蜂毒素-死亡素重组抗菌肽的小鼠毒性试验.pdf

畜牧兽医杂志第42 卷第5期2023年25蜂毒素一死亡素重组抗菌肽的小鼠毒性试验刘小元，孟春颜，姬生跃,刘勇3，*（1.修武县农业综合行政执法大队，河南修武454351；2.中基高科（北京）生物技术有限公司；3.西北农林科技大学）摘要：本试验旨在探索蜂毒素一死亡素重组抗菌肽（MT一W)对昆明小鼠的毒性影响。试验通过小鼠口服急性毒性试验和口服生物利用度试验，研究了MT一W对小鼠主要脏器的影响，并检测了血液中碱性磷酸酶、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶等生化指标，并对MT一W的体内吸收情况进行了检测。结果显示，MT一W在试验设定浓度下，对试验小鼠的体重、器官/体重比率没有显著影响，血液生化指标与对照组也无统计学差异；在按照50 mg/kg体重给实验小鼠灌服MT一W溶液后，在血浆中未检测到MT-W。研究表明,MT一W对小鼠没有明显毒副作用,MT一W在口服后未被有效吸收。关键词：蜂毒素；死亡素；重组抗菌肽；小鼠；毒性试验中图分类号S896.5Toxicity Test of Melittin-Thanatin Recombinant AntimicrobialLIU Xiaoyuan,MENG Chunyan,JI Shengyue,LIU Yong*(1.Xiuwu County Agricultural Comprehensive Administrative Law Enforcement Brigade,Xiuwu Henan 454351,China;2.Zhongji Hi-Tech(Beijing)Biotechnology Co.,Ltd.;3.College of Veterinary Medicine,Northwest Agriculture and Forestry University)Abstract:The aim of this experiment was to investigate the toxicity effects of melittin-thanatin recombinant antimicrobialpeptide(MT-W)on Kunming mice.The effects of MT-W on major organs of mice were studied by oral acute toxicity testand oral bioavailability test,and biochemical indexes such as alkaline phosphatase,alanine aminotransferase and aspartate amin-otransferase in blood were detected,as well as the absorption of MT-W in vivo.The results showed that MT-W had no sig-nificant effects on the body weight and organ/body weight ratio of experimental mice,and there was no statistical difference inblood biochemical indexes between the control group and the control group.No MT-W was detected in plasma of mice givenMT-W solution at 50mg/kg body weight.Studies have shown that MT-W has no obvious toxic and side effects on mice,andMT-W is not effectively absorbed after oral administration.Key words:melittin;thanatin;recombinant antimicrobial peptides;mice;toxicity test当前，细菌对抗生素耐药性问题日益严重，寻找新型替代抗菌剂是解决耐药性问题的重要途径，抗菌肽以其特有的优势被看作一种新型抗菌剂而备受关注。抗菌肽与抗生素比较具有耐环境因素影响，不易诱发耐药性的优点，当前在畜牧业生产中通过添加抗菌肽作为抑菌、促生长制剂显示出良好前景。收稿日期2023-06-19基金项目陕西省动物防疫专项资金项目（2 0 2 1-XN18、XNDY2201)；宁夏回族自治区重点研发计划(2021BEF03005)作者简介刘小元（198 6-），男，河南修武人，本科，畜牧师，主要从事畜牧技术推广和服务工作。E-mail：*通信作者刘勇（198 0-)，男，甘肃兰州人，博士，研究方向为新兽药的创制。E-mail:文献标识码A文章编号10 0 4-6 7 0 4(2 0 2 3)0 5-0 0 2 5-0 4Peptide in Mice研究表明，通过在饲料中添加抗菌肽，可以明显提高动物的生长性能，并具有改善免疫力，减少动物发病，提高生长速度和效益的优势。但与抗生素相比，抗菌肽存在细胞毒性强、抑杀活性不稳定、生物学活性稳定性差的问题，需要通过对现有抗菌肽进行结构改造或设计新型抗菌肽，以满足新型抗菌剂研发的需要。为了提高天然抗菌肽的抗菌活性、生物学稳定性并降低细胞毒性，我们应用抗菌肽分子设计技术方案，将蜂毒素和死亡素两种抗菌肽进行了重组，并用3个色氨酸残基对特定位点的氨基酸残基进行了替代,获得了蜂毒素一死亡素重组抗菌肽（MT一26W)。