仿刺参腐皮综合征病原灿烂弧菌RPA-Cas13a检测方法的建立.pdf

D O I:1 0.1 6 3 7 8/j.c n k i.1 0 0 3-1 1 1 1.2 2 0 3 6第4 2卷第4期2 0 2 3年7月水产科学F I S HE R I E S S C I E N C EV o l.4 2N o.4J u l.2 0 2 3仿刺参腐皮综合征病原灿烂弧菌R P A-C a s 1 3 a检测方法的建立刘 骥,陈艳茹,侯竹美,徐冬雪,谷元雪,宋文琦,宋宜泽,夏 斌(青岛农业大学,海洋科学与工程学院,山东 青岛2 6 6 1 0 9)摘 要:为预防和控制灿烂弧菌引发的仿刺参腐皮综合征,促进仿刺参养殖业的健康可持续发展,利用L w C a s 1 3 a中特异性C R I S P RR NA(c r R NA)与靶R NA结合后可激活C a s 1 3 a蛋白对外源R NA分子附属切割活性的特征,结合重组酶介导的聚合酶扩增技术(R P A),建立1种针对灿烂弧菌g y r B基因的快速、灵敏、特异的定量检测方法 R P A-C a s 1 3 a。R P A-C a s 1 3 a可实现在3 7 恒温下、6 0m i n内对灿烂弧菌的快速实时检测。灵敏度测试结果显示,R P A-C a s 1 3 a检测限为5 5 0拷贝/L(g y r B),与荧光定量P C R的检测灵敏度水平一致;特异性测试结果表明,R P A-C a s 1 3 a对创伤弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌等其他弧菌及产黑假交替单胞菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌等常见水产动物病原菌均无交叉反应,特异性较强。R P A-C a s 1 3 a方法对仿刺参体表黏液(3 2份)、养殖池塘水体(1 5份)和表层沉积物(1 0份)等5 7份环境样本的阳性检出率为8.7 7%,与传统荧光定量P C R方法的检出一致性高(K a p p a=1.0 0),无统计学差异(P0.0 5)。试验结果表明,灿烂弧菌的R P A-C a s 1 3 a新型定量检测方法,快速简便、灵敏特异,可为预防和控制仿刺参腐皮综合征的发生提供有力的分子工具。关键词:C R I S P R-C a s 1 3 a;R P A;灿烂弧菌;仿刺参;快速分子检测中图分类号:S 9 6 8.9文献标识码:A文章编号:1 0 0 3-1 1 1 1(2 0 2 3)0 4-0 6 3 2-0 8收稿日期:2 0 2 2-0 5-0 5;修回日期:2 0 2 2-0 9-1 9.基金项目:国家自然科学基金资助项目(3 1 9 0 2 3 6 0);山东省一流学科项目;青岛农业大学高层次人才科研基金资助项目(1 1 2 0 0 3 0,1 1 1 7 0 0 1).作者简介:刘骥(1 9 9 0),男,讲师;研究方向:海洋微生物学.E-m a i l:j i.l i uq a u.e d u.c n.通信作者:夏斌(1 9 8 6),男,副教授;研究方向:水产动物生理生态学.E-m a i l:a c_x b i n 1 2 6.c o m.仿刺参(A p o s t i c h o p u s j a p o n i c u s),属棘皮动物门海参纲经济物种,具有较高的营养和药用价值。截至2 0 2 0年底,我国仿刺参年产量1.9 71 06t,总产值超3 0 0亿元1。随着仿刺参养殖规模的扩大,其病害问题也日益凸显,给广大养殖从业者带来了严重的经济损失,其中以腐皮综合征的危害最为严重,发病死亡率超过9 0%2。灿烂弧菌(V i b r i os p l e n d i d u s),属弧菌科弧菌属细菌,革兰氏阴性菌,可引发仿刺参、大西洋鲑(S a l m os a l a r)和菲律宾蛤仔(R u d i t a p e sp h i l i p p i-n a r u m)等水产养殖动物患细菌性疾病3-4。目前已知仿刺参腐皮综合征的主要病原为灿烂弧菌5-8,其感染后可经仿刺参体内M y D 8 8依赖的T L R信号通路进行信号转导并引发免疫应答9,改变仿刺参体内免疫相关酶的活性1 0。为有效预防和控制灿烂弧菌引发的相关疾病,开发快速灵敏、特异可靠的灿烂弧菌检测技术十分必要。另外,水产动物弧菌病的发生也与病原丰度直接相关1 1,因此建立灿烂弧菌的定量检测方法有着重要意义。