槲皮素通过抑制氧化应激反应改善脑出血小鼠神经功能.pdf

Chinese Journal of Neuroanatomy志杂解部经神2023,39(3):269274皮素通过抑制氧化应激反应改善脑出血小鼠神经功能廖玉慧，黄娟，王振华，王旭，陆蔚天*（重庆医科大学基础医学院人体解部学教研室，重庆40 0 0 16）摘要目的：探讨皮素（quercetin）对脑出血（ICH）小鼠氧化应激及神经功能的影响。方法：建立小鼠脑出血模型后通过改良Garcia评分和转角试验评估各组小鼠神经功能；通过脑含水量、脑血红蛋白含量检测和苏木精-伊红（HE）染色染色评估各组小鼠大脑受损程度与组织形态变化；通过WesternBlot检测各组小鼠核因子E2相关因子2（Nrf2）和NADPH氧化酶4（Nox4）蛋白的表达水平；通过超氧化物阴离子荧光探针（DHE）和过氧化氢(H,O2）检测各组小鼠的氧化应激水平。结果：与假手术组相比，脑出血组小鼠神经功能受损，脑含水量和血红蛋白含量升高,脑组织病理结构损伤,Nrf2表达无明显变化,Nox4表达升高，氧化应激水平升高；与脑出血组相比，皮素组小鼠的神经功能障碍减轻,脑含水量和血红蛋白含量降低，脑组织病理结构损伤减轻,Nrf2表达升高,Nox4表达降低，氧化应激水平降低。结论：皮素对脑出血小鼠的神经功能具有保护作用，可能通过抑制Nox4表达水平，增强Nrf2表达水平以降低氧化应激损伤来实现。关键词皮素；脑出血；氧化应激；神经保护；小鼠D0I:10.16557/ki.1000-7547.2023.03.003Quercetin improves neurological dysfunction in intracerebral hemorrhagemice by inhibiting oxidative stress responseLIAO Yuhui,HUANG Juan,WANG Zhenhua,WANG Zhixu,LU Weitian(Department of Human Anatomy,Institute of Basic Medical College,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China)Abstract Objective:To explore the effects of quercetin on oxidative stress response and neurological function andthe regulatory mechanism in intracerebral hemorrhage(ICH)mice.Methods:The models of intracerebral hemorrhagein mice were established by autologous blood injection.The neurological function of mice were assessed by modifiedGarcia score and corner turn test;the degree of brain damage and histomorphological changes were assessed by brainwater content,brain hemoglobin content detection and hematoxylin and eosin(HE)stain;the expression of nuclear fac-tor erythroid 2-related factor 2(Nrf2)and NADPH oxidase 4(Nox4)was detected by Western Blot;and the oxidativestress levels were detected by dihydroethidium(DHE)and hydrogen peroxide(H,O,).Results:The neurological func-tion of mice in the ICH group was impaired compared with the sham group,the brain edema and the hemoglobin contentwere increased,the brain tissue was damaged,the expression level of Nrf2 was not extremely changed,the expression ofNox4 was increased,and the oxidative stress level was increased;The neurological dysfunction of mice in the quercetingroup was alleviated compared with the ICH group,the brain