初步研究发现MT一W相较于蜂毒素和死亡素对蛋白酶的稳定性显著增强、抗菌活性也明显提高而细胞毒性显著下降。本试验目的在于将MT一W饲喂实验小鼠，通过检测实验鼠的生理生化指标，血液中MT一W的含量等，综合评估其对动物的潜在毒性，为进一步在养殖动物中实验提供参考和依据。1材料与方法1.1蜂毒素一死亡素毒素重组抗菌肽抗菌肽MT一W通过构建的重组芽孢杆菌表达、提取纯化获得，并经冷冻干燥。用生理盐水配制成10 0 g/L的母液备用，4保存。1.2试验动物小鼠昆明系成年小鼠2 0 0 只，公母各半，平均体重18.5士1.5g（北京斯贝福生物科技有限公司）。实验环境达到SPF水平，恒温恒湿（2 3士1C、相对湿度6 0 士5%），每日照明12 h，自由采食。1.3给小鼠口服急性毒性试验将50 只小鼠随机分为5个组，每组10 只，公母各5只。试验组编号为I、I I、I I I 和IV,第V组为对照组。试验组小鼠按照6 0 0、12 0 0、2 50 0 和50 0 0mg/kg体重，分别口服MT一W稀释液，每日1次，连续使用15d。对照组灌服0.5mL灭菌生理盐水。第一次给药后15d,禁食1d后对所有小鼠进行称重，采集血液并分离血清；然后人道处死全部试验鼠，分别对其脏器进行采集后称重，主要包括心、肝、肺、胃、脾和淋巴结；观察所采脏器的变化；计算器官与体重的比值；检测碱性磷酸酶、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、白蛋白、球蛋白、总蛋白、肌酸酐、血尿素氮、甘油三酯和总胆固醇等生化指标。1.4小鼠口服生物利用度将MT一W溶液，按照50 mg/kg体重的剂量指标剂量 Dose(mg/kg)雄性小鼠(只）初始体重Initial BW（g)终止体重EndingBW（g)死亡率 Death rate(%)心脏 Heart(mg/g)肾脏(L)Kidney(L;mg/g)Journal of Animal Science and Veterinary Medicine光度。1.5统计分析方法通过t一检验进行统计学分析,P0.05为差异显著。2试验结果2.1小鼠口服急性毒性试验结果试验组和对照组小鼠灌服不同浓度的MT一W后未出现异常和死亡。且各试验组与对照组相比体重无差异；小鼠的器官/体重比率也无显著差异，表明MT一W溶液对小鼠没有明显毒副作用。结果见表1。生化指标的检测结果表明，灌服MT一W的各组小鼠的主要生化指标与对照组相比无统计学差异（表2）。另外，在内脏器官中肉眼未观察到可见变化。表1实验鼠急性毒性试验检测指标汇总表对照组I06005518.691.4918.411.4023.531.7723.441.86005.230.475.410.416.770.587.000.45Vol.42给6 0 只小鼠（公母各半）进行试验处理，同时将生理盐水灌服6 0 只对照组小鼠（公母各半）。从小鼠接受口服灌注开始计时，在第0.5h，1h，2 h，3h，4h，6h，8 h，12 h，16 h 和2 0 h，每组随机取出公母各半的6 只小鼠用乙醚麻醉，从眼眶静脉丛采集血样，并将其放置在肝素管中，,2 0 0 0 r/min离心10 min，将分离的血于一2 0 保存备用。按照Hematyar等的方法进行血样中MTW的检测。基本步骤如下：将采集的血样经0.2 2 m孔径滤器（Nucleopore，C o s t a r）过滤。用反相高效液相色谱系统（AgilentTechnologies），反相高效液相色谱分析柱Zorbax300SB一C8（2 50 m m X4.6mm,5 m,300 A)(Agilent Technologies)对血样进行处理。用0.1%（v/v）三氟乙酸和10%乙腈平衡色谱柱，然后以0%6 0%的乙腈梯度线性展开，流速为1.0 mL/min。监测2 14 nm和2 8 0 nm处的吸试验组1II120025005519.161.7718.411.5823.72 1.7723.901.95005.500.315.180.437.120.607.060.75No.52023IV5000518.881.5823.621.4905.200.336.870.73畜牧兽医杂志肾脏(R)Kidney(R;mg/g)7.220.70肝脏 Liver(mg/g)39.342.98肺脏(L)Lung(L;mg/g)1.950.20肺脏(R)Lung(R;mg/g)3.160.35脾脏 Spleen(mg/g)2.540.16胃Stomach(mg/g)7.740.76雌性小鼠（只）5初始体重Initial BW（g)18.881.40终止体重EndingBW（g)23.251.67死亡率 Death rete(%)0心脏 Heart(mg/g)5.050.50肾脏(L)Kidney(L;mg/g)5.710.60肾脏(R)Kidney(R;mg/g)6.260.56肝脏 Liver(mg/g)40.133.62肺脏(L)Lung(L;mg/g)2.380.26肺脏(R)Lung(R;mg/g)3.41 0.37脾脏 Spleen(mg/g)3.270.20胃 Stomach(mg/g)8.210.73注：脏器系数（mg/g）=器官重量（mg)/体重（g）。L：左边;R：右边。数值用平均值土标准差进行表示。*表示差异显著(P0.05)。