目前已有的灿烂弧菌检测方法包括细菌分离培养-生理生化试验、基于蛋白质检测的免疫学技术 双抗原夹心酶联免疫吸附测定(E L I S A)法、斑点酶联免疫吸附试验(D o t-E L I S A)等 和基于核酸检测的分子生物学技术(P C R法、核酸探针法)等1 2-1 5。然而,生理生化试验灵敏度低、特异性差;分离培养法和免疫学检测周期长、通量低;以P C R和核酸探针为代表的分子生物学检测方法所需的仪器设备和人员培训投入高、核酸探针设计复杂且昂贵,无法适用于基层单位和养殖现场等场所。成簇的规律间隔短回文重复序列(C R I S P R)及其相关蛋白(C a s)是原核生物中广泛存在的一种通过切割核酸来抵御病毒和外源核酸入侵的天然免疫防御系统1 6。近年,科学家们发现,C a s 1 3 a在激活后具有核酸附属切割活性,G o o t e n b e r g等1 7提出了基于C R I S P R-C a s 1 3 a的核酸检测方法:C a s 1 3 a可通过其内部的C R I S P RR NA(c r R NA)识别并结合靶标R NA,从而激活C a s 1 3 a的附属切割活性,非特异地切割R NA探针以检测靶标R NA的存在。此后,他们进一步结合重组酶介导的聚合酶扩增(R P A)技 术,建 立 了S HE R L O C K分 子 检 测 平台1 8,并将其成功应用于病毒核酸分子(如寨卡病毒、埃博拉病毒、A型禽流感病毒等)和其他分子(如m i R NA和N1-甲基腺苷等)的检测1 9-2 3。笔者设计针对灿烂弧菌g y r B基因的靶标特异性R P A引物和c r R NA,利用C R I S P R-C a s 1 3 a,建立1种C R I S P R-C a s 1 3 a辅助的R P A检测技术(图1),旨在实现对灿烂弧菌快捷、灵敏、特异的定量检测,为该病原引发的水产动物相关弧菌病的早期诊断和有效防控提供新的分子工具。图1 灿烂弧菌R P A-C a s 1 3 a快速检测技术原理F i g.1 S c h e m a t i co fR P A-C a s 1 3 ar a p i dd e t e c t i o no fV.s p l e n d i d u s1 材料与方法1.1 试验材料及仪器1.1.1 菌株及样本试验所用灿烂弧菌由中国水产科学研究院黄海水产研究所赠与,创伤弧菌(V.v u l n i f i c u s)、哈维氏弧菌(V.h a r v e y i)、鳗弧菌(V.a n g u i l l a r u m)、副溶血弧菌(V.p a r a h a e m o l y t i c u s)、美人鱼发光杆菌(P h o t o b a c t e r i u m d a m s e l a e)、产 黑 假 交 替 单 胞 菌(P s e u d o a l t e r o m o n a sn i g r i f a c i e n s)、嗜水气单胞菌(A e r o m o n a sh y d r o p h l i a)和迟缓爱德华氏菌(E d-w a r d s i e l l at a r d a)为实验室前期自养殖环境中分离,以上菌株均已在本实验室保存。3 2份健康和疑似患腐皮综合征的仿刺参皮肤黏液样品、1 5份养殖水体样本和1 0份表层沉积物样品采集自山东青岛、烟台和威海的6个仿刺参养殖池塘。1.1.2试剂与仪器质粒p C 0 1 3-T w i n s t r e p-S UMO-h u L w C a s 1 3 a购自武汉淼灵生物科技有限公司;细菌基因组核酸提取使用E.Z.N.A.B a c t e r i a lD NA K i t(美国Om e g aB i o-t e k公司);沉积物样品D NA提取使用F a s t D-NAS p i nK i t f o rS o i l(MPb i o);R P A使用T w i s t-Am pB a s i ck i t(T w i s t D x);T 7 R NA聚 合 酶、NT P s、柱形R NA纯化试剂盒和R N a s e抑制剂均购于纽英伦生物技术(北京)有限公司;A B I7 5 0 0实时荧光定量P C R仪购于美国赛默飞公司;S p e c t r a-M a x i D 5多功能酶标仪购于美谷分子仪器(上海)有限公司。