免疫组化入门实验操作.doc

免疫组化入门实验操作
一、实验目的：
1. 了解免疫组化基本原理。
2. 了解免疫组化实验操作及注意事项。
3. 免疫组化结果判定。
通过实验，让学生熟悉免疫组化操作流程及注意事项，对抗原抗体结合、抗原修复和酶催化底物显色进行研究。要求学生通过查阅文献，在归纳、对比、总结的基础上对免疫组化有进一步的了解。
二、实验原理：

三、实验材料：
一抗：CD5、CK8、Ki67
二抗： MaxVision3
其它：柠檬酸抗原修复液、过氧化物酶阻断剂、PBS缓冲液、DAB、孵育盒、染色架、苏木素、盖玻片、冲洗瓶、中性树胶，孵育盒。
四、实验步骤：
1. 脱蜡水化
二甲苯5min，二甲苯5min，二甲苯5min，无水乙醇2min，无水乙醇2min，95%酒精2min，85%酒精2min，自来水冲洗。
2. 抗原修复
高压锅中加入1200mL柠檬酸修复液，电磁炉煮沸后放入切片，扣紧锅盖，功率调至800W，至压力阀均匀喷气后计时1.5min，移开高压锅室温冷却10min，自来水冷却。
3. 过氧化物酶阻断
修复结束后，流水冲洗干净，除去自来水，在离组织3mm处用免疫组化油笔画圈或用纸巾擦干组织外残留的液体，滴加50 μL（一滴） 过氧化物酶阻断剂，室温孵育10min，PBS冲洗3×3min。
4. 一抗
甩去PBS，纸巾擦干组织3mm外的残留液体，每张切片加50 μL（一滴）相应一抗，室温下孵育60分钟，PBS冲洗3×3min。
5. 二抗
甩去PBS，纸巾擦干组织3mm外的残留液体，每张切片加50 μL（一滴）MaxVisionTM试剂，室温下孵育30分钟，PBS冲洗3×3min。
6. DAB
甩去PBS液，纸巾擦干组织3mm外的残留液体，每张切片加50 μL（一滴）新鲜配制的DAB，显色5分钟，自来水冲洗。
7. 苏木素复染
每张切片滴加50 μL（一滴）苏木素，20-30秒后自来水冲洗30s以上，或浸泡于PBS中30s以上再自来水冲洗。
8. 封片
梯度酒精脱水干燥（85%酒精2min，95%酒精2min，无水乙醇2min，无水乙醇2min，二甲苯1min），或直接电吹风吹干，中性树胶封固。
修复方法
一、 柠檬酸缓冲液高温高压修复法
取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液（800-1500ml）于压力锅中，大火加热至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片至于不锈钢或耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中。盖上锅盖，扣上压力阀，将功率调至800W,继续加热至喷气，从喷气开始计时，1.5分钟后，压力锅离开热源，室温冷却10分钟后用自来水冲淋高压锅外壁加速冷却至室温，取出玻片，自来水冲洗干净。
注意事项：
1、加热时间长短（1.5分钟）和加热功率（800W）的控制很重要，时间过短可能会使染色强度变浅，时间过长可能会使染色背景加深。
2、必须使用不锈钢或耐高温塑料切片架，不能使用铜架，以防缓冲液pH值增高而导致掉片。
3、高压锅离开热源后必须等缓冲液冷却后，才能把切片取出。
4、为防止组织脱落，必须使用防脱玻片。
5、缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到。
二、 EDTA水煮修复法
取500mlEDTA抗原修复液于1000ml不锈钢锅中，加热至沸腾，将电磁炉功率调至保温状态（120W），使修复液保持微沸状态。将脱蜡水化后的切片置于耐高温染色架上，再将染色架缓慢放入不锈钢锅中（注意：若快速放入可能会导致组织脱落），之后加盖继续加热20分钟。再将不锈钢锅从电磁炉上移开，室温冷却10分钟后用自来水冲淋不锈钢锅外壁加速冷却至室温，取出玻片，自来水冲洗干净，除去自来水，在离组织3mm处用免疫组化油笔画圈，PBS冲洗2次，每次3分钟。