指标剂量Dose(mg/kg)AST(U/L)GB(g/L)TP(g/L)Cre(mol/L)ALT(U/L)TC(mmol/L)ALP(U/L)TG(mmol/L)BUN(mmol/L)Alb(g/L)AST(U/L)GB(g/L)TP(g/L)Cre(mol/L)ALT(U/L)TC(mmol/L)ALP(U/L)TG(mmol/L)BUN(mmol/L)Alb(g/L)注：AST：天冬氨酸氨基转移酶;GB:球蛋白；TP:总蛋白；Cre:肌酸酐；ALT：丙氨酸氨基转移酶；TC:总胆固醇；ALP：碱性磷酸酶；TG：甘油三酯；BUN：血尿素氮；Alb：白蛋白。数值用平均值土标准差进行表示。*表示差异显著（P0.05）。第4 2 卷7.610.8241.023.832.18 0.173.530.252.560.207.960.85518.141.7723.622.0505.170.475.97 0.545.600.5141.654.022.460.213.670.343.160.268.280.86表2 实验鼠生化指标统计表对照组1060060.433.3063.835.4318.722.2317.651.4649.664.6649.375.0428.442.2828.562.4529.202.2328.521.943.620.283.820.42134.259.80135.329.512.070.042.180.054.751.944.952.1330.562.0431.232.23133.6728.622125.0324.0614.552.2314.841.8448.793.4049.283.0140.420.5039.140.4761.5024.8346.8517.462.320.112.11 0.15119.3114.84123.0014.07124.1612.512.110.141.970.124.890.816.090.0734.242.4333.172.72第5 期7.740.6240.414.032.040.213.370.282.550.197.860.84518.791.5824.181.7704.920.386.060.565.530.5340.883.752.260.283.460.333.210.287.650.82试验组I1II1200250058.594.7563.055.1418.821.9419.401.8451.705.6348.504.7529.222.8228.672.6128.911.8429.593.013.710.323.770.41136.6711.16137.7411.831.980.032.050.045.14 2.916.312.7231.821.9432.112.046121.2534.05 5118.9233.7615.331.9415.711.6549.663.9850.345.1440.280.4140.430.4951.2221.5354.6125.902.190.172.240.19126.3911.64129.3013.001.920.102.040.166.190.077.270.0634.923.1036.183.402023年7.500.8640.774.542.300.333.730.392.550.237.550.66518.511.9523.991.8604.970.486.040.705.570.5940.954.362.500.303.82 0.423.350.377.81 0.736126.4923.3816.012.3351.414.7540.450.5149.4718.922.360.221.930.137.600.0835.313.20277.430.6541.253.812.130.233.610.372.620.197.680.78519.251.8623.441.6705.310.595.850.746.390.5741.393.972.310.283.530.363.430.348.24 0.74IV500066.645.8218.922.2350.635.2428.942.7228.032.813.650.30137.3512.032.170.037.54 2.4331.432.33282.2小小鼠口服生物利用度试验结果在按照5 0 mg/kg体重给实验小鼠灌服MT一W溶液后，10 个检测时间点上在血浆中均未检测到MTW,提示 MTW未在小鼠血液中残留。表明MT一W在口服后未被有效吸收，未在血液中累积到可检测的水平。3蜂毒素一死亡素重组抗菌肽(MT一W)试验讨论利用动物模型来进行毒性分析研究，以评估某种物质对人类或生物体健康的潜在风险。为了评估MT一W的急性毒性，本研究用了小鼠作为动物模型，并在15 d的试验中对试验小鼠分别灌注了不同剂量的MTW。结果显示，MT一W在5 0 0、1000、2 0 0 0 和5 0 0 0 mg/kg体重的剂量下，对小鼠无毒性作用，尽管5 0 0 0 mg/kg体重剂量的MT一W灌注的雄性小鼠的天冬氨酸氨基转移酶和血尿素氮水平有所升高，雌性小鼠的血尿素氮水平有所升高，但这些变化都在正常的生理指标波动范围内。这表明,MT一W口服后，代谢终产物在小鼠体内有所增加，但不会对其肾脏造成实质性损害。因此，口服MTW的半致死剂量（LD50）大于5 0 0 0 mg/kg/d。总的来说，在不超过5 0 0 0 mg/kg体重剂量的情况下,MT一W对昆明小鼠的急性毒性是可控的，不会对其造成伤害。在经MTW单剂量灌注的昆明小鼠进行15d试验后，通过血液样品分析发现无法检测到MT一W,这表明MT-W的生物利用度非常低。口服急性毒性试验和口服生物利用度试验的结果都表明,MT一W难以以完整的形式进入小鼠的血液循环系统。