肥厚心肌细胞STAT-3与Beclin-1表达水平改变的研究.pdf

South China Journal of Cardiovascular Diseases,March 2023,Vol 29,No 2肥厚心肌细胞STAT-3与Beclin-1表达水平改变的研究陆晓婷1，2，陈思程2，林吉进1，21.南方医科大学第二临床医学院，广州510260；2.南方医科大学附属广东省人民医院（广东省医学科学院）广东省心血管病研究所心内科，广州 510080摘要：目的研究心肌细胞肥厚时STAT-3与Beclin-1表达水平改变的情况，探索STAT-3和Beclin-1表达异常在心肌肥厚的发生、发展中的意义。方法心肌肥大模型的建立：实验组用异丙肾上腺素（isoproternol，ISO）（10 mol/L）和去氧肾上腺素（phenylephrine，PE）（100 mol/L）分别干预H9c2心肌细胞48 h；对照组不加药，定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测MYH7基因的表达，细胞免疫荧光染色后，利用图像软件计算细胞大小。细胞实验验证：实验组用ISO（10 mol/L）与PE（100 mol/L）分别处理H9c2心肌细胞48 h；对照组不加药，定量 PCR 检测 STAT-3 与 Beclin-1 的基因表达水平，Western blot 检测 STAT-3 与 Beclin-1 的蛋白表达水平。结果经 ISO 与 PE 处理的 H9c2 心肌细胞的 MYH7 基因表达水平升高（P0.005），细胞表面积增大（P0.001）。ISO 干预组 STAT-3、Beclin-1 的基因表达水平及蛋白水平均比对照组显著升高，差异有统计学意义（P0.05）。PE干预组的STAT-3、Beclin-1的基因表达水平及蛋白表达水平均比对照组显著升高，差异有统计学意义（P0.01）。结论本实验发现经ISO或PE处理所致的肥厚心肌细胞中，STAT-3与Beclin-1的基因表达和蛋白表达水平显著升高，提示STAT-3和Beclin-1的表达异常参与了心肌肥厚发生、发展，这一结果为寻找心肌肥厚治疗新靶点提供一定的线索。关键词：心肌肥厚；STAT-3；Beclin-1中图分类号：R542文献标志码：A文章编号：1007-9688（2023）02-0184-06Study on the Changes in the Expressions of STAT-3 and Beclin-1 in Hypertrophic CardiomyocytesLU Xiaoting1，2，CHEN Sicheng2，LIN Jijin1，2（1.The Second Clinical Medical College of Southern Medical University，Guangzhou 510260，China；2.Department of Cardiology，Guangdong Provincial Peoples Hospital（Guangdong Academy of Medical Sciences），Southern Medical University，Guangzhou510010，China）Abstract：ObjectivesTo observe the changes in the expressions of STAT-3 and Beclin-1 in hypertrophic cardiomyocytes and to evaluate the role of STAT-3 and Beclin-1 in the occurrence and development of myocardial hypertrophy.MethodsModeling hypertrophic cardiomyopathy：H9c2 cardiomyocytes in experimental group were treated with isoproternol（ISO）（10 mol/L）and phenylephrine（PE）（100 mol/L）for 48 h，while those in control group were not treatedwith drugs.The expression of MYH7 gene was detected by quantitative polymerase chain reaction（PCR）.After immunofluorescence staining，the cell size was calculated by image software.H9c2 cardiomyocytes in experimental group weretreated with ISO（10 mol/L）and PE（100 mol/L）for 48 h，while those in control group were not treated with drugs.The gene expressions of STAT-3 and Beclin-1 were detected by quantitative polymerase chain reaction（PCR），andthe