edema and hemoglobin content were decreased,the braindamage was alleviated,the expression of Nrf2 was increased,the expression of Nox4 was decreased,and the oxidativestress level was decreased.Conclusion:Quercetin has a protective effect in ICH mice by reducing oxidative stress inju-ry,and the underlying mechanism may be involved the regulation of Nrf2 and Nox4.基金项目：国家自然科学基金（8 2 17 1457）；重庆市自然科学基金（CSTB2022NSCQ-MSX1083）；重庆医科大学未来医学青年创新团队发展支持计划（W0031）*通信作者：陆蔚天电话：13330 2 37 6 0 1,E-mail：w e i t i a n l u c q m u.e d u.c n2702023年5月第39 卷第3期神经解部学杂志，Key wordsquercetin;intracerebral hemorrhage(ICH);oxidative stress;neuroprotection;mouse脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是一种具有高致病率和高致死率的神经系统疾病 。约有75%的脑出血存活患者表现出严重的神经功能障碍,包括运动功能障碍,认知功能障碍，瘫痪等2 。目前的治疗方法主要是通过手术清除血肿以减轻血肿对周围脑组织的损伤，然而无法减轻脑出血后的继发性损伤3。继发性损伤所涉及的机制十分复杂。氧化应激作为脑出血继发性损伤的关键因素，参与各种病理生理反应的重要阶段3.4,是近年来研究人员的关注焦点。皮素（quercetin）又名栎精，化学名为3，3，4,5,7-五羟基黄酮5.6 ,广泛存在于槐花、柴胡等中药材以及石榴、西兰花、洋葱等膳食中7.8 。近年来有研究发现皮素具有抗病毒、抗肿瘤等药理学特性9-12 ,还可有效穿透血脑屏障，清除活性氧自由基,提高抗氧化因子表达以减少氧化损伤3。目前已在乳腺癌、糖尿病等多种疾病模型中证明皮素在疾病防治方面具有独特优势10.4.51。此外，皮素还可改善多囊卵巢综合征大鼠的氧化应激状态16 ,减轻脑缺血再灌注导致的神经损伤8.17 。然而,皮素在脑出血疾病中的应用及具体机制研究较为稀少。故本次实验通过自体血注人法建立脑出血小鼠模型,研究皮素是否可调节脑出血小鼠体内氧化应激水平从而促进小鼠神经功能的恢复，并探讨其作用机制。材料与方法1.材料1.1实验动物54只SPF级昆明小鼠由重庆医科大学实验动物中心提供，体重2 5 30 g，饲养室温度（2 42），相对湿度55%6 0%的生长环境，给予实验级小鼠颗粒饲料以及12 h昼夜交替光照。1.2试剂和仪器皮素购自美国Cayman公司，纯度9 5%；小鼠抗小鼠-actin单克隆抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司，兔抗核转录因子E2相关因子 2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）单克隆抗体和兔抗NADPH氧化酶4（NADPHoxidase4，No x 4）单克隆抗体购自武汉爱博泰克生物技术有限公司;辣根过氧化物酶（horseradishperoxi-dase，H RP)标记的山羊抗小鼠IgG二抗和HRP标记的山羊抗兔IgG二抗购自美国EarthOx公司；超氧化物阴离子荧光探针（dihydroethidium，D H E）购自上海碧云天生物技术有限公司；过氧化氢（hydrogenperoxide,H,O,）测试盒购自江苏凯基生物技术有限公司；化学发光试剂购自北京四正柏生物技术有限公司。立体定位仪购自上海玉研科学仪器有限公司，倒置荧光显微镜购自德国Leica公司，凝胶成像系统购自广州光仪生物科技有限公司。2.方法2.1制备脑出血模型及分组处理采用自体血注人法18 。用2%戊巴比妥麻醉小鼠后，将小鼠固定于立体定位仪。切开头皮，暴露卤门，于前卤向右2.3mm，向前0.2 mm处钻孔。从小鼠尾部抽取30l自体血，通过微量注射器以2 l/min缓慢注射（深度3.5mm），注射完毕后针头停留10 min再缓慢退出。医用骨蜡封闭钻孔，缝合头皮。将小鼠随机分为三组：sham组、ICH组、ICH+皮素（50 mg/kg）组。其中sham组注射相同剂量生理盐水;ICH组按上述方法建立脑出血模型；脑出血后1h给予皮素腹腔注射,sham 组和 ICH组注射相同剂量生理盐水。2.2神经功能测定小鼠脑出血3d后通过改良Garcia评分和转角试验进行神经功能评分。