本研究结果表明,MTW的生物利用度较低,其完整形式没有在血液循环系统中检出。参考文献：1MCEWEN S A,COLLIGNON PJ.Antimicrobial Re-sistance:One Health PerspectiveJ.Microbiol Spec-trum,2018,6(2):ARBA-0009-2017.2MIYOSHI N,ISOGAI E,HIRAMATSU K,et al.Activity of tick antimicrobial peptide from Ixodes per-sulcatus（p e r s u lc a t u s in）a g a in s t c e ll m e m b r a n e s o fdrug-resistant Staphylococcus aureusJ.The Journalof Antibiotics(Tokyo)，2 0 17,7 0(2):14 2-14 6.3SHANG L,ZHOU J,TU J,et al.Evaluation of Ef-fectiveness and Safety of Microcin C7 in Weaned Pig-letsJ.Animals（Ba s e l)，2 0 2 2,12(3 2 6 7).4 TANG Q,XU E,WANG Z,et al.Dietary Hermetiaillucens Larvae Meal Improves Growth PerformanceJournal of Animal Science and Veterinary Medicine10 1HEMATYAR M,ES-HAGHI A,SOLEIMANI M.Quantification of Melittin in Iranian Honey Bee(Apismellifera meda)Venom by Liquid Chromatography-electrospray lonization-ion Trap Tandem Mass Spec-trometry(LC-ESI-IT-MS/MS)J.Archives of RaziInstitute,2019,74(4)：4 3 5-4 3 9.11ASARE G A,ADDO P,BUGYEI K,et al.Acutetoxicity studies of aqueous leaf extract of PhyllanthusniruriJJ.Interdisciplinary Toxicology,201l,4(4):206-210.12田雨佳，孙跃，赵瑞利，等.面向“新农科”的动物生产类和动物医学类专业“五链三位”实践创新体系与平台构建 J.畜牧兽医杂志，2 0 2 2，4 1（5）：7 8-8 1.13王欣荣.SPOC混合式教学在动物繁殖学课程中的应用效果.畜牧兽医杂志，2 0 2 2，4 1（5）：2 0 6-2 0 9.14左宗辉，李留安，赵瑞利，等.兽医流行病学课程思政元素有机融入改革与实践 J.畜牧兽医杂志，2022,41(5):210-212,219.15王新霞，路则庆.饲料卫生学课程多维度过程性评价体系构建J.畜牧兽医杂志，2 0 2 2，4 1（5）：213-219.16朱晓萍，尚秀国，王瑞晓，等.新农科下强化畜牧专业实践与突出创新能力的教学改革初探 J.畜牧兽医杂志，2 0 2 2，4 1（5）：2 2 4-2 2 6,2 3 0.17个信吉阁，毛晓月，王丽屏，等.翻转课堂在兽医公共卫生学教学中的应用 J.畜牧兽医杂志，2 0 2 2，4 1（5）：264-267.Vol.42and Intestinal Barrier Function of Weaned Pigs Underthe Environment of Enterotoxigenic Escherichia coliK88J.Fronters in Nutrition,2021,8,812011.5乔恒鑫，轩松抗菌肽粗提物对肉鸡生长性能、粪便微生物菌群结构及经济效益的影响J.中国饲料，2021,7,68-71.6蒋翔，李锦强抗菌肽对断奶仔猪生长性能、腹泻率、抗氧化性及免疫功能的影响.饲料研究 J.2021，14,42-45.7LEI J,SUN L,HUANG S,et al.The antimicrobialpeptides and their potential clinical applicationsJ.A-merican Journal of Translational Research,2019,11(7):3919-3931.8ONG Z Y,WIRADHARMA N,YANG Y Y.Strate-gies employed in the design and optimization of syn-thetic antimicrobial peptide amphiphiles with enhancedtherapeutic potentialsJJ.Advanced Drug Delivery Re-views,2014,78,28-45.9 L I U Y,ZH A NG X P,M ENG C Y,e t a l.A n t i mi c r o b i a lActivity of the Recombinant Peptide Melittin-Thanatinwith three Glycine to Tryptophan MutationsJJ.Prepara-tive Biochemistry&,Biotechnology.2022.No.52023