基于DNA条形码技术甜瓜迷实蝇的分子鉴定.pdf

第 44 卷第 3 期2023 年 6 月喀什大学学报Journal of Kashi UniversityVol.44 No.3Jun.2023基于DNA条形码技术甜瓜迷实蝇的分子鉴定陈光辉1a,b,张小菊2，李焱3，王玉涛1a,b(1.喀什大学 a.生命与地理科学学院；b.新疆帕米尔高原生物资源与生态重点实验室，新疆 喀什 844000；2.乌鲁木齐海关技术中心，新疆 乌鲁木齐 830000；3.喀什海关技术中心，新疆 喀什 844000)摘要：以口岸截获的甜瓜迷实蝇蛹和成虫作为研究对象，提取其基因组 DNA，检索 ITS2、COI、COII、CYT-B基因引物，PCR扩增后产物用双脱氧法测序，结合 Genebank中的相关数据，借助生物信息学分析软件验证甜瓜迷实蝇分子鉴定序列，构建 NJ 系统进化树，分析遗传进化关系，以获得更多甜瓜迷实蝇快速鉴定的分子数据.结果表明，从甜瓜迷实蝇蛹和成虫中获得的 8 条序列，仅有 COI 基因达到鉴定标准；ITS2、COII、CYT-B 基因未达到鉴定标准，并非数据质量不合格，而是 NCBI 数据库相关数据不足.由于研究扩增模板相同，此类序列为新发掘的甜瓜迷实蝇的序列，从 NJ 系统进化树聚类分析可以看出，这些序列均可作为甜瓜迷实蝇分子鉴定序列.关键词：甜瓜迷实蝇；分子鉴定；DNA条形码技术中图分类号：S41-30文献标志码：A文章编号：2096-2134（2023）03-0049-070引言甜瓜迷实蝇（Myiopardalis pardalina），又称短脉咔实蝇，异名 Carpomya pardalina，属于双翅目(Diptera)、实蝇科(Tephritidae)、Myiopardalis 属.目前，甜瓜迷实蝇主要分布于东欧、中亚和北非的部分国家或地区，已经入侵了很多国家或地区1-4.研究表明，甜瓜迷实绳是一种危害葫芦科植物的世界性害虫1,2,5，对甜瓜、西瓜等瓜类植物的危害尤为突出，是非常危险的重大检疫性有害生物.防治甜瓜迷实蝇对新疆乃至全国瓜产业发展具有重要意义.甜瓜迷实蝇主要以幼虫蛀食瓜类果实6，以成虫产卵管刺入幼瓜表皮内产卵，幼虫孵化后即钻进瓜内蛀食，被害瓜先局部变黄，后腐烂变臭，造成大量落瓜；或刺伤处凝结着流胶，畸形下陷，果皮硬实，瓜味苦涩，品质下降3,7,8.若不加以管控甜瓜迷实蝇，其造成的损失极大，有时高达 90%1,9,10.近年来，甜瓜迷实蝇 Bigot 对瓜果的危害不断加重，其在世界范围内多地爆发，给瓜果产业带来毁灭性打击1.甜瓜迷实蝇已被列入我国 2007 年发布的 中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录，海关总署2019 年第 174 号公告中也明确将甜瓜迷实蝇作为重点检疫对象.有文献报道在新疆伊犁州霍尔果斯市莫乎尔片区幸福社区甜瓜地有零星甜瓜迷发生11.甜瓜迷实蝇越冬蛹能够在零下低温条件越冬，如若该虫传入并在新疆定殖，将严重阻碍新疆瓜果类等产业的发展.甜瓜迷实蝇的某些生物学特性决定了其具有极强的入侵能力.李大鹏等12参照 CLIMEX 和 ArcGIS 预测分析方法对甜瓜迷实蝇在我国不同区域的适生性进行了分析，结果表明，该虫在我国多地具有较强的适生性；在新疆多地为中度适生，部分地区高度适生.在高加索、伊朗、土库曼斯坦等地13，该虫的蛹能够越过寒冬.甜瓜迷实蝇成虫始见于葫芦科植物开花坐果时期9，产卵周期长、产卵数量较大；幼虫持续时间长达 818 天，可在土壤或者瓜果内化蛹，每年能持续完整的 3 个世代或更多，世代重叠较为严重1,14；在实验室条件下，给予合适的食物，成虫生命周期会更长15，雌雄成虫的配偶有多个，即多配偶交配现象1.交配特性研究为后期使用雄性不育技术和性引诱剂控制甜瓜迷实蝇提供技术支持16.甜瓜迷实蝇防除较为困难.雌成虫将卵产在果实表皮以下、幼虫在果实中钻蛀为害，化学药剂无法深入果实内毒杀害虫，且成虫易受惊扰，喷洒药剂时虫受惊扰逃走，待药剂喷洒完后又飞回危害瓜果，从而增加了化学药品防治的难度7，同时也带来了农药污染环境的问题.此外，甜瓜迷实蝇成虫善于飞行，具有较强的迁飞扩散能力，加大了入侵扩散的风险.化学农药在短期内能够起到防治效果，但仅是权宜之计，不能长久，而且后患无穷17,18.