宏基因组二代测序对结缔组织病并发肺部感染的病原学诊断价值研究.pdf

1现代检验医学杂志第 38 卷第 5 期2023 年 9 月J Mod Lab Med,Vol.38,No.5,Sept.2023宏基因组二代测序对结缔组织病并发肺部感染的病原学诊断价值研究孙莉，马艳，厉小梅，王俐（中国科学技术大学附属第一医院风湿免疫科，合肥 230000）摘要：目的研究宏基因组二代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）对结缔组织病并发肺部感染的病原学诊断价值。方法选取 2019 年 5 月 2022 年 5 月中国科学技术大学附属第一医院风湿免疫科诊治的结缔组织病并发肺部感染患者 73 例，分析 mNGS 与传统病原学检测的检出率、检测时间、病原体种类、各类病原体检出率。将患者分为重症肺炎组（n=44）和轻症肺炎组（n=29），比较两组病原体检出率及分布情况。结果mNGS 病原体检出率（83.56%）、病毒（60.27%）、真菌（52.05%）和 2 种及以上病原体（53.42%）检出率均高于传统检测（57.53%，17.81%，34.25%，13.70%），检测时间25（5）h少于传统病原学检测（120（48）h），差异均有统计学意义（2=10.452，23.077，4.966，22.400，Z=-10.155，P=0.001，0.001，0.026，0.001，0.001）。重症肺炎组 mNGS（95.45%）和传统病原学（68.18%）检出率均高于轻症肺炎组（65.52%，41.38%），差异均有统计学意义（2=11.608，5.139；P=0.001，0.023）。结论结缔组织病并发肺部感染患者中，mNGS 检测时间更短，病原体检出率高于传统检测，其有助于快速全面地检测和鉴定病原体，明确感染诊断和指导临床治疗。关键词：宏基因组二代测序；病原学；肺部感染；结缔组织病中图分类号：Q781；R563.1文献标识码：A文章编号：1671-7414（2023）05-001-05doi:10.3969/j.issn.1671-7414.2023.05.001 Value of Metagenomic Next-generation Sequencing in the Pathogenic Diagnosis of Connective Tissue Disease Combined with Pulmonary InfectionSUN Li,MA Yan,LI Xiaomei,WANG Li（Department of Rheumatology and Immunology,the First Affiliated Hospital of University of Science and Technology of China,Hefei 230000,China）Abstract:ObjectiveTo investigate the value of metagenomic next-generation sequencing(mNGS)in the etiological diagnosis of connective tissue disease complicated with pulmonary infection.MethodsA total of 73 patients with connective tissue disease combined with pulmonary infection diagnosed and treated by the Rheumatology Department of the First Affiliated Hospital of University of Science and Technology of China from May 2019 to May 2022 were selected to analyze the detection rate,detection time,pathogen type and detection rate of various pathogens between mNGS and traditional etiological detection.The patients were divided into severe pneumonia group（n=44）and mild pneumonia group（n=29）,and the detection rate and distribution of pathogens in the two groups were compared.ResultsThe detection rate of mNGS pathogens(83.56%),viruses(60.27%),fungi(52.05%)and 2 or more pathogens(53.42%)were higher than traditional detection（57.53%，17.81%，34.25%，13.70%），and the detection time 25(5)h was shorter than