黄瓜枯萎病拮抗芽孢杆菌的筛选、鉴定及其生防潜力.pdf

研究报告生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2023,39(8):262-271收稿日期：2023-01-02基金项目：中央引导地方项目（2021FRD05018）作者简介：褚睿，女，硕士研究生，研究方向：设施蔬菜栽培与生理；E-mail:通讯作者：张雪艳，女，博士，教授，研究方向：设施蔬菜栽培与生理；E-mail:黄瓜枯萎病拮抗芽孢杆菌的筛选、鉴定及其生防潜力褚睿 李昭轩 张学青 杨东亚 曹行行 张雪艳（1.宁夏大学农学院，银川 750021；2.银川市农业技术推广服务中心，银川 750016）摘 要：尖镰孢菌黄瓜专化型（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）引起的枯萎病严重影响黄瓜产业可持续发展，为获得高效拮抗黄瓜枯萎病的芽孢杆菌并明确其促生效果，从具有一定抗性的芽孢杆菌中，筛选出高抗尖镰孢菌的生防菌株，并对其进行形态、生理生化、遗传特性及植株促生特性的评价。结果表明，菌株 N1、N3 和 N6 抑制尖镰孢菌效果显著，抑菌率分别为77.71%、75.94%、74.76%。鉴定 3 个菌株均为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），且具解钾、分泌蛋白酶、几丁质酶、果胶酶和产铁载体的能力。黄瓜幼苗防病促生盆栽试验表明，接种菌株 N1、N3 和 N6 病情指数均显著降低，在接种 18 d 后防病效果分别为41.93%、20.97%、66.13%。与单一接种病原菌处理相比，N1、N3 和 N6 接种显著促进了黄瓜幼苗生长，包括株高、茎粗、叶面积、叶绿素含量、地上和地下部鲜重，其中 N6 处理增加效果最显著，分别增加 21.56%、56.13%、47.95%、76.18%、229.89%、70%。与对照相比，处理植株长势特性除地下部鲜重外均显著降低；病原菌接种条件下，添加 N6 菌显著增加茎粗和地上部鲜重。N6 可作为防控黄瓜枯萎病、促进幼苗生长有潜力的生物防治资源，用于黄瓜可持续高效生产。关键词：生物防治；贝莱斯芽孢杆菌；尖镰孢菌；黄瓜枯萎病；幼苗促生；防病效果DOI:10.13560/ki.biotech.bull.1985.2022-1574Screening and Identification of Antagonistic Bacillus spp.Against Cucumber Fusarium wilt and Its Biocontrol EffectCHU Rui LI Zhao-xuan ZHANG Xue-qing YANG Dong-ya CAO Hang-hang ZHANG Xue-yan（1.School of Agriculture,Ningxia University,Yinchuan 750021;2.Yinchuan Agricultural Technology Extension Service Center,Yinchuan 750016）Abstract:Cucumber Fusarium wilt caused by Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum seriously affects the sustainable development of the cucumber industry.In order to obtain high-efficiency antagonistic Bacillus spp.against cucumber Fusarium wilt and clarify its growth-promoting effect,hte biocontrol strain with a strong antagonistic effect against F.oxysporum were screened from Bacillus with a certain resistance to Fusarium solan,and its morphological,physiological and biochemical,genetic characteristics and plant growth-promoting characteristics were evaluated.The results showed that strain N1、N3 and N6 presented significant inhibitory effects on F.oxysporum,with inhibitory rates of 77.71%,75.94%and 74.76%,respectively.Three strains were all identified as Bacillus velezensis,all the three strains showed releasing potassium ability,and produced