因此，需要从源头上强化检疫和预警监测，注意抓早抓小，坚持“预防为主，防治结合”的方针，综合运收稿日期：2022-12-12基金项目：新疆帕米尔高原生物资源与生态自治区重点实验室开放课题“实蝇（以甜瓜迷实蝇为例）鉴定和远程监测及农残监测装备开发”(XJDX1714-2021-06).作者简介：陈光辉（1985-），男，河南漯河人，讲师，硕士研究生，主要从事动物遗传进化和动植物检验检疫方面的研究.通讯作者：王玉涛，男，教授，博士.E-mail:DOI：10.13933/ki.2096-2134.2023.03.010喀什大学学报第 44 卷用各种先进防控技术手段是阻断甜瓜迷实蝇传播扩散、减少瓜果产业经济损失的有效对策.监测方面要注重发现目标物种，为预警和准确掌握疫情发生动态、除害及防控等提供科学依据，做到早发现、早预警、早根除，防患于未然.19如 20152016 年哈萨克斯坦通过加强检疫措施来防控甜瓜迷实蝇虫害20.有效的发现是后续防控的基础，高效的监测和检测技术是有效发现目标物种的前提，即高效识别鉴定甜瓜迷实蝇是监测预警的基础.对监测预警来说，目前存在的问题较多，如依赖于传统形态学鉴定方法，快速准确鉴定较为困难，主要表现为口岸专业人员缺乏、实验环境条件不具备、虫体不同发育期形态特征不完全、口岸距离远样品寄送周期长、远程鉴定系统图像采集特征不到位等，造成不能实现快速准确鉴定和有效监测预警，严重阻碍商品流通速度和经济贸易发展.本研究利用的DNA 条形码技术能够摆脱标本、专家、时空等带来的局限，实现对甜瓜迷实蝇的快速准确鉴定.DNA 条形码是由 Tautz、Hebert 和 Ward 等21-24科学家提出，在多个物种中得到了广泛应用，并且有良好的鉴定效果.该方法的总体思路是利用序列分析和数学模型25,26发现具有足够变异的标准化短基因片段（兼具保守性和变异性）来鉴定物种27.不同类群不同基因的差异情况不同，选择具有足够差异的基因来区分物种，例如用昆虫线粒体基因 COI、COII 鉴定物种28，许多物种COI 序列的种内遗传距离约是种间遗传距离的 1/10，大多小于 2%，能够较好的区分种和种群关系，因此 COI 被广泛地用于动物类群中种和种群关系的分析23-24,29-31.不同的基因面临的选择压力不同，例如 ITS 基因面临的选择压力相对小，变异相对较大，造成 ITS 基因种内遗传差异相对较高，更适用于物种特别是种群间的研究32.关于甜瓜迷实蝇 DNA 条形码数据相对较少，有待进一步发掘.而不同区域种群因环境造成的极其微小差异（从形态上无法区分时）可以从分子数据中表现出来，通过这些分子数据差异可以推断该虫的入侵路线、转入时间等.本研究基于 DNA 条形码技术，对重要检疫性有害生物甜瓜迷实蝇 DNA 条形码数据进行挖掘，以期实现对甜瓜迷实蝇的快速准确鉴定.同时，对甜瓜迷实蝇的多个目标基因进行序列挖掘，以克服在进行目标 DNA序列扩增和比对时常会出现的某个基因扩增不出来等无法鉴定的情况，发掘多个不同的基因序列作为 DNA条形码，对甜瓜迷实蝇的快速准确鉴定很有帮助.1材料与方法1.1主要设备尼康数码体视荧光显微镜（Nikon digital microscopeSMZ25）、梯度 PCR 仪（Biometra TProfessional）、低温高速离心机（贝克曼 X-22R Centrifuge）、制冰机（SANYO IceMaker SIM-F140AY65）、振荡器（IKA MS3 digital）、恒温水浴锅、水平电泳槽（美国 Bio-Rad）、电泳仪（JY1600C）、凝胶成像仪（伯乐 Doc XR+凝胶成像系统）等.1.2标本采集和保存甜瓜迷实蝇标本于 2019 年 78 月从喀什海关辖区口岸旅客携带的甜瓜中截获.成虫样本获得：将含有蛹的甜瓜放置在潮湿沙土上，并外罩养虫笼，保证孵化成虫不能逃逸，用皮筋和纱布将样品传递出入口捆扎严实，待蛹在室温下孵化后收集成虫.蛹样本获得：直接将甜瓜剖开，收集蛹样本.将样本保存于无水酒精中低温冷藏或冷冻保存，以备提取 DNA 使用.1.3核酸提取和目标片段扩增1.3.1核酸提取天根血液/细胞/组织基因组 DNA 提取试剂盒（离心柱型）提取样品 DNA，按照试剂盒（Cat.