traditional detection（120（48）h，and the differences were statistically significant（2=10.452,23.077,4.966,22.400，Z=-10.155,P=0.001,0.001,0.026,0.001，0.001）.The detection rates of mNGS(95.45%)and traditional etiology(68.18%)in severe pneumonia group were higher than those in mild pneumonia group（65.52%，41.38%），and the differences were statistically significant（2=11.608,5.139,P=0.001，0.023）.ConclusionIn patients with connective tissue disease complicated with pulmonary infection,the detection time of mNGS was shorter,and the pathogen detection rate was higher than that of traditional detection,which is helpful for rapid and comprehensive detection and identification of pathogens,clear infection diagnosis,and guide clinical treatment.Keywords：metagenomic next-generation sequencing；etiology；pulmonary infection；connective tissue diseases 结缔组织病（connective tissue diseases，CTD）是一种由免疫介导的慢性炎症性疾病，肺是常见的受累器官之一，主要表现为肺间质病变1。肺部感染是 CTD 患者的常见死因2-3，激素、免疫抑制剂基金项目：国家自然科学基金项目（项目编号：81871271）：组织原位记忆 T 细胞在干燥综合征中的作用及其分子调控机制的研究。作者简介：孙莉（1992-），女，硕士，住院医师，研究方向：风湿免疫系统相关疾病，E-mail:。通讯作者：王俐（1980-），女，博士，副主任医师，研究方向：风湿免疫系统相关疾病，E-mail：wang_。和生物制剂的使用，以及自身免疫功能紊乱均可导致感染风险增加。在 CTD 患者肺部感染早期明确病原学有助于靶向使用抗生素，改善预后。宏基因组二代测序（metagenomic next-generation sequenc-2现代检验医学杂志第 38 卷第 5 期2023 年 9 月J Mod Lab Med,Vol.38,No.5,Spet.2023ing，mNGS）是一种高通量测序技术，可以广泛应用于外周血、支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）等多种临床样本的各种微生物检测，具有不受培养条件限制，可以覆盖传统方法难以检测到的罕见病原体等优势，在感染性疾病早期明确病原体方面发挥重要作用4-5。CTD 患者作为免疫紊乱人群，肺部感染具有自身临床特点，本文旨在分析 mNGS 在 CTD 并发肺部感染病原学诊断中的临床价值，为 mNGS 的临床应用提供依据。1材料与方法1.1研究对象本研究为回顾性病例对照研究，选取 2019 年 5 月 2022 年 5 月中国科学技术大学附属第一医院风湿科住院的诊断为肺部感染的 CTD患者。纳入标准：同时进行 mNGS 和传统病原学检测；临床资料完整。排除标准：并发恶性肿瘤；妊娠期、哺乳期妇女。肺部感染由风湿免疫科 3 位主治医生组成的专家小组共同根据患者临床症状、传统和血清病原学检测结果、mNGS 报告、胸部 CT 表现、抗生素疗效及以往的临床诊疗经验，并参考中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南（2016 年版）6综合判断。共纳入符合标准的患者 73 例，其中男性 18 例（24.66%），女性 55 例（75.34%），年龄 16 86（55.7315.65）岁，平均住院日 20.5212.14 天。系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）22 例（30.13%），皮肌炎/多肌炎（dermatomyositis and polymyositis/dermatomyositis，DM/PM）16 例（21.92%），类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）10例（13.70%），ANCA相关性血管炎（ANCA-associated systemic vasculitis，AAV）10例（13.70%），舍格伦综合征（sjogren syndrome，SS）9例（12.33%），未 分 化 CTD（undifferentiated connective tissue dis-ease，UCTD）6 例（8.22%），依据美国感染病学会/美国胸科协会重症社区获得性肺炎的简化标 准7，重症肺炎 44 例，轻症肺炎 29 例。