改良Garcia评分由6 个部分组成：小鼠的体态对称性、攀爬铁笼能力、前肢伸展运动、自主运动能力、胡须碰触反应、身体触觉反射及抓持。得分越低，小鼠神经功能受损程度越重；反之小鼠神经功能受损程度越轻。转角试验是将小鼠置于30 角落，任其向右或向左转弯离开角落，并记录其向右转的次数占总次数的百分比。2.3月脑含水量测定将小鼠麻醉后立即取脑，并分为五个部分：同侧皮质和基底神经核，对侧皮质和基底神经核以及小脑。通过电子天平对5个部分称取重量并记录为湿重，迅速置于9 5烤箱中烘烤7 2h，再次称取重量并记录为干重。脑含水量的计算公式为：（湿重-干重）/湿重10 0%。2.4脑血红蛋白含量测定将小鼠麻醉后经心脏灌注生理盐水，待肝脏颜色变浅后收集半脑。称重并记录，按重量（g）：体积（ml）为1:9 的比例加入生理盐水。匀浆后4离心（12 0 0 0 r/min）30 mi n，取上清液待测。按以下步骤分别制备空白管和测定管：（空白管）上清液0.15ml，显色剂2.5ml；（测定管）双蒸水0.15ml,显色剂2.5ml。将各管试剂混匀后于37 水浴2 0 min，酶标仪510 nm处测各组271廖玉慧：皮素通过抑制氧化应激反应改善脑出血小鼠神经功能OD值。按以下公式进行计算：游离血红蛋白=12 6.03（测定OD值-空白OD值）+3.50 41。2.5苏木精-伊红染色将组织切片复温后水洗，滴加苏木精染液孵育5min后进行伊红染色，再依次进行脱水、透明、封片，镜下观察。2.6Western Blot将小鼠麻醉后经心脏灌注生理盐水,收集血肿周围的脑组织,加人含有RIPA裂解液与蛋白酶抑制剂的混合液后进行匀浆、离心（12 0 0 0 r/m i n，30 m i n）。取上清液加人5上样缓冲液，混匀后9 5煮沸5min。将样品加人10%SDS-PACE凝胶中，待电泳后将蛋白凝胶转移到PVDF膜上进行电转（2 50 mA,60120min）。将条带放人5%脱脂牛奶常温孵育2 h后，加人一抗孵育过夜：兔抗Nox4单克隆抗体（1:10 0 0），兔抗Nrf2单克隆抗体（1:10 0 0）和小鼠抗-actin（1:50 0 0）。次日用PBST清洗条带后加HRP标记的山羊抗兔二抗或山羊抗小鼠二抗（1:50 0 0）于37 摇床孵育6 0 min。再次清洗条带后进行化学发光，ImageJ分析条带。2.7DHE染色通过腹腔注射将DHE染液注人小鼠体内,30 min后麻醉小鼠并经心脏灌注生理盐水。收集样本并立即冻于-8 0 冰箱，随后进行0 CT包埋，在-2 0 下进行切片（10 m）。将切片晾干后滴加DHE染液2 0 40 l,37避光孵育30 min。用PBS清洗后滴加DAPI染核，封片，在倒置荧光显微镜下拍照。2.8 H,0,测定将小鼠麻醉后立即经心脏灌注生理盐水，收集半脑并称取重量，按重量（g）：体积(ml)为1:9 的比例加人生理盐水。匀浆后离心（10 0 0 0 r/mi n，10 mi n），取上清液待测。按以下步骤分别制备空白管、标准管、测定管：（空白管）BufferA1 ml,蒸馏水0.1 ml,Buffer B 1 ml;（标准管）BufferA1ml,标准品工作液0.1ml,BufferB1ml;（测定管)BufferA1ml,样本0.1ml,Buffer B1ml。将各管试剂混匀后于40 5nm处测各组吸光度。计算公式为：组织中H,02含量=（测定管吸光度-空白管吸光度）/（标准管吸光度空白管吸光度）标准品浓度/待测样本蛋白浓度。2.9统计学处理试验结果采用GraphPadPrism5进行数据分析，计量资料以均值标准差（xs）表示，P0.05代表其差异有统计学意义。结果1.皮素改善脑出血后小鼠神经功能与sham组相比,ICH小鼠的Garcia评分降低；与ICH组相比,皮素组的Garcia评分明显增高。在转角试验中,与 sham组相比,ICH组小鼠的右转百分比增高；与ICH组相比，皮素组的右转百分比降低(P0.05,Fig.1)。20F1008015bb6010F40520F00ABShamShamICH+quercetinICH+quercetinFig.1 Effects of quercetin on neurological function.A:Modified Garcia score,B:The corner turn test.P0.05 us Sham group;bP0.05us ICHgroup.2.皮素改善脑出血后脑水肿,降低血肿体积与sham组相比,ICH组基底核区的脑含水量升高,脑游离血红蛋白含量增多；与ICH组相比,皮素组基底核区的脑含水量明显降低，脑游离血红蛋白含量减少（P0.05，Fi g.2）3.皮素减轻脑组织病理结构损伤HE染色显示，sham组小鼠脑组织形态结构正常,细胞数目较多。ICH组小鼠脑组织形态结构疏2722023年5月第39 卷第3期神经解剖学杂志，松,神经细胞数目变少。与ICH组小鼠相比,皮素组改善了小鼠脑组织部分形态结构、细胞数目等情况(P0.05,Fig.3)。