protease,chitinase,pectinase and siderophores.In the seedlings disease-prevention and growth-promotion test,the disease index of inoculated strain N1,N3 and N6 significantly reduced,the control efficiency was 41.93%,20.97%,and 66.13%respectively on the 18th day after inoculation.Inoculation with N1,N3 and N6 strains effectively promoted the growths of cucumber seedlings compared with single inoculation of F.oxysporum f.sp.treatment,including plant height,stem thickness,leaf area,chlorophyll content and aboveground and subsurface fresh weight,the growth promoting effect of N6 treatment was the most significant.It increased by 21.56%,56.13%,47.95%,76.18%,222.89%and 70%respectively.Compared with the control,the growth characteristics of treated plants significantly decreased except for the fresh weight of underground parts.Under inoculation F.oxysporum f.sp.,the addition of N6 significantly increased the stem thickness 2023,39(8)263褚睿等：黄瓜枯萎病拮抗芽孢杆菌的筛选、鉴定及其生防潜力黄瓜（cucumber）是一种重要的商业蔬菜作物，目前已成为我国设施蔬菜的主体1，长期以来，大规模种植、连作等一系列措施导致土传病害肆虐，土壤生态平衡被破坏，其中黄瓜枯萎病（Cucumber Fusarium wilt）是影响黄瓜产量的主要土传病害之一。黄瓜枯萎病是由尖镰孢菌黄瓜专化型（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）引起的全球性土传病害，通常发病率在 20%-50%，严重时达 80%，甚至绝产，造成巨大的经济损失2。黄瓜枯萎病是设施连作蔬菜的直接致死因子，在黄瓜的整个生育期均可发生，在开花结果期黄瓜枯萎病发病率更高，严重影响黄瓜的产量和品质2-4。因此，解决由尖镰孢菌黄瓜专化型引起的枯萎病对黄瓜产业可持续发展至关重要。目前，国内外关于黄瓜枯萎病已研究出多种防控措施，包括嫁接防治、化学防治、物理防治、农业防治等。但部分存在效率低、田间管理难度大、污染环境等缺点5。在现有的枯萎病防治方法中，主要依赖化学防治，虽然化学农药应用在一定程度上能达到防控病害的要求，但残留的农药会带来环境污染以及作物抗药性6。使用植物根际促生菌（plant growth promoting rhizobacteria,PGPR）和生物防治剂（biocontrol agents,BCAs）是防控枯萎病的另一种方法，PGPR 能定殖在植物根际，利用有益微生物，通过竞争作用、抗生作用、重寄生作用、溶菌作用及诱导抗病性等多种防病机制拮抗病原菌，有利于促进作物健康生长7。芽孢杆菌因其具有遗传稳定性强、耐高温、抗逆性强和抑菌范围广等特性被广泛用于土传病害的防治。冉新炎等8分离获得的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）K-19 对根腐病 和灰霉病病原菌均有一定的拮抗效果。刘雪娇等9研究发现贝莱斯芽孢杆菌 3A3-15 产生抑菌物质表面活性素，该次生代谢产物对尖孢镰刀菌的菌丝有较强致畸作用，且对孢子萌发抑制效果达 93.2%。张德锋等10研究发现贝莱斯芽孢杆菌具有广谱抑菌活性，此外，还表现出促生长的作用。Han 等11研究发现解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）B1408改变了 FOC 的菌丝形态，引起细胞质畸形、变形和外渗，使枯萎病发病率降低 59.0%，并且促进黄瓜植株生长。此外，Liang 等12研究发现 B.velezensis ATR2 对多种植物病原真菌表现出优异的拮抗活性，在植物病害方面表现出巨大的应用潜力。本研究针对宁夏设施蔬菜高度集约化、复种指数高、高投入水肥管理等栽培模式下引起连作障碍，导致土传病害肆虐、蔬菜产量和品质下降等问题，以实验室保存的对黄瓜根腐病具有一定抗性的芽孢杆菌为研究材料，通过平板对峙法对 50 株芽孢杆菌进行初筛，筛选出抑菌率大于 69%的芽孢杆菌，利用芽孢杆菌重悬液对抑病效果较好的菌株进行复筛，确定 3 株抑制尖镰孢菌生长效果显著的芽孢杆菌，分别对其进行形态学鉴定、生理生化鉴定、16S rDNA 和 gyrA 双基因分子鉴定、抗病促生特性鉴定，结合各项鉴定结果，明确其分类地位。