protein expressions of STAT-3 and Beclin-1 were detected by Western-blot.ResultsThe expression of MYH7gene was higher in H9c2 cardiomyocyte treated with ISO or PE（P0.005），and the cell surface area of it was bigger（P0.001）.The expressions of STAT-3 and Beclin-1 genes and proteins in ISO intervention group were higher than those incontrol group（P0.05）.The expressions of STAT-3 and Beclin-1 genes and proteins in PE intervention group were higherthan those in control group（P0.01）.ConclusionsIn this study，the genes and proteins expressions of STAT-3 andBeclin-1 significantly increase in hypertrophic cardiomyocytes treated with ISO or PE，suggesting that STAT-3 anddoi：10.3969/j.issn.1007-9688.2023.02.13 实验研究 收稿日期：2022-11-23基金项目：广州市科技计划项目（项目编号：202002030088）。作者简介：陆晓婷（1996-），女，在读硕士研究生，研究方向为心血管内科疾病诊治。通信作者：林吉进，E-mail: 184岭南心血管病杂志2023年3月第29卷第2期心肌肥厚是心肌对各种生理性或病理性刺激的适应性反应，以增强心脏泵功能及降低室壁张力1-2。病理性心肌肥厚是压力或容量超负荷等病理性刺激及神经体液调节的共同作用结果，其与生理性肥厚的不同表现为心肌细胞向心性或离心性（晚期）肥大，蛋白合成增加，线粒体功能障碍，胎儿基因（NPPA、NPPB、MYH7等）的重新激活等1-3。病理性心肌肥厚最终可发生各种不良心血管事件，如心力衰竭、心律失常、死亡等1-3。而目前治疗心肌肥厚只能延缓心肌肥厚的进展，而不能使其消退4。自噬是一种进化保守的降解细胞质元件的机制，在蛋白质和细胞器的质量控制中起着至关重要的作用5-7，已成为心脏稳态和功能的主要调节因素8。自噬主要有两种不同的功能：旧的或受损的分子的更新、饥饿期间营养储备的补充，饥饿期间的自噬诱导涉及由 mTORC1 失活所介导的营养感应途径9。心脏保护性自噬的诱导有助于减轻压力超载所致的心肌肥厚10，而抑制过度的心脏自噬也有利于改善压力过载诱导的心肌肥厚11。自噬过程十分复杂，早期心肌细胞受到刺激后内质网膜上通过 Beclin-1/VPS34 形成吞噬泡。不少研究证明STAT3信号通路与自噬过程的多个方面有关，此通路通过对几种自噬相关基因（如 BCL2 家族成员、BECN1、PIK3C3、CTSB、CTSL、PIK3R1、HIF1A、BNIP3 等）的转录调控来调节自噬。因此，深入探究 STAT3 信号通路如何影响自噬可以为寻找心肌肥厚治疗新靶点提供一定的线索。1材料和方法1.1实验材料1.1.1实验仪器超微量分光光度计 Nanodrop2000：美国 Thermo Fisher Scientific 公司；荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：德国qTOWER3G；正置荧光显微镜：上海尼康仪器有限公司；全波长酶标仪：美国 ThermoScientific，MultiskanGO。1.1.2主要药品和试剂高糖 DMEM 培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）、0.25%胰酶：美国 Gibco 公司；盐酸异丙肾上腺素（isoproternol，ISO）注射液、盐酸去氧肾上腺素（phenylephrine，PE）注射液：上海禾丰制药有限公司；鬼笔环肽（PF00003）：Proteintech公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒：美国 Thermo Fisher Scientific 公司；Evo M-MLV 反转录试剂预混液、SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒：中国艾科瑞生物工程有限公司；免疫染色一抗稀释液：上海碧云天生物技术有限公司；STAT3 抗体（sc-293151）：圣克鲁斯生物技术（上海）有限公司；Beclin1 抗体（3738）：CellSignaling Technology 公 司；司；Si 抗 体（bs-0061R）：北京博奥森生物技术有限公司。1.2实验方法1.2.1细胞处理实验组用不同浓度的10 mol/L的 ISO 和 10 mol/L 的 PE 进行处理，处理时间为48 h，以诱导心肌细胞肥厚模型。