#DP304-02,RT（1520）说明书中步骤进行提取.1.3.2目标片段 PCR 扩增引物序列和参考文献在表 1 中列出33-36，引物来源有上海生工合成.PCR 扩增为 25 L 体系，其中包含有Taq 酶 1.5 U，dNTP 0.25 mmol/L，1PCR buffer，Mg2+2.0mmol/L，上下游引物各为 0.3 mol/L，DNA 模板 50 ng.PCR 反应程序为：热盖温度 105，预变性温度 95 时间 5 min；40 次循环包括三个步骤：变性 95 45 s，退火45 1 min，延伸 72 1 min；以上循环结束后再进行延伸 72 7 min.PCR 产物直接冷链快速物流至安徽通用生物技术公司进行双脱氧测序.表 1PCR 扩增引物设计及其参考文献基 因ITS2COICOIICYT-B引物名称CAS5p8sFcCAS28sB1dLCO1490HCO2198TL2-J-3037TD-N-3862CB-J-10933CB-N-11367引物序列(5-3)TGAACATCGACATTTYGAACGCACATTTCTTTTCCTCCSCTTAYTRATATGCTTAAGGTCAACAAATCATAAAGATATTGGTAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCAWTGGCAGAWTAGTGCAWTRRKKYMGWYTGACAWWCTAATGTTATTAYGTHYTACCNTGAGGNCAAATATCATWACWCCTCCTAATTTATTAGGAAT退火温度/45454545参考文献Ji et al,200334Kim and Lee,200835;Kamitanietal,201136Simon et al,199437Simon et al,1994371.4序列比对和系统树构建用 Lasergene7 软件中的 Seqman 将测序返回的核酸50第 3 期陈光辉，张小菊，李焱，王玉涛：基于 DNA 条形码技术甜瓜迷实蝇的分子鉴定序列进行峰图检查和双向拼接校对，然后将拼接好的序列在 NCBI 中 BLAST 比对，确定测得的序列为昆虫相关的目标基因序列，统计分析与该样本相关序列（ITS2、COI、COII、CYT-B）的相似度和覆盖度，较高时为可用序列.同时下载 GeneBank 中与甜瓜迷实蝇的 ITS2、COI、COII、CYT-B 序列相似性较高的其他种类的序列 12条，用 Clustal X 1.83 软件初步比对，保存为 MEGA 6.0 可读文件37,38并分析各序列之间碱基差异，采用 Kimura-2-Parameter 数据分析模型，用邻近法(NJ,Neighbour-Jioning)构建系统进化树，系统树各分支以 1 000 次循环估计系统树中节点的自举置信水平(Bootstrap confidence level，BCL)的重复检验39,40.2实验结果2.1甜瓜迷实蝇形态分类鉴定通过形态特征对甜瓜迷实蝇进行初步的形态鉴定41-43.成虫体长 5.46 mm(雄)，77.5 mm(雌).头部暗黄色，宽大于长.颜面斑不存在，额和侧额无银色斑；复眼长远大于宽；触角显著短于颜面长；喙短、呈头状花序.中胸背板浅黄色或褐色，两侧各具 5 个黑斑，基部后缘中央具 1 黑斑42.小盾片浅黄色，基部 2 侧及中部各具1 个黑斑，黑斑不达端部.各足腿节均不具暗色斑.腹部黄色到橙褐色，各节腹背板相互分离；第 35 节腹背板不具暗色中纵条，第 5腹背板不具腺斑43.2.2分子鉴定结果测 序 获 得 了 该 虫 蛹 和 成 虫 样 品 ITS2、COI、COII、CYT-B 基因的部分序列，依据表 2 中在 NCBI 数据库中查阅的相关序列的覆盖度、相似度最高的 GeneBank No.等信息进行鉴定.覆盖度较低且序列相似度较低时，确定为新的条形码序列；序列比对表明，ITS2、COII、CYT-B基因核酸序列与 NCBI 数据库中的序列相似度较低，数据库中未检索到高度相似序列，确定为该虫样品的新序列.本文获得的甜瓜迷实蝇核酸序列 8条，其中 COI基因2 条与已有报道的鉴定序列高度同源，其余 6 条在 NCBI中相似度较低，是未见报道的新序列.表 2NCBI比对结果中的同源序列基 因ITS2COICOIICYT-B鉴定参考覆盖度相似度GeneBank No.同源种名覆盖度相似度GeneBank No.同源种名覆盖度相似度GeneBank No.同源种名覆盖度相似度GeneBank No.