本研究获得中国科学技术大学附属第一医院医学研究伦理委员会批准（编号：2022-RE-356），所有患者均签署了知情同意书。1.2方法通过医院His系统收集患者性别、年龄、诊断、mNGS，传统病原学检测结果、血清学指标。患者住院期间清晨采集外周静脉血、痰液或 BALF进行传统病原学及 mNGS 检查。传统病原学检测包括血培养、痰细菌及真菌培养、痰抗酸染色、痰六胺银染色、EB 病毒（epstein-barr virus，EBV）和巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）-DNA 定量、TB-GeneXpert。mNGS 通过 MGISEQ-2000 基因测序仪（深圳华大智造科技股份有限公司），采用高通量测序技术，对样本中的核酸进行提取和测序，与数据库中已有微生物的核酸序列进行比对，参考中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识4进行 mNGS 和传统检测结果的判读。1.3统计学分析采用 SPSS24.0 软件进行分析，非正态分布的计量资料以中位数（四分位距）M（IQR）表示，两组间比较采用 Wilcoxon 秩和检验。计数资料以 n（%）表示，组间比较采用卡方检验和配对卡方检验。以 P 0.05 为差异具有统计学意义。2结果2.1mNGS 与传统病原学检测的检出率和检测时间比较mNGS 共 61 例（83.56%）检出病原体，传统检测共 42 例（57.53%）检出病原体，差异有统计学意义（2=10.452，P=0.001）。其中两种方法均阳性 36 例（49.31%），均阴性 6 例（8.22%）。mNGS 平均检测时间少于传统病原学培养 25（5）h vs 120（48）h，差异有统计学意义（Z=-10.155，P0.001）。2.2mNGS 与传统病原学检测检出病原体分布见表 1。mNGS 共检出病原体 154 株，以病毒（75 株，48.70%）和真菌（41 株，26.62%）为主。传统检测共检出病原体 65 株，以真菌（31 株，47.69%）和细菌（21 株，32.31%）为主。2.3mNGS 与传统病原学检测、病原体检出率比较73 例 CTD 并发肺部感染患者 mNGS 病毒44（60.27%）和真菌 38（52.05%）检出率高于 传 统 检 测 13（17.81%），25（34.25%），差异 有 统 计 学 意 义（2=23.077，4.966，P0.001，0.026），mNGS 细菌检出率 25（34.25%）与传统检测方法 18（24.66%）无明显差异（2=1.440，P=0.230）。mNGS 2 种 及 以 上 病 原 体 检 出 率（39/73，53.42%）高于传统病原学检测（10/73，13.70%），差异有统计学意义（2=22.400，P0.001）。mNGS检出的混合感染以真菌混合病毒为主（20/39，51.28%），传统检测检出的混合感染以真菌混合细菌最常见（5/10，50.00%）。2.4不同严重程度肺炎患者病原体分布见表 2。44 例重症肺炎患者中，mNGS 结果阳性 42 例，共检出病原体 107 株，以病毒及真菌为主；传统检测结果阳性 30 例，共检出病原体 46 株，以细菌和真菌为主。29 例轻症肺炎患者中，mNGS 结果阳性19 例，共检出病原体 47 株，以病毒及真菌为主。传统检测结果阳性 12 例，共检出病原体 19 株，以细菌和真菌为主。mNGS（95.45%vs 65.52%）和3现代检验医学杂志第 38 卷第 5 期2023 年 9 月J Mod Lab Med,Vol.38,No.5,Sept.2023传统检测（68.18%vs 41.38%）两种检测方法，重症肺炎组的病原体检出率均高于轻症肺炎组，差异有统计学意义（2=11.608，5.139；P=0.001，0.023）。表 1 mNGS 与传统病原学检测检出病原体分布类别mNGS传统病原学病原体种类n病原体种类n病原体种类n细菌流感嗜血杆菌3鲍曼不动杆菌4鲍曼不动杆菌2副流感嗜血杆菌1约翰逊不动杆菌1产酸克雷伯菌1痰液嗜血杆菌1琼氏不动杆菌1肺炎克雷伯菌4副溶血嗜血杆菌1铜绿假单胞菌1铜绿假单胞菌3嗜沫凝聚杆菌1浅绿色气球菌1金黄色葡萄球菌2凹陷诺卡菌1霍氏肠杆菌1粘质沙雷菌1巴西诺卡菌1大肠埃希菌1结核分枝杆菌2盖尔森基兴诺卡菌1铅黄肠球菌1支气管炎鲍特菌1皮疽诺卡菌2粪肠球菌1阴沟肠杆菌1卡他莫拉菌1肠沙门菌鼠伤寒血清型1大肠埃希菌2金黄色葡萄球菌1肠沙门菌伤寒血清型1沙门菌属1肺炎克雷伯菌2结核分枝杆菌5巴西诺卡菌1产酸克雷伯菌1副胞内分枝杆菌1病毒EB 病毒17人类 疱疹病毒 2 型1EB 病毒6巨细胞病毒33细环病毒2巨细胞病毒7BK 多瘤病毒3人类 疱疹病毒 3 型1JC 多瘤病毒4人类疱疹病毒 6B 型3人多瘤病毒 6 型1人类疱疹病毒 7 型4人类 疱疹病毒 1 型5人乳头瘤病毒 75 