1.2 试验方法1.2.1 L w C a s 1 3 a的表达与纯化将质粒p C 0 1 3-T w i n s t r e p-S UMO-h u L w C a s 1 3 a转化至R o s e t t a TM(D E 3)p L y s SS i n g l e s感受态细胞(美国M i l l i p o r e公司)后,进行C a s 1 3 a的表达,调整异丙基硫代半乳糖苷(I P T G)浓度、诱导温度和诱导时间等以优化蛋白表达条件,利用重组蛋白N末端的H i s标签进行镍柱纯化,同时利用类泛素蛋白修饰分子(S UMO)标签促溶促表达,经酶切后过离子柱去除标签,获得纯净目的蛋白后透析并于-8 0保存于蛋白储存缓冲液(6 0 0mm o l/LN a C l、2 0mm o l/LT r i s-HC l、5%甘油、1mm o l/L二硫苏糖醇,p H8.0)中。1.2.2 R P A引物设计灿烂弧菌的保守基因包括g y r B、1 6 Sr R NA、t o x R、h s p 6 0、v h h p 2等,在G e n B a n k中下载相关基因序列并在M e g A l i g n中比对分析,最终选定在细菌中广泛存在,在基因组中呈单拷贝、进化速度相对更快、碱基替换率高、无频繁的基因水平转移、特别适合亲缘关系较近菌种的区别和鉴定的g y r B基因作为检测灿烂弧菌的靶标基因2 4-2 6。选取5 0株灿烂弧菌和1 7株非灿烂弧菌(包括鳗弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌和迟缓爱德华氏菌等)的g y r B基因,寻找灿烂弧菌g y r B基因特异的保守区序列,并据此设计其R P A引物,在反向引物5 端 添 加T 7R NA聚 合 酶 启 动 子 序 列(表1)。336第4期刘 骥等:仿刺参腐皮综合征病原灿烂弧菌R P A-C a s 1 3 a检测方法的建立表1 灿烂弧菌R P A引物、c r R NA和R NA报告探针序列 T a b.1 S e q u e n c e s o fV i b r i os p l e n d i d u sR P Ap r i m e r s,c r R N Aa n dR N A-p r o b e名称N a m e类别T y p e序列(5 3)S e q u e n c eV.s p l e n d i d u s-R P A-FR P A上游引物T C C T AA T T GA GAA C C C A G G T GAAG C GAAAA T C GV.s p l e n d i d u s-R P A-RR P A下游引物T AA T A C GA C T C A C T A TA G G G*T G C T T A G C T GA T C C G C C A G C A GA G T C T C C T T CV.s p l e n d i d u s-c r R NAC R I S P RR NA(c r R NA)GAUUUA GA C UA C C C C AAAAA C GAA G G G GA C UAAAA CG A U G C A G C G C G U A A A G C U C G U G A G A U G AR NA-p r o b e报告探针F AM-T r U r U r U r U r U r C-B HQ 1注:*.T 7R NA聚合酶启动子序列;.C R I S P R阵列中可形成发夹结构的重复序列;.C R I S P R阵列中源于灿烂弧菌g y r B基因的间隔序列;.报告探针中前面带“r”的为核糖核苷酸.N o t e:*.T 7R NAp o l y m e r a s ep r o m o t e r s e q u e n c e;.R e p e a t s e q u e n c e t h a t f o r m sh a i r p i ns t r u c t u r e i n t h eC R I S P Ra r r a y;.s p a c e r s e q u e n c ed e-r i v e df r o mg y r Bg e n eo fV.s p l e n d i d u si nt h eC R I S P Ra r r a y;.n u c l e o t i d e s i nt h eR NA-p r o b ew i t h l e t t e r s“r”i nf r o n t r e p r e s e n t r i b o n u c l e o t i d e.1.2.3 c r R NA的制备根据设计的灿烂弧菌c r R NA序列(表1),合成用于 体 外 转 录c r R NA的 模 板(5 -T C AT C T C A CGAG C T T T A C G C G C T G C AT C G T T T T AG T C C C CT T C G T T T T T G G G G TAG T C TAAAT C C C C TATAG T GAG T C G T AT T A-3,下划线部分为T 7R NA聚合酶的启动子序列)及其互补链,通过双链退火反应和T 7R NA聚合酶 纽英伦生物技术(北京)有限公司 体外转录制备c r R NA。