i v i t y,a n da p p l i c a t i o n si na n a l y s i sa n dt h et r e a t m e n to fd i s e a s e sJ A d v a n c e si n P h a r m a c o l o g y,:(责任编辑闫杏丽)(上接第 页)阮永芬,刘岳东昆明盆地粉土的特性研究与利用J岩土力学,(增刊):肖军华,刘建坤,彭丽云,等黄河冲积粉土的密实度及含水率 对 力 学 性 质 影 响 J岩 土 力 学,():HO LM S GAA R DR,N I E L S E NBN,I B S E NLB I n t e r p r e t a t i o no fc o n ep e n e t r a t i o nt e s t i n gi ns i l t ys o i l sc o n d u c t e du n d e rp a r t i a l l yd r a i n e dc o n d i t i o n sJ J o u r n a lo fG e o t e c h n i c a la n d G e o e n v i r o n m e n t a lE n g i n e e r i n g,():K R A G ECP,D E J ON GJT I n f l u e n c eo fd r a i n a g ec o n d i t i o n sd u r i n gc o n ep e n e t r a t i o no nt h ee s t i m a t i o no fe n g i n e e r i n gp r o p e r t i e sa n dl i q u e f a c t i o np o t e n t i a lo fs i l t ya n ds a n d ys o i l sJ J o u r n a lo fG e o t e c h n i c a la n dG e o e n v i r o n m e n t a lE n g i n e e r i n g,():段海澎,余飞,戴张俊,等淮北平原浅表层沉积土承载力特征及其螺旋板检测评定方法研究J工程地质学报,():余亚男,余飞,戴张俊,等淮北平原典型地质体成因规律及工程 影 响 分 析 J科 学 技 术 与 工 程,():金权安徽淮北平原第四系M北京:地质出版社,:吴磊磊,吴道祥,叶磊,等静力触探估算安徽省沿江平原黏