型1真菌耶氏肺孢子菌31耶氏肺孢子菌1比氏肠微孢子虫1光滑球拟酵母菌1杂色曲霉1白假丝酵母菌12烟曲霉2光滑假丝酵母菌2近平滑念珠菌2其它假丝酵母菌2出芽短梗霉1热带念珠菌4热带念珠菌1曲霉菌4拟平滑念珠菌1烟曲霉1聚多曲霉1黑曲霉1黄曲霉1土曲霉1青霉菌1其他人型支原体14现代检验医学杂志第 38 卷第 5 期2023 年 9 月J Mod Lab Med,Vol.38,No.5,Spet.2023表 2 不同严重程度肺炎患者病原体分布 n（%）类别重症肺炎组轻症肺炎组mNGS（n=107）传统病原学检测（n=46）mNGS（n=47）传统病原学检测（n=19）细菌27（25.23）13（28.26）10（21.28）8（42.11）病毒49（45.79）10（21.74）26（55.32）3（15.79）真菌30（28.04）23（50.00）11（23.40）8（42.11）其他1（0.93）0（0）0（0）0（0）3讨论结缔组织病（CTD）是一组免疫介导的慢性炎症疾病，感染及病情活动是此类患者反复住院的主要原因8-9。呼吸道是最常见的感染部位10，细菌、病毒、真菌和支原体等多种病原体均可引起呼吸道感染11，但依据临床表现和影像学检查通常难以准确鉴别，即使结合了培养和非培养技术，免疫功能低下患者严重肺炎的病因诊断也难以明确。宏基因组二代测序（mNGS）基于 NGS 平台，能够快速获取临床样本中的全部核酸序列，通过与特定的数据库比对，分析样本中微生物的种属信息，受抗生素影响小，能够同时识别样本中的所有潜在传染源12，在发现新型和罕见病原体，诊断不明原因和混合呼吸道感染性疾病方面具有明显优势。研究发现，既往使用抗生素的患者 mNGS 的敏感度显著高于微生物培养13。还有研究显示，mNGS 对传统病原学检测方法无法检测或敏感度较差的病原体和病毒有较高的检测效率14。本研究中，mNGS 病原体和 2 种及以上病原体检出率高于传统病原学检测。重症肺炎多为复杂感染，此类患者疾病复杂性和采样前抗生素暴露使病原体检测更加复杂15，本研究重症肺炎组病原体检出率高于轻症肺炎组，说明mNGS可一次性无偏性的检测细菌、真菌、病毒、寄生虫、支原体等病原体，对发现混合型感染更有优势16。CTD 患者免疫紊乱，感染进展快，早期精准治疗尤为重要。虽然传统病原学培养可以完善药敏试验指导用药，但是对于危急重症患者时效性较差，不利于及时予以抗感染治疗，甚至丧失抢救时机。本研究显示，mNGS 检测时间显著少于传统病原体培养。mNGS 检测结果一般可在 24 72 h 内获得，而传统病原学检测耗时长，一般需要 3 5 天，阴性结果常需要 7 天，分枝杆菌甚至需要 45 天。应用mNGS 可在早期明确感染病原体，有效指导抗生素的合理应用，缩短住院时间17。mNGS 可对血液、脑脊液、BALF，活检组织等多种临床标本进行检测。本研究中 mNGS 标本来源于血浆和 BALF。临床上部分患者不能耐受有创检查，血浆 mNGS 创伤小，更易采集，已被广泛应用于临床感染性疾病的诊断18，但血浆 mNGS 对于肺炎的诊断价值尚存在争议。研究显示，BALF mNGS 在病原体检测方面优于血浆 mNGS，对重症肺炎患者中的诊断准确率高于血浆 mNGS，但血浆 mNGS 在识别病毒方面具有优势19。本研究中mNGS 的病毒和真菌检出率均高于传统病原学检测。因此，当临床上怀疑病毒和真菌感染且难以获取 BALF 时，血浆 mNGS 是一个良好的选择。但由于难以破除多糖细胞壁而提取 DNA，mNGS 鉴定曲霉和隐球菌仍是一个挑战20。mNGS 目前亦存在以下劣势：检测费用较传统病原学检查明显高，不能进行药敏，不能对病原体耐药性进行指导。mNGS 检测报告提供疑似病原体列表，此类病原体主要包括检出序列数低的可能病原体、环境中常见机会致病菌、常见院内感染致病菌以及可能致病的人体定植病原菌，需结合临床进行鉴别。综上所述，CTD 并发肺部感染患者中，mNGS 的病原体检出率高于传统病原学检测，检测时间更短，有助于快速全面地检测和鉴定病原体、明确感染诊断，指导临床治疗。参考文献：1 郑倩倩,魏小松,范晓云,等.血清 KL-6 水平与常见结缔组织病并发肺间质病变的关系研究 J.安徽医学,2023,44(1):27-31.ZHENG Qianqian,WEI Xiaosong,FAN Xiaoyun,et al.Relationship between serum KL-6 level and interstitial lung disease in common connective tissue diseasesJ.Anhui Medical Journal,2023,44(1):27-31.2 WANG Huyan,SHI Xiaowei,YANG Huanhuan,et al.Metagenomic next-generation sequencing shotgun for the diagnosis of infection in connective tissue diseases:a retrospective study J.Front Cell Infect Microbiol,2022,12:865637.3 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