离子交换柱层析法分离氨基酸.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,离子交换柱层析法分离氨基酸,离子交换柱层析法分离氨基酸,第1页,目标要求,（,1,）学习采取离子交换树脂分离氨基酸基础原理。,（,2,）掌握离子交换柱层析法基础操作技术。,离子交换柱层析法分离氨基酸,第2页,一、原理,离子交换层析,是用,离子交换剂,（含有离子交换性能物质）,作固定相,，利用它与流动相中离子能进行,可逆交换,性质来分离离子型化合物层析方法。,即溶液中离子同离子交换剂上,功效基团交换反应,过程。,离子交换柱层析法分离氨基酸,第3页,离子交换柱层析法分离氨基酸,第4页,离子交换柱层析法分离氨基酸,第5页,带电荷量少,，亲和力小,先,被,洗脱,下来，,带电荷量多,，亲和力大,后,被,洗脱,下来。,离子交换柱层析法分离氨基酸,第6页,离子交换过程示意：,起始 吸附 解吸 完成,x,+,:,起始缓冲离子,y,+,：待分离离子,z,+,：待分离离子,离子交换柱层析法分离氨基酸,第7页,二、离子交换剂种类,在惰性载体上引入带有电荷活性基团即离子交换剂。,（一）按活性功效基团带电荷性质不一样,阳离子交换剂,带负电荷，与阳离子交换,阴离子交换剂,带正电荷，与阴离子交换,离子交换柱层析法分离氨基酸,第8页,（二）按载体种类不一样,1.,离子交换树脂,：主要有聚苯乙烯树脂,苯乙烯,+,二乙烯苯,聚苯乙烯 （单体）（交联剂）,二乙烯苯,交联度,=,100%,苯乙烯,+,二乙烯苯,离子交换柱层析法分离氨基酸,第9页,交联度大，网孔变小，大分子量离子不能进入树脂颗粒内发生离子交换。,在不影响分离情况下，以采取,交联度较高,树脂为好，这么能够提升树脂对离子选择性。,离子交换柱层析法分离氨基酸,第10页,目数,：离子交换树脂颗粒直径大小,Dowex 50,为,20-50,目,Dowex 20 840,m,50 297,m,100 149,m,（代表二乙烯苯百分含量）,离子交换柱层析法分离氨基酸,第11页,树脂,resin,（据所含交换基团性质分）,阳离子交换树脂,强酸型 含磺酸基团,(R-SO,3,H),中等酸型 含磷酸基团,(-O-PO,2,H,4,),弱酸型 含酚基、羧基,阴离子交换树脂,强碱 含季胺基团,-N,+,(CH,3,),3,弱碱 含叔胺、伯胺基团,-N(CH,3,),2,阴离子交换树脂对化学试剂及热都不如阳离子交换树脂稳定。,离子交换柱层析法分离氨基酸,第12页,2.,离子交换纤维素,阴离子交换纤维素,如,:DEAE-,纤维素,pH8.6,以下分离中性或酸性物质,具二乙胺乙基,阳离子交换纤维素,如,:CM-,纤维素 普通,pH4,条件下使用,含有羧甲基,离子交换柱层析法分离氨基酸,第13页,3.,离子交换凝胶,分离大分子物质,如：葡聚糖（,Sephadex,）、聚丙烯酰胺（,PAG,）、琼脂糖（,Sepharose,）,离子交换柱层析法分离氨基酸,第14页,三、操作注意点,（一）离子交换剂选择,标准：,依据被分离物质性质选择,同一性质离子交换剂中选取对被分离物质各组分之间结协力,差异大,型号交换剂，以确保经过离子交换层析后能得到比较满意结果。,离子交换柱层析法分离氨基酸,第15页,考虑原因：,1.,被分离物质带何种电荷,2.,被分离物质分子大小,大分子物质选取凝胶，其次选取纤维素,3.,被分离物质所处环境,4.,被分离物质物理化学性质,5.,被分离物质大约数量,离子交换柱层析法分离氨基酸,第16页,依据分离过程试验条件,强酸强碱,应用广泛,弱酸型,只能在碱性,pH,范围内使用,弱碱型,只能在酸性,pH,范围内使用,离子交换柱层析法分离氨基酸,第17页,（二）缓冲液选择,标准,：不能发生化学反应，所带电荷应与样品一致。