同源种名成 虫52%81.13%DQ490237.1Ceratitis capitata91%99.83%JQ668135.1Myiopardalis pardalina99%90.71%MT410819.1Euleia heraclei100%90.34%MN443932.1Rhagoletis pomonella蛹53%78.92%MN507552.1Rhagoletis zephyria89%100.00%JQ668135.1Myiopardalis pardalina100%90.29%MN443932.1Rhagoletis pomonella99%90.37%MN443932.1Rhagoletis pomonellaC.头胸部；D.翅；E.蛹图 1甜瓜迷实蝇的形态特征A.成虫背面；B.成虫腹面51喀什大学学报第 44 卷2.3相关基因核苷酸含量统计将测序所的序列用Lasergene 7软件中的Seqman进行峰图检查和双向拼接校对，同时将拼接好的序列在NCBI中BLAST比对，确定测得的序列是否为昆虫相关的目标基因序列，相似度和覆盖度较高时为可用序列.同时下载GeneBank 中与甜瓜迷实蝇的ITS2、COI、COII、CYT-B序列相似性较高的其他种类的序列.将下载的序列和测序拼接的同一个基因的序列，用 Clustal X1.83 比对并去除非保守序列，检查校对拼接后用表3中所列的长度分析.AT和GC碱基在不同基因中的含量如表3所示.存在AT偏嗜，符合昆虫先关基因特点.表 3核苷酸频率统计样品编号成虫蛹基因ITS2COICOIICYT-BITS2COICOIICYT-B序列长度/bp642649778464642659762487A/T 含量比1.020.790.990.841.030.801.010.85AT 含量/%78.0667.4972.6272.4177.5567.3772.1871.81GC 含量/%21.9432.5127.3827.5922.4532.6327.8228.192.4系统进化树构建与分析将检查校对拼接好的甜瓜迷实蝇的蛹和成虫样本的ITS2、COI、COII、CYT-B 序列放在 NCBI 中 BLAST 比对，按照Maxscore值降序排列的同一物种下载12个相似性和覆盖度均较高序列，连同测序比对序列和下载序列使用Clustal X 1.83 比对并去除非保守序列，再用MEGA 6.0软件对比对好的成组序列修边，分别构建ITS2、COI、COII、CYT-B基因的NJ系统进化树.结果表明，该虫相关序列都能与相关物种聚在一起，能够反映其系统进化关系.ACOIBITS2CCOIIDCYT-B图中数字表示置信度，样本以实心三角标出图 2与甜瓜迷实蝇相关基因的 NJ 分子系统树3讨论3.1引物与序列分析目标核酸片段的获得主要依赖于引物，因此检索或设计特异性引物对物种鉴定非常重要.如果引物设计缺乏特异性或者扩增效果不好，则无法获得想要的目标核酸片段.本文选用的用于扩增甜瓜迷实蝇 ITS2、COI、COII、CYT-B 引物证明是有效的，另外本文检索或设计的该虫的 ITS1 未能实现有效扩增，在本文中未列出.COI、COII、CYT-B 碱基含量百分比说明所测样品线粒体基因，AT 碱基的含量明显高于 GC，这与很多学者的统计分析结果一致，说明昆虫线粒体基因具有 AT 碱基偏嗜的共同特性.除 COI 外，ITS2、COII、CYT-B 在 NCBI 数据库中均未找到相似度和覆盖度较高的序列，这说明该虫的这三个基因的序列在数据库中并未记录或收录，确定 6 条序列均为甜瓜迷实蝇的新序列.同时 ITS2、COII、CYT-B 基因序列与 COI 基因序列来源一致，都是从同一个昆虫样品（蛹或成虫）中获得，不存在错配为其他昆虫核酸序列的情况.3.2分子鉴定结果利用传统形态分类方法进行初步鉴定，并据此设计52第 3 期陈光辉，张小菊，李焱，王玉涛：基于 DNA 条形码技术甜瓜迷实蝇的分子鉴定或检索引物，并用分子生物学技术获得核酸序列，在用DNA 序列比对进行准确鉴定.在 NCBI 中 BLAST 比对，匹配结果如表 2 总结所示，四个基因中有且仅有 COI 基因满足鉴定标准26,28，能够将标本鉴定为甜瓜迷实蝇，其余3 个基因均未到达鉴定标准，不是因为本研究所获得的序列不对，而是因为数据库中没有关于甜瓜迷实蝇的ITS2、COII、CYT-B 基因序列，说明本文所获得的序列为新序列.