注意事项：
1、加热时间长短（20分钟）和加热功率（120W）的控制很重要
2、修复液不能重复使用。
3、工作液的量必须保证切片始终能浸泡在液体内。
4、为防止组织脱落，必须使用防脱玻片。
5、抗原修复后一定要等修复液冷却后，才能将切片取出。

石蜡切片制作和HE染色
一、目的要求：简要介绍石蜡切片的制作和苏木精、 曙红染色法（简称H.E染色法），
借以了解石蜡切片制作的基本原理和一般方法。
二、实验用具：解剖器一套、单面刀片、切片刀、切片机、载玻片、盖玻片、标本瓶、烧杯、量筒、漏斗、染色缸、树胶瓶、酒精灯、毛笔、绘图纸、滤纸、熔蜡箱（或恒温箱）、展片台（或烫板）、小木块、蜡带盒、烤片盒、切片托盘。
三、实验材料：蛙或小白鼠。
四、实验内容：
（一）药品：
１、７０％、８０％、９０％、９５％酒精及无水酒精：
９５％以下的各级浓度酒精是用９５％酒精加蒸馏水稀释而成。简单的稀释方法：所需稀释的浓度是多少，就量取多少毫升原浓度的酒精，再加蒸馏水至该酒精的原浓度即可。例如，配制７０％酒精，就量取７０ml９５％酒精，然后加入２５ml蒸馏水即成。
２、固定液：
　常用的固定液有１０％福尔马林、Bouin氏液和Zenker氏液等。Bouin氏液在组织学切片技术方面应用甚广，配方如下：
　苦味酸饱和水溶液 ７５ml
　福尔马林 　　 ２５ml
　冰醋酸 　　 ５ml
３、蛋白甘油：
蛋白甘油是粘贴蜡片用的粘片剂。配方如下：取一新鲜鸡蛋的蛋白，充分搅拌成雪花状泡沫，然后滤去泡沫，加入等量甘油，搅拌均匀，再加入一小粒麝香草酚防腐。
４、染色液：
　以H.E.染色法为例，需配制苏木精染液和曙红染液。
⑴、苏木精染液：苏木精是一种碱性染料，它可将染色质染成蓝紫色。配方有多种，现介绍Harris氏苏木精的配制：
甲液： 苏木精 　 　 ０.５ g
９５％酒精 　　　 ５.０ ml
乙液： 硫酸铝钾（或硫酸铝铵） １０g
　 蒸馏水 　　　 １００ ml
　氧化汞 　　　　０.２５g
　 冰醋酸 　　　　几滴
　 先将甲液溶解，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水中，并加热使溶解，然后将两液混合煮沸，离开火焰后缓缓加入氧化汞。冷却后过滤，加入几滴冰醋酸即成。
⑵、０.５％曙红酒精溶液：即０.５g曙红溶于１００ml９５％酒精中。 曙红是一种酸性染料，它可使多种细胞的细胞质染成粉红色或红色。
５、盐酸酒精：
盐酸酒精用于分色。配制方法是在１００ml７０％酒精中加入１ml盐酸。
６、其它：
　二甲苯、切片石蜡、中性树胶等。
（二）、操作步骤：
　进行组织学研究，必须把活的组织或器官制作成切片标本，以便在显微镜下进行观察。切片标本也就是利用组织的不同结构，经过染色后呈现出不同的颜色和不同的折光率而制作的。制片的方法众多，但基本要求是尽量保持结构的真相，切成薄的切片，应用不同的染色方法，使内部结构清晰易见。
　石蜡切片法是最常用的一种制片法。其制作过程是：取材→固定→冲洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→贴片→烤片→脱蜡→复水→染色→脱水→透明→封藏。现分述如下：
１、取材和固定：
固定的目的在于保存组织内细胞原有的结构和形态，使其与生活时相似，因此要求固定的材料越新鲜越好。把动物杀死后应立即割取组织块，并快速投入固定液中。
将蛙或小白鼠快速剪去头部，打开腹腔，用锐利的刀片割取小块组织（肝、肠等）。 组织块的大小以厚度不超过５mm 为宜。 然后， 将取下的组织块迅速投入Bouin氏固定液中。固定时间为数小时至２４小时（需视组织块的大小而定）。
２、冲洗：
经固定的材料，可根据不同的固定液，分别用水或酒精冲洗，以洗去固定液，否则固定液留在组织会有碍染色.