100F1.5斤2801.060400.5F2000.0ABShamShamICH+quercetinFig.2 Effects of quercetin on brain edema and hematoma volume.A:The analysis of brain water content.B:The analysis of hemato-ma volume.aP0.05 us Sham group;bp0.05 us ICH group.ShamICHICH+quercetinFig.3 Representative images of the HE-stained brain sections arround the hematoma.Bar=100 m.4.皮素增高脑出血后脑内Nrf2表达水平，降低Nox4表达水平与sham组相比,抗氧化因子Nrf2在ICH第3d表达水平略有升高，而作为活性氧重要来源的Nox4表达水平显著升高；与ICH组相比，榭皮素组Nrf2表达水平明显升高，Nox4表达水平降低（P0.05，Fig.4）。这说明皮素可调节Nrf2和Nox4表达水平2.0F2.0ShamICH+quercetin1.51.5bNrf2110kDa1.01.00.50.5-Nox467kDa0.00.0ShamSham-actin42kDaABICH+quercetinCICH+quercetinFig.4 Effects of quercetin on the expression levels of Nrf2 and Nox4.A:Representative Western Blot bands of Nrf2 and Nox4.B:Quantitative analysis of the relative expression levels of Nrf2.P0.05 us ICH group.C:Quantitative analysis of the relativeexpresion levels of Nox4.P0.05 us Sham group;bP0.05 us ICH group.273廖玉慧：皮素通过抑制氧化应激反应改善脑出血小鼠神经功能5.皮素降低脑出血后超氧阴离子和H,02水平通过DHE染色检测超氧阴离子水平可见，与sham组小鼠相比,ICH组的DHE荧光强度和H,O,生成水平显著增强；与ICH组相比，皮素组的DHE荧光强度和H,O2生成水平显著降低（P0.05，Fi g.5）。这说明脑出血后应用皮素可抑制氧化应激水平。DHEDAPIMergeweus846HOI3A2200BICHCShamShamAICH+quercetinICH+quercetinFig.5 Effects of quercetin on oxidative stress.A:Representative DHE staining pictures.Bar=100 m.B:Quantitative analysis ofthe indensity DHE.C:Quantiative analysis of the H,0,content.P0.05 us Sham group;P0.05 us ICH group.讨论皮素作为一种天然黄酮类化合物，因其糖苷元结构而具有很高的生物利用度15,其位于B环上的邻二酚羟基和A、C环3位的羟基基团是清除自由基的关键因素,其抗氧化能力比维生素C和维生素E更强，是近年来国内外的关注热点之_19 2 1。已有研究发现皮素在多种神经疾病模型中具有保护作用：在阿尔茨海默症小鼠模型中可减少海马和杏仁核的细胞外-淀粉样变2 2 ,在缺血再灌注大鼠模型中显著改善大鼠的神经功能评分及脑含水量8 1。在本研究中,通过建立ICH模型，利用神经功能评分、HE染色、脑含水量和血红蛋白含量检测以观察皮素在脑出血模型中的作用。研究结果显示，在脑出血后腹腔注射皮素可改善小鼠神经功能障碍，降低脑含水量和血红蛋白含量，改善脑组织病理形态，表明皮素在小鼠脑出血模型中具有保护作用，这与李建波等2 3 的研究结果相一致。大脑作为机体耗氧量高的部位，极易受氧化应激的影响。脑出血发生后活性氧过度生成，远远超过机体抗氧化能力，导致大量氧化代谢产物水平升高、抗氧化酶活性降低，引起氧化应激反应，促进神经功能障碍3.2 4。引起氧化应激反应的活性氧主要有3种形式：超氧阴离子（0 2-）、H,02和羟自由基（O H-）。其中,H,O2是最稳定的活性氧分子。Nox4作为活性氧生成最主要的来源之一，其下游作用被认为是由H,02所介导。Nrf2是生物抗氧化系统中的重要因子，在细胞中普遍表达，以抵消氧化应激和炎症反应 。在本研究中通过检测皮素对 Nrf2和Nox4蛋白表达、DHE以及H,O,水平的影响，发现榭皮素组小鼠脑内Nrf2表达水平增高,Nox4表达水平显著降低。作为氧化应激检测指标的DHE以及H,02水平也在应用皮素后得到改善。这些结果表明，皮素对脑出血后神经功能的保护作用可能是通过抑制活性氧的产生源头、促进抗氧化因子表达以降低氧化应激水平而实现的。