1.2.4 R P A强化的C R I S P R-C a s 1 3 a检测参照T w i s t Am pB a s i ck i t(T w i s t D x)说明书配置灿烂弧菌R P A反应体系(5 0L):将基础缓冲液2 9.5L,1 0m o l/L上、下游引物(表1)各2.4L,双蒸水1 2.2L,1.0LD N A模板加入到T w i s t-d x Am p基础单元中,混匀后加入2.5L乙酸镁溶液(2 8 0mm o l/L),3 7孵育2 0m i n进行R P A反应。C R I S P R-C a s 1 3 a检测反应体系如下(5 0L):5LR P A扩增产物,2 2.5n m o l/Lc r R NA,4 5n m o l/LC a s 1 3 a,2LR N a s ei n h i b i t o r 纽英伦生物技术(北京)有限公司,1 2 5n m o l/LR NA-p r o b e(青岛友虹生物化学科技有限公司),0.6LT 7R NAP o l y-m e r a s eM i x,2.5LNT PB u f f e rM i x 纽英伦生物技术(北京)有限公司,最后用C a s 1 3 a检测缓冲液(6 0mm o l/LN a C l、4 0mm o l/LT r i s-HC l、6mm o l/L M g C l2,p H 7.3)补 齐 至5 0L。通 过S p e c t r a-M a x i D 5多功能酶标仪在3 7下孵育2h,并于4 8 5n m的激发光和5 2 0n m的发射光下每5m i n收集1次荧光信号。1.2.5 R P A-C a s 1 3 a检测的灵敏度和特异性试验根据质粒质量浓度和长度计算稀释前人工合成含有g y r B基因的质粒(擎科生物)的拷贝数,并进行梯度稀释,最终获得5.51 015.51 08拷贝/L共8个g y r B基因的密度梯度,作为D NA模板对灿烂弧菌的C R I S P R-C a s 1 3 a结合R P A检测方法进行灵敏性评价。按同样梯度稀释方法制备灿烂弧菌荧光定量P C R检测的D NA模板标准品并进行荧 光 定 量P C R检 测 反 应 体 系:1 0L 2S Y B RG r e e nP r oT a qH SP r e m i x(艾科瑞生物),1LD NA模板,1 0m o l/L上、下游引物(同R P A引物,见表1),0.4LR O Xr e f e r e n c ed y e(艾科瑞生物),d d H2O补 齐 至2 0L。反 应 条 件:9 5 5m i n;9 51 0s;6 0 3 0s,共4 0个循环。得到其对应循环阈值并以循环阈值3 5为阳性判别标准。比较R P A-C a s 1 3 a和荧光定量P C R的检测敏感性差异。选取灿烂弧菌,与灿烂弧菌同属不同种的创伤弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌,与弧菌亲缘关系相近的美人鱼发光杆菌,仿刺参的常见致病菌产黑假交替单胞菌、嗜水气单胞菌和水产动物常见致病菌迟缓爱德华氏菌及其混合培养物(9种菌株混合培养及无灿烂弧菌8种菌株的混合培养)作为对照,提取其基因组D NA,利用灿烂弧菌的R P A引物(表1)对提取获得的D N A进行R P A反应和后续C R I S P R-C a s 1 3 a检测,判断该检测方法的特异性。1.2.6 养殖环境样本验证采集青岛、烟台和威海养殖池塘3 2份仿刺参的皮肤黏液样本、1 5份养殖水体样本和1 0份表层沉积物样品,通过十二烷基苯磺酸钠-苯酚-氯仿法进行皮肤黏液样本和养殖水体样品D NA提取,利用试剂盒提取表层沉积物样品D N A,以R P A-C a s 1 3 a和荧光定量P C R(q R T-P C R)法进行同步检测,比较两种方法对检测实际养殖环境样本的效果一致性。1.2.7 统计分析采用R软件进行统计学分析,计量资料采用学生t检验,计数资料采用配对卡方检验,分析不同荧光信号强度的差别以及不同方法检测实际养殖环436水 产 科 学第4 2卷境样品中灿烂弧菌检出率的结果差异,双尾P0.0 5认为有统计学差异。