　用Bouin氏液固定的材料,可直接移入70％酒精中，多换几次酒精，直至无黄色时为止。也可在酒精中加入几滴氨水或饱和碳酸锂溶液，以迅速洗去黄色。但留少许黄色也无妨碍。
　浸洗后的材料若暂时不制片，可保存于７０％酒精中。
３、脱水：
　柔软并含有多量水分的组织是易切成薄片的，故必须增加组织的硬度。石蜡切片法就是使石蜡渗入组织，以达到支持增硬的作用。但水与石蜡是不相混合的，因此，在浸蜡、包埋前须将组织中的水分完全除去，这一步骤即为脱水。
　常用的脱水剂是酒精。脱水时，先从低浓度的酒精开始，然后，递增浓度，直至无水酒精。具体方法是，将材料经７０％酒精→８０％酒精→９５％酒精（Ⅰ）→９５％酒精（Ⅱ）→无水酒精（Ⅰ）→无水酒精（Ⅱ），各级酒精１－２小时。脱水应彻底，否则材料不能透明，影响石蜡的浸入，致使难以切片。
４、透明：
酒精与石蜡不能混和，因此，脱水后的材料在浸蜡前，还必须经过透明。透明剂既可替代组织中的酒精，又能溶解石蜡，以利石蜡的渗入。二甲苯是常用的一种透明剂。
将脱水后的材料经１：１无水酒精与二甲苯→二甲苯（Ⅰ）→二甲苯（Ⅱ），各级时间为０.５－２小时，务使组织达到透明为止。
５、浸蜡：
　将已透明的材料移入熔化的石蜡内浸渍即为浸蜡。其目的是去除组织中的透明剂，而使石蜡渗入整个组织，获得一定的硬度和韧度，以便切成薄的切片。
先将装有５６－５８℃石蜡的三个蜡杯放在熔蜡箱内熔化，并使熔蜡箱的温度保持恒定（约５８℃），切勿太高或太低。 然后将透明了的材料放入蜡杯（Ⅰ）→蜡杯（Ⅱ）→蜡杯（Ⅲ）。浸蜡时间视材料大小而定，一般总的浸蜡时间为２－４小时左右。
６、包埋：
　将浸蜡后的材料包埋于石蜡中，并使它凝固成蜡块，这一过程称为包埋。
　包埋前，视组织块的大小先将绘图纸折成一纸盒，作为包埋的容器。纸盒折法如下：先折１、２线，次折３、４线，然后使a、b两折重叠，向外折出５线；同法折出６线，再折c线。最后依同法折出７、８线及d线即成。
将纸盒盛满已熔化的石蜡，随即将第三杯中已浸蜡的材料放入其中，应注意切面朝下，位置放正。然后速将纸盒半浸于冷水中，待石蜡表面凝结后，将纸盒全部浸入水中冷却。石蜡全部凝固后，拆去纸盒即成蜡块。
７、切片：
切片前，先将蜡块用刀片修整成上下两边平行的正方形或长方形，否则切出的蜡带弯曲不直，或无法连成带状。
　将修整后的蜡块粘在小木块上，小木块装在切片机上，以待切片。
　在旋转式切片机上将蜡块切成４－８um厚的薄片。切下的薄片连。蜡带。用毛笔轻轻取下蜡带，放在蜡带盒内备用。
８、贴片或烤片：
　将蜡片粘贴在载玻片上即为贴片。用小玻棒蘸取一点蛋白甘油滴于一干净的载玻片上，用手指涂匀，并加几滴蒸馏水于载玻片上。 将蜡带按要求切成适当长度的蜡片，然后用小镊子将蜡片轻放在载玻片的水面上，再把载玻片放在展片台上（温度为４５℃左右）。蜡片受热后即慢慢展平。待完全展平后，用解剖针将切片位置拨正，倾去载玻片上的余水后，将其放在烤片盒中，置于５０℃左右恒温箱内烤干。
９、染色：
　染色剂多为水溶液，故染色前必须先经脱蜡、复水等步骤。染色方法众多，以H.E.染色法而言有下列步骤：
⑴、脱蜡：将烤干的切片放入二甲苯(Ⅰ)→二甲苯(Ⅱ)中，各为５min， 以溶去切片上的石蜡。
⑵、复水：是将脱蜡后的切片经各级浓度酒精逐渐下降到水的过程，即将二甲苯(Ⅱ)中取出的切片移入无水酒精→９５％酒精→８０％酒精→７０％酒精→蒸馏水，各级中停留１－５min。
⑶、染色：
①、将蒸馏水洗涤后的切片移入Harris苏木精液中５－１０min，使细胞核着色。
②、用自来水洗去切片上残余的染液。
③、用１％盐酸酒精分色数分钟。分色时就是褪去细胞质不应着色部分的颜色，而使细胞核着色得清晰适度。分色时需随时用显微镜检查切片，使分色适度。
④、入１％氨水或自来水浸洗，使之蓝化。
⑤、在蒸馏水中浸片刻。
⑥、切片入７０％→８０％→９０％各１－２min。
⑦、入０。５％曙红酒精溶液中染色２－５min，使细胞质着色。
１０、脱水：
　　切片依次入９５％酒精(Ⅰ)→９５％酒精(Ⅱ)→无水酒精(Ⅰ)→无水酒精(Ⅱ)，各级中停留１－５min。
１１、透明：
切片入１：１无水酒精、二甲苯→二甲苯(Ⅰ)→二甲苯(Ⅱ)，各级停留１－５min。
１２、封藏：
将切片从二甲苯(Ⅱ)中取出，用纸或布擦去材料周围的二甲苯。在材料中央滴一小滴树胶，然后，用镊子加盖盖玻片。
　 切片封好后，放在切片托盘上待干燥，即可用不观察。
　染色结果：细胞核呈现鲜艳的蓝色，细胞质及细胞间质呈粉红至红色。
（三）、注意事项：
１、制片是一个连续的操作过程，往往要连续几天才能完成，因此，事先一定要制订工作日程计划，应按顺序进行工作。这样可避免和其它工作发生冲突，也不会因前后顺序颠到或超过了规定的时间，给工作带来不必要的损失。
２、制片的各个步骤都是互相关联的，如脱水不彻底就会影响到透明的程度，以至影响蜡块的质量。为此，必须对任何一个步骤，都要细致、严格进行操作。
３、通过本实验可了解到每张切片都是来之不易的，因此，应倍加爱护，不要损坏。