1.2.2细胞免疫荧光实验对两个实验组的H9c2细胞，加入 4%多聚甲醛室温固定 1520 min，PBS清洗加入 0.2%Triton X-100。PBS 清洗后加 20 30 L的鬼笔环肽抗体稀释液（1 100），室温孵育20 min，PBS清洗后。加入抗荧光衰减封片剂 含4，6-二脒基-2苯基吲哚（DAPI）进行染色。在正置荧光显微镜下用Image-Pro Plus 6.0软件计算每个视野的细胞总表面积。1.2.3细胞总RNA提取12孔细胞培养板，加入PBS清洗后，加入1 mL的RNA提取试剂，吹打后，加入 200 L 三氯甲烷，振荡、离心（12 000 r/min、15 min），吸取上层水相，加入等体积的异丙醇，混匀，离心（4、12 000 r/min、15 min），室温干燥5 min，加入 4 预冷的 75%乙醇洗 RNA 沉淀后，离心（4、7 500 r/min、15 min）。加入15 L无RNA酶水溶解、混匀后，使用超微量分光光度计Nanodrop2000进行检测RNA浓度。1.2.4反转录反应（1）反转录反应体系（10 L）配制如下：2 L 的 5x Evo M-MLVRT Master Mix，500 ng的总RNA，无RNA酶水补足到10 L；（2）反应条件：37、15 min，85、5 s，4；（3）反转录得到的cDNA保存于-20，尽快用于实时荧光定量PCR。1.2.5实时荧光定量聚合酶链反应（1）定量Beclin-1 are involved in the occurrence and development of myocardial hypertrophy.This result provides the clue forexploring new therapeutic targets of myocardial hypertrophy.Key words：hypertrophic cardiomyocytes；STAT-3；Beclin-1 185South China Journal of Cardiovascular Diseases,March 2023,Vol 29,No 2PCR 反应体系（10 L）配制见表 1；（2）反应程序（两步法）见表2；（3）引物序列见表3。1.2.6蛋白质免疫印迹（Western blot）实验向12孔细胞板加入组织裂解液抽提蛋白，用 BCA 蛋白定量试剂盒（碧云天）测定总蛋白浓度，加入一定比例的蛋白上样缓冲液，95金属浴 10 min，取20 g蛋白进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）电泳，转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，5%脱脂牛奶封闭 1 h，进行一抗（RAGE，1 1 000）孵育，4过夜，洗膜3次，每次5 min，进行HRP标记的二抗（1 1 000）孵育，4孵育1 h，洗膜，最后化学发光试剂（ECL）显色进行扫描拍照。1.3统计学分析采用SPSS 20.0处理数据。计量数据符合正态分布和方差齐性规律以（xs）表示，采用t检验。计数数据以 n（%）表示，行卡方（2）检验。以 P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1ISO与PE刺激H9c2细胞诱导心肌肥厚使用定量PCR实验检测作为心肌肥厚标记分子之一的 MYH7 基因，以确定心肌肥厚细胞模型是否构建成功。实验组用 ISO（10 mol/L）与 PE（100 mol/L）分别干预 H9c2 心肌细胞 48 h 后，其MYH7 基因表达较对照组均增加，差异有统计学意义（P=0.0022，P=0.0044），提示均成功诱导心肌细胞肥厚，如图1。2.2细胞免疫荧光结果在定量PCR实验提示心肌肥厚细胞模型构建成功的基础上，进一步使用细胞免疫荧光实验进行验证。ISO（10 mol/L）与 PE（100 mol/L）分别作用48 h的实验组细胞表面积比对照组均有所增大，差异有统计学意义（均P0.0001），进一步验证两者均诱导H9c2细胞发生心肌肥厚，如图2。表1定量PCR反应体系组分2X SYBR Green Pro Taq HSPremixcDNA上游引物下游引物无RNA酶水总体积加入体积（L）510.40.43.210表2反应程序（两步法）Step1Step2Step3温度959560时间30 s5 s30 sDissociation Stage循环次数1次40次表3引物序列引物名称R-MYH7-FR-MYH7-RR-STAT3-FR-STAT3-RR-Beclin1-FR-Beclin1-RR-actin-FR-actin-R引物序列（5-3）GCGGACAAAGGCAAAGGCAAGGCAAAATGCAGCGTACAAAGTGAGGGTGCGTGACATTCCCAAGGAGGAGGCCTACCTGGGTCAGCTTCAGGAGGAGTTGCCGTTGTACTGTTCTGTGCCTCCAGTGTCTTCAATCTTGCGCAGGAGTACGATGAGTCCGACGCAGCTCAGTAACAGTCC注：R=rat大鼠，F=forward上游，R=reverse下游。