综上所述，本研究证实了皮素可通过减轻脑出血后氧化应激损伤而保护神经功能，其机制可能与调节抗氧化/氧化轴（Nrf2/Nox4）有关，这也许是皮素成为脑出血后有效抗氧化剂的重要作用机制之一。2742023年5月第39 卷第3期神经解剖学杂志，参考文献1 Imai T,Matsubara H,Hara H.Potential therapeutic effects of Nrf2activators on intracranial hemorrhage J.J Cereb Blood FlowMetab，2 0 2 1，41（7）：148 3-150 0.D 0 I:10.117 7/0271678X20984565.2 Wang Z,Zhou F,Dou Y,et al.Melatonin alleviates intracerebralhemorrhage-induced secondary brain injury in rats via suppressingapoptosis,inflammation,oxidative stress,DNA damage,and mito-chondria injuryJ.Transl Stroke Res,2018,9(1):74-91.D0I:10.1007/s12975-017-0559-x.3 Duan X,Wen Z,Shen H,et al.Intracerebral hemorrhage,oxidativestress,and antioxidant therapyJ.Oxid Med Cell Longev,2016,2016:1203285.D01:10.1155/2016/1203285.4 Shao L,Chen S,Ma L.Secondary brain injury by oxidative stress af-ter cerebral hemorrhage:Recent advances J.Front Cell Neuros-ci,2022,16:853589.D0I:10.3389/fncel.2022.853589.5 Reyes-Farias M,Carrasco-Pozo C.The anti-cancer effect of querce-tin:Molecular implications in cancer metabolism J.Int J MolSci,2019,20(13):3177.D0I:10.3390/ijms20133177.6 Suganthy N,Devi KP,Nabavi SF,et al.Bioactive effects of querce-tin in the central nervous system:Focusing on the mechanisms ofactionsJ.Biomed Pharmacother,2016,84:892-908.D0I:10.1016/j.biopha.2016.10.011.7 Grewal AK,Singh TG,Sharma D,et al.Mechanistic insights andperspectives involved in neuroprotective action of quercetin J.Bi-omed Pharmacother,2021,140:111729.D01:10.1016/j.biopha.2021.111729.【8 娄原，姜雅楠，徐浩群，等皮素抗脑缺血再灌注损伤作用机制研究进展J.中国实验方剂学杂志，2 0 2 2，2 8（17）：2 48257.D0I:10.13422/ki.syfjx.20221641.9 Wang M,Chen X,Yu F,et al.The targeting of noncoding RNAs byquercetin in cancer prevention and therapy J.Oxid Med Cell Lon-gev,2022,2022:4330681.D01:10.1155/2022/4330681.10 Kasiri N,Rahmati M,Ahmadi L,et al.Therapeutic potential ofquercetin on human breast cancer in different dimensions J.In-flammopharmacology,2020,28（1):39-6 2.D 0 I:10.10 0 7/s10787 019 00660 y.11 Tezerji S,Nazari Robati F,Abdolazimi H,et al.Quercetins effectson colon cancer cells apoptosis and proliferation in a rat model ofdiseaseJ.Clin Nutr ESPEN,2022,48:441-445.DOI:10.1016/j.clnesp.2022.01.004.12 Chen N,Liu