2 结果与分析2.1 L w C a s 1 3 a的表达及纯化对L w C a s 1 3 a目的基因进行克隆,并对蛋白表达条件进行优化,最终选定5 0 0m o l/LI P T G,1 8诱导表达1 6h,经镍柱纯化、S UMO蛋白酶切割、离子柱纯化和透析后,通过S D S-P AG E电泳检测产物,结果显示获得了高纯L w C a s 1 3 a(图2)。2.2 灿烂弧菌C R I S P R-C a s 1 3 a结合R P A检测的灵敏度以梯度稀释的D NA质粒标准品(5.51 015.51 08拷 贝/L,g y r B)作 模 板 进 行 检 测,发 现R P A-C a s 1 3 a的检测灵敏度为5 5 0拷贝/L(g y r B)(图3)。荧光定量P C R和R P A-C a s 1 3 a具有相同的检测灵敏度,亦为5 5 0拷贝/L(g y r BD NA分子的密度低于5 5 0拷贝/L时,P C R扩增的循环阈值大于3 5,图4)。图2 纯化L w C a s 1 3 a蛋白的S D S-P A G E检测F i g.2 S D S-P A G Ed e t e c t i o no fp u r i f i e dL w C a s 1 3 ap r o t e i n图3 R P A-C a s 1 3 a检测灿烂弧菌g y r B基因的灵敏度测试F i g.3 S e n s i t i v i t y t e s t f o rR P A-C a s 1 3 ad e t e c t i o no fV.s p l e n d i d u sg y r Bg e n eDW.双蒸水;5.51 015.51 08.5.51 015.51 08拷贝/L(g y r B);*.与DW组比较有显著性差异(P0.0 5).DW.d d H2O;5.51 015.51 08.5.51 015.51 08c o p i e s/L(g y r B);*.c o m p a r e dw i t hDWg r o u p,s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e sw e r eo b s e r v e d(P0.0 5)、一致性高(K a p p a=1.0 0)(表2)。图5 R P A-C a s 1 3 a检测灿烂弧菌g y r B基因的特异性测试F i g.5 S p e c i f i c i t y t e s t f o rR P A-C a s 1 3 ad e t e c t i o no fV.s p l e n d i d u sg y r Bg e n e*.与其他组比较有显著性差异(P0.0 5);红色表示检测结果为阳性,黑色表示检测结果为阴性.*.c o m p a r e dw i t ho t h e rg r o u p s,s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e sw e r eo b s e r v e d(P0.0 5).I nc o n c l u s i o n,t h i s s t u d ye s t a b l i s h e dan o v e l r a p i d,s i m p l e,s e n s i t i v ea n ds p e c i f i cR P A-C a s 1 3 aq u a n t i t a t i v ed e t e c t i o nm e t h o df o rV.s p l e n d i d u s,w h i c hp r o v i d e sap o w e r f u lm o l e c u l a r t o o l f o rp r e v e n t i n ga n dc o n t r o l l i n gt h eo c c u r r e n c eo f s e ac u c u m b e rS U S.K e yw o r d s:C R I S P R-C a s 1 3 a;R P A;V i b r i os p l e n d i d u s;A p o s t i c h o p u sj a p o n i c u s;r a p i dm o l e c u l a rd e t e c-t i o n936第4期刘 骥等:仿刺参腐皮综合征病原灿烂弧菌R P A-C a s 1 3 a检测方法的建立