关于新的核酸序列和首次传入 Genebank 中的核酸数据的准确性和重要性等问题，已有很多学者强调多次，在此不再赘述23,37.3.3系统进化树聚类分析选用与所测基因序列相似性和覆盖度均较高的本种或者其他物种的相关基因序列构建 NJ 系统进化树，目标序列均能够合理的聚类到（或镶嵌在）相关基因ITS2、COI、COII、CYT-B 的系统树中，系统树的聚类结果进一步证明形态分类的正确性，聚类结果显示甜瓜迷实蝇与 Rhagoletis ramosae 的亲缘关系较近.虽然 NCBI 中的ITS2、CYT-B、COII 基因序列与本研究中用到的序列的相似性覆盖度相对于 COI 较低，且未能通过 ITS2、CYT-B、COII 序列鉴定为甜瓜迷实蝇，但是依据同一样本扩增的 COI 结果足以证明为该虫序列，即使不同基因的系统进化分支聚类存在差异的情况，表面上模糊了这个种类鉴定的记过，但是样本 ITS2、CYT-B、COII 序列与 COI序列一样来自同一样品，这些序列也能很好的镶嵌在相应的系统树中，同时与形态方法分类的结果相互呼应，进一步说明了本研究结果的正确性.COI 序列比对数据和 NJ 系统树分析结果均能很好地反映出准确的鉴定结果，而且与 NCBI 数据库中仅有的 8 条该虫的 COI 基因序列高度同源，NJ 系统进化树聚类分析结果也一致，均来自伊朗（如图 3 所示）.由于伊朗到乌兹别克斯坦等多个沿途国家的甜瓜迷实蝇 COI 基因尚未挖掘或记录，加之新疆临近或周边许多国家和地区关于甜瓜迷实蝇的相关数据尚未发掘或录入数据库，因此对甜瓜迷实蝇传播路线还不能做出推断.目前仅能推测，甜瓜迷实蝇有可能是从伊朗到乌兹别克斯坦方向入侵我国新疆，因此需要加强监测预警，警惕扩散风险.图中数字表示置信度，样本以实心三角标出图 3NCBI中甜瓜迷实蝇的 COI基因构建的 NJ 分子系统树4结论本研究利用 DNA 条形码技术，结合形态学分类方法，对甜瓜迷实蝇进行了 DNA 条形码研究，克服了标本、专家、时空等局限性，挖掘甜瓜迷实蝇多个 DNA 条形码信息，序列比对和 NJ 系统进化树分析表明这些基因序列都可作为甜瓜迷实蝇 DNA 条形码.获得的相关基因分子数据，可作为形态学特征的补充，相关分子数据不仅能够对种一级分类阶元进行有效鉴别，而且可以对种群亲缘关系远近进行分析，为种群入侵或传播途径提供依据；能够实现不同发育历期样品的快速鉴定，提高监测和检疫识别效率，为甜瓜迷实蝇的入侵、定殖和扩散蔓延的预警监测提供参考核酸数据，丰富了甜瓜迷实蝇的 DNA 条形码数据库，对保障我国的农业生产与生态安全具有积极的指导意义.参考文献：1 Stonehouse J,Sadeed S M,Harvey A,et al.Myiopardalispardalina in Afghanistan C/From Basic to AppliedKnowledge Proceedings of the 7th International Symposium on Fruit Files of Economic Importance,Salvador,Brazil,2006.2 Bayhan E,Bayhan S O.Distribution and Infestation RateMelon Fly(Myopardalis pardalina(Dip:Tephritidae)inDiyarbakr(Turkey)C/The 3rd International Symposiumon EuroAsian Biodiversity,Minsk,Belarus,2017.3 Baris A,Cobanoglu S.Investigation on the biology of melon fly Myiopardalis pardalina(Bigot,1891)(Diptera:Tephritidae)in Ankara province J.Turkish Journal ofEntomology,2013,37(3):293-304.4 CABI,EPPO.Carpomya pardalina J.Distribution Mapsof Plant Pests,2013.5 Khan L.Bionomics and control of the melon fruit fly,Dacus cucurbiateD.University of Agriculture,Faisalabad,Pakistan,1987.6 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