Y,Bai T,et al.Quercetin inhibits Hsp70 blocking ofbovine viral diarrhea virus infection and replication in the early stageof virus infectionJ.Viruses,2022,14(11):2365.D0I:10.3390/v14112365.13 Qi W,Qi W,Xiong D,et al.Quercetin:Its antioxidant mecha-nism,antibacterial properties and potential application in preventionand control of toxipathy J.Molecules,2022,27(19):6545.D0I:10.3390/molecules27196545.14 Eid HM,Haddad PS.The antidiabetic potential of quercetin:Un-derlying mechanismsJ.Curr Med Chem,2017,24(4):355-364.D0I:10.2174/0929867323666160909153707.15 Torello CO,Alvarez MC,Olalla Saad ST.Polyphenolic flavonoidcompound quercetin effects in the treatment of acute myeloid leuke-mia and myelodysplastic syndromes J.Molecules,2021,26(19):5781.D0I:10.3390/molecules26195781.16杨哲，胡雪，吴庚香皮素对多囊卵巢综合征大鼠氧化应激状态的改善作用J广西医学，2 0 2 1，43（17）：2 0 8 92092.D01:10.11675/j.issn.0253-4304.2021.17.14.17 Zhang L,Ma J,Yang F,et al.Neuroprotective effects of quercetinon ischemic stroke:A literature review J.Front Pharmacol,2022,13:854249.D0I:10.3389/fphar.2022.854249.18卢小叶，吕倩忆，李棋龙，等Zea-longa评分与改良Garcia评分应用于针刺治疗CIRI大鼠神经功能缺损评估的研究J.湖南中医药大学学报，2 0 2 1，41（9）：1356-136 0.D0I:10.3969/j.issn.1674-070 x.2021.09.008.19 Heo HJ,Lee CY.Protective effects of quercetin and vitamin C a-gainst oxidative stress-induced neurodegenerationJ.J Agric FoodChem,2004,52(25):7514-7517.D0I:10.1021/jf049243r.20 Kim DO,Lee KW,Lee HJ,et al.Vitamin C equivalent antioxidantcapacity（VCEA C)o f p h e n o l i c p h y t o c h e m i c a l s J.J A g r i c Fo o dChem,2002,50(13):3713-3717.D0I:10.1021/jf020071c.21王亚茹，袁满，张丽，等皮素抗氧化作用及相关机制研究进展J营养学报，2 0 2 2，44（2）：2 0 4-2 0 8.D0I:10.13325/ki.acta.nutr.sin.2022.02.001.22 Khan H,Ullah H,Aschner M,et al.Neuroprotective effects ofquercetin in Alzheimers diseaseJ.Biomolecules,2019,10(1):59.D0I:10.3390/biom10010059.23李建波，耿炜，周涛，等皮素对急性脑出血大鼠神经功能恢复的作用及对PKC/ERK信号通路的影响J临床神经外科杂志，2 0 2 2，19（0 3）：316-32 1.D0I:10.3969/j.issn16727770.2020.03.015.24 Zhang Y,Khan S,Liu Y,et al.Oxidative stress following intrace-rebral hemorrhage:From molecular mechanisms to therapeutic tar-getsJ.Front Immunol,2022,13:847246.DOI;10.3389/fim-mu.2022.847246.（收稿日期：2 0 2 3-0 1-31)