选择抑制病原菌生长效果最为显著的菌株进行温室盆栽试验，评价其防病促生效果，明确一株对黄瓜枯萎病防病效果最为显著的生防菌，探究其对黄瓜幼苗枯萎病的防控效果及对植株生长特性的影响，以期为研制多功能菌剂或菌肥提供生物原料和理论基础，为有效防控黄瓜枯萎病提供理论和技术支撑。1 材料与方法1.1 材料供试黄瓜品种为博美 626，黄瓜幼苗购买于宁夏天缘种业有限公司。供试 50 株芽孢杆菌均由宁夏大学园艺实验室保存。供试尖镰孢菌黄瓜专化型（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum,FOC）购买于商城北纳创联生物科技有限公司。培养基：NA 培养基用于拮抗菌的分离和培养13，PDA 培养基用于真菌培养及拮抗细菌的筛选13，PDB 培养基用于病原真菌液体培养，LB 肉汤培养基用于拮抗细菌的液体培养14。and aboveground fresh weight.In conclusion,N6 can be used as potential biocontrol resources to control cucumber Fusarium wilt caused by F.oxysporum f.sp.cucumerinum and promote the growth of seedlings for sustainable and efficient cucumber production.Key words:biological control;Bacillus velezensis;Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum;cucumber Fusarium wilt;seedling promotion;disease-control effect生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.82641.2 方法1.2.1 高效抗病促生芽孢菌株的筛选 采用平板对峙培养法15从 50 株对茄病镰刀菌有一定防控效果的芽孢杆菌中筛选出对黄瓜枯萎病病原菌（尖镰孢菌黄瓜专化型）有抑制作用的菌株进行初筛。选择出现抑菌圈的菌株，记录抑菌圈直径并计算抑菌率。挑选抑制效果明显的芽孢菌株纯化保存，用于后期试验。采用以菌液通过平板对峙培养法对初筛抑菌率高于 69%的菌株进行复筛。具体操作如下：将直径为 5 mm 的病原菌菌饼接入 PDA 平板中央，然后在距菌饼四周 2.5 cm 处打孔，并且接种 5 L 生防菌菌悬液（挑取一环纯菌接种在冷却的装 10 mL LB 液体培养基的 50 mL 三角瓶中，置于 30，200 r/min摇床内培养 24 h，10 000 r/min 离心 5 min 后取上清液待用），以不接种分离菌株作阴性对照，培养箱28培养 7 d，每个处理重复 3 次，记录抑菌半径，并统计抑菌率。抑菌率（%）=（对照病原菌菌落直径-处理病原菌菌落直径）/（对照病原菌菌落直径-病原菌菌饼的初始直径）100%1.2.2 高效抗病促生芽孢菌株的鉴定1.2.2.1 菌株的形态学和生理生化鉴定 将复筛后拮抗效果最好的 3 个菌株分别在 NA 平板上划线，置于 30恒温培养箱中培养 24-48 h，参照伯杰细菌鉴定手册及常见细菌系统鉴定手册16进行菌落形态观察和生理生化等特征分析。1.2.2.2 菌株的抗病促生特性测定 固氮能力：将待测菌株接种到阿须贝培养基，培养观察其有无菌体生长17。溶磷能力：将待测菌株接种于固体无机溶磷培养基平板，培养观察其有无透明溶磷圈出现18。解钾能力：将待测菌株接种到硅酸盐培养基上，培养观察其有无透明圈出现19。产铁载体：将待测菌株接种到铬天青 CAS 培养基上，培养观察有无黄绿色晕圈出现20。ACC 脱氨酶活性：将菌株接种到 ADF 液体培养基培养，将培养所得菌液涂布于ADF 固体平板，30培养后观察 ADF 平板上有无菌落生长，有菌落生长则具有 ACC 脱氨酶活性，反之则无19。根据要雅倩等21的方法进行蛋白酶、果胶酶、几丁质酶、纤维素酶活性的检测。1.2.2.3 菌 株 的 分 子 鉴 定 菌 株 16S rDNA：挑取 单 菌 落 接 种 于 LB 肉 汤 培 养 基 30 培 养 24 h后，采用 DNA 提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取菌株的总 DNA，使用细菌通用引物（27F:5-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3 和 1492R:5-CTACGGCTA CCTTGTTACGA-3）扩增各菌株的16S rDNA 基因序列。PCR 反应体系（40 L）：模板（基因组 DNA）2 L，前后引物（27F 和 1492R）各2 L，ddH2O 14 L，MIX（2Taq plus Master Mix）20 L。