防止使样品变性,离子交换柱层析法分离氨基酸,第18页,(,三,),洗脱剂,标准,：所用洗脱液比吸着物质含有更活泼离子或基团,改变,pH,或离子强度,增强洗脱液与离子交换剂结协力,降低分离物与离子交换剂结协力,洗脱方式：梯度洗脱,离子交换柱层析法分离氨基酸,第19页,四、应用,分离多肽蛋白、氨基酸、核酸及其它带电生物分子,离子交换柱层析法分离氨基酸,第20页,离子交换层析法分离氨基酸及测定,离子交换柱层析法分离氨基酸,第21页,原理,所用样品为天冬氨酸和赖氨酸混合液，分别属酸性氨基酸,(pI2.77),、碱性氨基酸,(pI9.74),，在缓冲溶液中分别带正电荷和负电荷，与,强酸型阳离子交换树脂,Dowex50,亲和力有很大不一样,，在一定洗脱条件下洗脱，将它们分离。利用氨基酸可与茚三酮反应生成有色化合物进行氨基酸判定。,离子交换柱层析法分离氨基酸,第22页,紫色物质，用于,氨基酸比色测定和纸层析显色,与水含茚三酮反应：,离子交换柱层析法分离氨基酸,第23页,Asp Lys,pH4.2,pH,10,离子交换柱层析法分离氨基酸,第24页,器材,1.,层析柱等,2.,沸水浴,离子交换柱层析法分离氨基酸,第25页,试剂,Dowex50,2mol/L NaOH,pH5.3,柠檬酸缓冲液,样品液：氨基酸混合液,茚三酮混合液,离子交换柱层析法分离氨基酸,第26页,试验步骤,1,树脂处理,将干强酸型树脂用蒸馏水浸泡过夜，使之充分溶胀。,用,4,倍体积,2mol/L,盐酸浸泡,1,小时，倾去清液，洗至中性。,再用,2mol/L,氢氧化钠处理，做法同上。最终用欲使用缓冲液浸泡。,2,装柱,取直径,1cm,长度,10,12cm,层析柱。将柱垂直至于铁架上。自顶部注入上述经处理树脂悬浮液，关闭层析柱出口，待树脂沉降后，放出过量溶液，再加入一些树脂，至树脂沉降至,8 10cm,高度即可。,装柱要求连续、均匀，无纹格、无气泡，表面平整。液面不低于树脂。,离子交换柱层析法分离氨基酸,第27页,3,平衡,将缓冲液瓶与恒流泵相连，恒流泵出口与层析柱入口相连，树脂表面保留,3,4cm,液层，开动衡流泵，以,24ml/h,流速平衡，直至流出液,pH,与洗脱液相同。,4.,加样,揭去层析柱上口盖子，待柱内液面至树脂表面,1,2mm,关闭出口，沿管壁四面小心加入,0.5ml,样品，慢慢打开出口，同时开始搜集流出液。当样品液弯月面靠近树脂顶端时，即刻加入少许柠檬酸缓冲液冲洗加样品处数次，然后注入柠檬酸缓冲液至液面高,3,4cm,左右，接恒流泵。,5.,洗脱,以缓冲液洗脱，开始用试管搜集洗脱液，每管搜集,1mL,，共搜集,6080,管。,离子交换柱层析法分离氨基酸,第28页,6,洗脱及氨基酸判定,向各管搜集液中加,1mL,水合茚三酮显色剂并混匀，在沸水浴中准确加热,5min,后冷却至室温，再加入,3mL,0.1%,硫酸铜溶液。混匀，以搜集液第,2,管为空白，测定,A570,波长光吸收值，以光吸收值为纵坐标，以洗脱液体积为横坐标绘制洗脱曲线,。,离子交换柱层析法分离氨基酸,第29页,试验结果,依据氨基酸解离性质，分析该试验条件下氨基酸从层析柱洗脱下来次序。,离子交换柱层析法分离氨基酸,第30页,Separation of amino acids on a cation exchange column,离子交换柱层析法分离氨基酸,第31页,注意事项,在装柱时必须预防气泡、分层及柱子液,面在树脂表面以下等现象发生。,离子交换柱层析法分离氨基酸,第32页,再见！,离子交换柱层析法分离氨基酸,第33页,