图 1ISO（10 mol/L）与 PE（100 mol/L）分别干预 48 h的MYH7基因相对表达量（内参基因为-actin；A为ISO，B为PE）ControlPE*MYH7ControlISO*MYH72.01.51.00.50.0Expression2.01.51.00.50.0Expression 186岭南心血管病杂志2023年3月第29卷第2期2.3心肌肥厚STAT3与自噬表型的表达ISO（10 mol/L）与 PE（100 mol/L）分别处理H9c2心肌细胞48 h后，STAT3与Beclin1的蛋白表达水平相较于对照组均有不同程度的升高趋势，如图3。2.4定量聚合酶链反应结果如前所述，ISO（10 mol/L）与PE（100 mol/L）分别干预48 h均可促使H9c2细胞产生心肌肥厚。定量 PCR 实验结果显示 ISO 干预组的 STAT3（P=0.011 7）与 Beclin1（P=0.048 1），以及 PE 干预组的STAT3（P=0.006 8）与Beclin1（P=0.000 2）基因表达水平相比于对照组均有不同程度的升高，与Western-blot结果相吻合，即STAT3与自噬表型在心肌肥厚时发生激活，如图4。3讨论作为许多心血管疾病的共同病理特征，心肌肥厚与重构的病因包括原发性高血压（高血压）、瓣膜病、心肌梗死与心肌病等，长期持续的心肌肥厚性生长会导致心功能不全，增加心力衰竭、致命性心律失常的风险1，12。自噬是一种适应性的细胞保护机制，对细胞存活、稳态和功能很重要。许多研究证实心肌自噬失调会促进心肌肥厚，最终导致心力衰竭的发生。由此可见，研究自噬相关机制可以为探索心肌肥厚新的治疗靶点提供一定的线索13。STAT3 是一种转录因子，通过与细胞表面的多肽受体相互作用介导细胞外信号，例如细胞因子和生长因子。从过去的许多研究中我们可以发现，STAT3对自噬的许多步骤都有影响，从自噬体的组装到它们的成熟。不同细胞定位的STAT3以图2-1ISO（10 mol/L）作用48 h的细胞表面积Control 48 hISO 10 mol/L 48 h*ControlISO100 00080 00060 00040 00020 0000细胞表面积*ControlPE40 00030 00020 00010 0000细胞表面积Control 48 hPE 100 mol/L 48 h图2-2PE（100 mol/L）作用48 h的细胞表面积图3ISO与PE分别处理H9c2心肌细胞48 h后的STAT3与Beclin1的Western-blot 条带（内参蛋白为-actin；A为ISO，B为PE）ISO（mol/L）01048 hSTAT3Beclin1actin91 kD60 kD42 kDPE（mol/L）010048 hSTAT3Beclin1actin91 kD60 kD42 kD 187South China Journal of Cardiovascular Diseases,March 2023,Vol 29,No 2不同方式调节自噬。细胞质中的 STAT3 单体在Tyr705 上被 Src 或 JAK 激酶磷酸化形成 STAT3 二聚体，穿梭到细胞核中并与特定的 DNA 元件结合，转录激活或抑制靶基因（如BCL2，BECN1等基因），根据不同的细胞环境或刺激抑制或刺激自噬。STAT3单体也易位到线粒体并与电子传递链（ETC）的复合物和相互作用以抑制活性氧自由基（ROS）的产生，从而抑制自噬14。此外，不少研究证明 STAT3 参与心肌肥厚的发生、发展。当心肌细胞受刺激时，JAK/STAT 通路激活白细胞介素-6 家族细胞因子来诱导心肌细胞生长15-20。4结论本研究证实STAT3与自噬相关的蛋白Beclin-1在肥厚心肌细胞中的基因表达水平及蛋白表达水平均升高，这提示在肥厚心肌细胞中自噬与STAT3 可能存在相互作用的，而心脏保护性自噬的诱导可以改善心肌肥厚。本研究结果为寻找心肌肥厚治疗新靶点提供一定的线索。参考文献：1 NAKAMURA M，SADOSHIMA J.Mechanisms of physiological and pathological cardiac hypertrophy J.Nat RevCardiol，2018，15（7）：387-407.2 HEINEKE J，MOLKENTIN J D.Regulation of cardiachypertrophy by intracellular signalling pathwaysJ.NatRev Mol Cell Biol，2006，7（8）：589-600.3 LIU R，KENNEY J W，MANOUSOPOULOU A，JOHNSTON H E，et al.Quantitative Non-canonical amino acidtagging（QuaNCAT）proteomics identifies distinct patterns of protein synthesis rapidly induced by hypertrophic agents in cardiomyocytes，revealing new aspects ofmetabolic remodelingJ.Mol Cell Proteomics，2016，15（10）：3170-3189.4 SUN Y，CHEN C，XUE R，et al.Maf1 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