PCR 扩增反应条件：98预变性 45 s；98变性 10 s，60退火 30 s，72延伸 30 s；终延伸72 5 min，共 30 个循环。扩增产物经 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR 产物回收后送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将测得的菌株序列在 NCBI 数据库中进行 BLAST 对比，使用 MAGA-X软件构建系统发育树。目标菌株靶基因 gyrA 分子鉴定：挑取单菌落接种于 LB 肉汤培养基 30培养 24 h 后，采用 DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取菌株的总 DNA，使用细菌 gyrA 基因扩增引物（L100：5-AAATCTGCCCGTATCGTCG-3 和 R836：5-GCGTCACGGCGRATCTCAA-3）扩 增 各 菌 株 的 靶基因 gyrA 序列。PCR 扩增反应体系（40 L）：模板 2 L 前后引物（L100 和 R836）各 2 L，ddH2O 14 L，Mix（2Taq plus Master Mix）20 L。PCR扩增反应条件：94预变性 3 min；94变性 40 s，61.7退火 40 s，72延伸 25 s；终延伸 72 10 min，共 30 个循环。1.2.3 高效抗病促生芽孢菌株的盆栽试验 选复筛效果较好的3株芽孢菌株进行盆栽实验，共3种处理。选取长势一致的健康成苗，长到两叶一心时移栽定植，分别用 20 mL 菌株发酵液（108 CFU/mL）灌根处理，CK1 为清水浇灌，CK2 只接种致病菌，N1、N3、N6 分别接种复筛效果好的 3 种芽孢杆菌及致病菌。CK1：清水灌溉，CK2：10 mL 106 CFU/mL 尖镰孢菌悬液+10 mL 清水，T1：10 mL 106 CFU/mL 尖镰孢菌悬液+10 mL 菌 N1，T2：10 mL 106 CFU/mL 尖镰孢菌悬液+10 mL 菌 N3，T3：10 mL 106 CFU/mL尖镰孢菌悬液+10 mL 菌 N6。各处理先接种芽孢菌2023,39(8)265褚睿等：黄瓜枯萎病拮抗芽孢杆菌的筛选、鉴定及其生防潜力株（108 CFU/mL），24 h 后接种尖镰孢菌孢子悬浮液（106 CFU/mL），每株 10 mL，每个处理 15 株，接种10、13、15、17 d 后调查发病情况，病情分级标准参考22，计算病情指数和防病效果。第 20 天时测定株高、茎粗、叶绿素含量、地上部鲜重、地下部鲜重。每个处理选择代表性植株 3 株，连续测定 3 次，株高采用卷尺从生长定点到基部测定，茎粗采用游标卡尺在子叶下 1 cm 位置测定，相对叶绿素含量采用叶绿素仪（SPAD-520 Plus）对植株最大的叶片进行叶绿素含量测定，植株根系特性用万深根系扫描仪（EPSON V700）进行测定。1.2.4 数据处理 采用 Execl 2020 和 SPSS25.0 进行数据统计与分析，使用 Origin 2018 软件绘图。利用MAGA-X 数据软件建立系统发育树。2 结果2.1 尖镰孢菌拮抗菌的分离与筛选将 50 株生防菌通过对尖镰孢菌的抑菌活性测定试验，筛选出抑菌率在 69%及以上的有 7 株，60%-69%的菌株有 19 株，抑菌率在 50%-60%的有 9 株（表 1），15 株菌株对尖镰孢菌抑菌效果不佳。对抑菌率在 69%以上的菌株采用菌悬液进行复筛。表 1 拮抗抗性芽孢杆菌菌株对尖镰孢菌的抑菌作用Table 1 Inhibition of antagonist Bacillus strain against Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum（FOC）菌株 Strain菌落直径 Colony diameter/cm抑菌率 Inhibition rate/%菌株 Strain菌落直径 Colony diameter/cm抑菌率 Inhibition rate/%N12.30 72.18N263.03 60.84N22.40 70.63N273.17 58.78N32.40 70.63N282.79 58.48N42.42 70.38N292.80 58.33N52.43 70.12N302.84 57.58N62.47 69.60N312.84 57.58N72.50 69.09N323.28 56.98N82.58 68.81N332.88 56.82N92.53 68.57N342.93 55.92N102.53 68.57N352.95 55.62N112.53 68.57N363.85 48.22N122.55 68.32N374.11 44.26N132.55 68.32N384.16 43.48N142.60 67.54N394.69 35.24N152.63 67.03N404.27 31.76N162.65 66.77N414.38 29.65N172.68 66.25N425.02 18.18N182.73 65.48N435.40 11.23N192.77 64.97N445.50 9.42N202.80 64.45N455.80 3.99N212.80 64.45N465.80 3.99N222.85 63.68N475.82 3.68N232.87 63.42N485.88 2.48N242.88 63.16N497.10 1.95N252.97 61.88N506.97 0.00复筛结果表明，菌株 N1、N3 和 N6 对尖镰孢菌有明显的拮抗效果（图 1），抑菌率分别为 77.71%、75.94%、74.76%（表 2）。2.2 尖镰孢菌拮抗菌菌株的鉴定复筛得到的 3 株拮抗效果最好的菌株在 NA 平板上均长势良好。培养 24 h 后，N1 菌株的菌落为白生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.8266色，表面粗糙不规则，隆起有褶皱，边缘光滑，不透明，干燥，无色素产生；菌株 N3 的菌落呈白色，表面隆起有褶皱，边缘光滑，不透明，干燥，无色素产生；菌株 N6 的菌落表面凸起，边缘光滑，不透明，湿润，无色素产生。3 株拮抗菌均为革兰氏阳性菌、杆状、产椭圆形芽孢（图 2）。N1N3N6N1N3N6图 2 N1、N3 和 N6 菌株形态（A）及革兰氏染色图片（B）Fig.2 Morphologies（A）of N1,N3,and N6 strains and Gram staining（B）N1、N3 和 N6 菌株的生理生化试验结果表明（表3），N1、N6 菌株氧化酶试验、葡萄糖氧化发酵和明胶液化试验为阳性，其余试验结果均为阴性。N3 菌株氧化酶试验和葡萄糖氧化发酵试验为阳性，其余试验结果均为阴性。表 3 N1、N3 和 N6 菌株的生理生化结果Table 3 Physiological and biochemical results of N1,N3,and N6 strains试验项目Test project结果 ResultN1N3N6甲基红（M-R）Methyl red-接触酶 Catalase-氧化酶 Oxidase+淀粉水解 Amylum hydrolysis-纤维素酶 Cellulase-明胶液化 Gelatin experiment+-+乙酰甲基甲醇（V-P）Voges-Proskauer-葡萄糖氧化发酵 Oxidation-fermentation of glucose+注：“+”表示阳性；“-”表示阴性。下同Note:“+”indicates positive reaction;“-”indicates negative reaction.The same belowN1、N3 和 N6 菌株的抗病促生试验结果表明（表4，图 3）这 3 株芽孢杆菌均没有固氮、溶磷的能力，但其具备解钾的功能。3 株菌均可以分泌铁载体、蛋白酶、几丁质酶、果胶酶。3 株菌的抗病促生特性较为一致。表 4 N1、N3 和 N6 菌株的抗病促生特性鉴定Table 4 Identification of disease resistance of N1,N3,and N6 strains and growth-promoting characteristics试验项目Test project结果 ResultN1N3N6铁载体 Siderophore+解钾 Releasing potassium+溶磷 Releasing phosphorus-固氮 Nitrogen-fixing ability-蛋白酶 Protease+几丁质酶 Chitinase+果胶酶 Pectinase+ACC 脱氨酶活性 ACC deaminase efficiency-根据生防菌 N1、N3 和 N6 的 16S rDNA 基因序列构建系统发育树（图 4-A）。N1、N3 和 N6 的基因序列与 MF375212.1 B.velezensis strain 和 MW165777.1 B.amyloliquefaciens strain 处于同一个分支内，N1、N1N3N6图 1 N1、N3 和 N6 菌株（四周）重悬液对尖镰孢菌（中心）的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of N1,N3 and N6 strains（all around）resuspension on FOC表 2 尖镰孢菌抗性芽孢杆菌复筛抑菌率Table 2 Inhibition rate of Bacillus spp.re-screening on FOC菌株Strain菌落直径Colony diameter/cm抑菌率Inhibition rate/%N12.08 77.71N32.20 75.94N62.28 74.76N72.30 74.53N22.32 74.29N42.49 71.822023,39(8)267褚睿等：黄瓜枯萎病拮抗芽孢杆菌的筛选、鉴定及其生防潜力N3 和 N6 可能为贝莱斯芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌。仅凭 16S rDNA 分子鉴定试验无法确定 N1、N3 和N6 菌株所属菌属，所以以 gyrA 基因作特异性引物，基于 gyrA 基因序列构建系统发育树。结果（图 4-B）表明，N1、N3、N6 菌株与 MK775701.1 B.velezensis聚在一支。根据系统进化树结果推测，N1、N3、N6 属于贝莱斯芽孢杆菌。2.3 拮抗性菌株盆栽试验防病及促生效果接种生防菌 10 d 后，各处理均开始发病；接种生防菌 14 d 后 N1、N3 和 N6 处理防病效果逐渐降低并趋于稳定；CK2 处理病情指数随接种时间递增，于接种后 22 d 达到 86.11。接种菌株悬浮液的处理中 N6 菌株的防病效果最佳，达到 66.13%，N1 次之（表 5）。统计各处理植株长势（表 6）发现，只接种病原菌的处理长势显著低于其他处理，该处理叶绿素含量、茎粗、生物量显著降低，说明尖镰孢菌侵染会显著降低叶绿素含量、减少生物量的积累，与N1N3N6?Siderophore?Inorganic phosphorus?Organophosphoru?Pectinas?Protease?Chitinase图 3 N1、N3 和 N6 菌株抗病促生特性图片Fig.3 Pictures of disease-resistant and growth-proweting properties of N1,N3,and N6 strainsMF375212.1 Bacillus velezensisMW165777.1 Bacillus amyloliquefaciensN3N1N6MZ895405.1 Bacillus stercorisMT856264.1 Bacillus subtilis subsp.stercorisMW477673.1 Bacillus tequilensisON366399.1 Bacillus rugosusOP435771.1 Bacillus cabrialesiiKT719663.1 Bacillus inaquosorumEF178456.1 Bacillus pumilusKU218526.1 Bacillus cereusMG584985.1 Bacillus atrophaeus98802983575245316452480.0010AN3N1N6MK775701.1 Bacillus velezensisKY777250.1 Bacillus siamensisGQ355979.1 Bacillus amyloliquefaciensOP688007.1 Bacillus paralicheniformisEF026730.1 Bacillus sonorensisAF272020.1 Bacillus subtilis subsp.DQ061075.1 Bacillus mojavensisMN296140.1 Bacillus subtilis group sp.JX513911.1 Bacillus safensis10098564797959497500.21B图 4 基于 N1、N3 和 N6 菌株 16S rDNA（A）和 gyrA 基因（B）构建的系统发育树Fig.4 Phylogenetic trees constructed based on N1,N3,and N6 strains 16S rDNA（A）and gyrA gene（B）生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.8268N1、N3 和 N6 处理相比，接种生防菌可以最大程度缓解病原菌对植株造成的损伤，提高植株叶绿素含量、生物量并达到增粗的效果。N1 和 N3 处理株高低于对照，茎粗、叶绿素含量显著高于对照，叶面积、地上部鲜重和地下部鲜重则与对照无显著性差异。N6 处理的茎粗、叶绿素含量及生物量显著高于对照，株高、叶面积与对照组无显著性差异。综合评价可知与 CK1 相比，N1、N3 和 N6 菌株对黄瓜幼苗均有一定的促生效果，特别是在增粗、提高叶绿素含量方面，3 个生防菌处理相比，N6 菌株的促生表 5 菌株对黄瓜枯萎病的防病效果Table 5 Disease-prevention effect of the strain on cucumber wilt处理Treatment接种尖镰孢菌后的时间 Time after inoculation with FOC/d10 14 18 22 病情指数Disease index防病效果Control efficiency/%病情指数 Disease index防病效果Control efficiency/%病情指数 Disease index防病效果Control efficiency/%病情指数 Disease index防病效果Control efficiency/%CK212.5033.3369.4486.11N19.7222.228.3375.0022.2268.0050.0041.93N39.7222.2220.8337.4934.7250.0068.0620.97N65.5655.568.3375.0012.5082.0029.1766.13表 6 菌株对黄瓜幼苗的促生效果Table 6 Growth-promoting effect of strains on cucumber seedlings处理Treatment株高Stem length/cm茎粗Stem diameter/mm叶面积Leaf area/cm2叶绿素含量 Chlorophyll content/SPAD地上部鲜重Fresh weight of above ground/g地下部鲜重Fresh weight of below ground/gCK117.660.73a3.90.11b32.650.87a39.500.72b5.550.13b1.670.23abCK213.840.95b2.770.06c23.212.42b24.351.21c2.540.46c1.030.14bN115.680.52ab4.170.07ab35.802.79a45.851.30a7.150.4ab1.440.08abN314.460.25b4.240.15a32.492.18a44.681.45a6.450.86b1.470.25abN616.830.37a4.330.09a34.341.78a42.90.81ab8.390.45a1.760.19a注：数据由平均值 标准差（SD）表示，不同小写字母表示在 P 0.05 水平差异Note:The data are represented by the mean standard deviation（SD）,and different lowercase letters indicate the difference at the level of P 0.05效果最佳，显著优于 N1 和 N3 菌株。3 讨论黄瓜枯萎病严重威胁设施蔬菜生产的产量和品质，传统的农业防治、化学防治等方法都有一定的弊端，应用微生物防治枯萎病是一条有效的技术途径23。其中生防细菌由于所需营养少、根际定植迅速、繁殖快等优点而具有很大的发展潜力。Banat等24研究发现，防治植物病害潜能的生防细菌有假单胞菌（Pseudomonas sp.）、芽孢杆菌、沙雷氏菌（Serratia sp.）等，主要的生防菌是芽孢杆菌和假单胞菌。据报道，从番茄中分离出来的 2 株丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）对黄瓜枯萎病病原菌具有显著抑制作用，显著降低枯萎病的发病率25，并且可以通过诱导植物的系统抗性（ISR）从而在植物防御机制激活和植物生长促进中起重要作用26。生物防治主要是利用拮抗微生物及其代谢产物防治植物病害。已报道芽孢杆菌可以产生抗生素、降解酶、ACC 脱氨酶、挥发性化合物等参与拮抗菌的生物控制间接促进植物生长27。马兴28发现生防细菌分泌挥发性物质抑制黄瓜枯萎病病原菌菌丝的生长。部分芽孢杆菌通过溶解磷酸盐、产生铁载体、生物固氮等方式提高植物根际养分的可利用性。本研究贝莱斯芽孢杆菌 N1、N3 和 N6 严重抑制了尖镰孢菌的生长，经抗病促生特性鉴定，3 株菌株均可产生几丁质酶、果胶酶和蛋白酶，分解尖镰孢菌细胞壁进入细胞，从而抑制病原菌的生长，这与杨2023,39(8)269褚睿等：黄瓜枯萎病拮抗芽孢杆菌的筛选、鉴定及其生防潜力茉29研究结果一致。此外，3 株菌株显著提高了植株叶绿素含量、促进植株生物量积累的功能，通过溶解钾帮助根系吸收矿物质元素，并产生铁载体增加土壤中可被植物吸收的有效态铁元素含量，促进植株对铁元素的吸收，达到促生的效果。生防菌株能否在植物根际或根部有效定殖是决定根部病害防治成功的关键一步26。PGPR 定殖在植物根际，可以促进植株生长。试验明确了筛选出的 3 株贝莱斯芽孢杆菌对尖镰孢菌菌丝生长具有显著抑制效果，这可能与贝莱斯芽孢杆菌对尖镰孢菌菌丝具有强致畸能力有关30，但盆栽效果并不如平板对峙试验效果显著，说明 N1 和 N3 可能并没有在植株根际迅速定殖，没有占据有利生态位点，可能是由于贝莱斯芽孢杆菌在根际定殖效果差或复杂的基质环境导致的。而 N6 盆栽试验效果与平板对峙效果一致均具有显著防病效果，具有很大的生防潜力。探究贝莱斯芽孢杆菌在植株根系的定植机制以及复杂的基质环境对贝莱斯芽孢杆菌繁殖的影响需要进一步探究。芽孢杆菌 N1、N3 和 N6 具有良好的防病促生效果，为黄瓜尖镰孢菌枯萎病的生物防治提供了理论依据，也为芽孢杆菌的产业化开发提供了菌种资源。但对其防病效果的广谱性、其在根际定殖的动态规律与代谢产物的研究、发酵工艺优化等均有待进一步明确，以便全面地发掘 N1、N3 和 N6 的防治潜力，进而研发出多功能的芽孢杆菌制剂。4 结论筛选出 3 株对尖镰孢菌拮抗效果显著的贝莱斯芽孢杆菌 N1、N3 和 N6，抑菌率分别为 77.71%、75.94%和 74.76%，菌株防病效果分别为 41.94%、20.97%、66.13%。接种 N1、N3 和 N6 可以显著促进黄瓜幼苗的株高、茎粗、叶面积、叶绿素含量、地上和地下部鲜重的增加，其中 N6 处理增加效果最显著，可作为防控黄瓜苗期尖镰孢菌枯萎病、促进黄瓜幼苗生长有潜力的生物防治资源。参 考 文 献 1马晓凤.黄瓜枯萎病综合防控J.西北园艺:综合,2019（5）:51-52.Ma XF.Integrated control of cucumber Fusarium