核糖体蛋白L4基因表达水平与结直肠癌预后相关性.pdf

结勿564ClinJMedOfficJun,2023临床军医杂志2023年6 月第51卷第6 期核糖体蛋白L4基因表达水平与结直肠癌预后相关性王琼，张成，王鑫宇，张倩，刘洋，柳云恩1.沈阳医学院树人国际学院，辽宁沈阳110 0 34;2.北部战区总医院普通外科，辽宁沈阳110 0 16摘要目的技探讨核糖体蛋白L4（RPL4）在结直肠癌患者中的预后价值及生物学意义。方法从癌症基因组图谱(TC-GA)数据库下载542 例结直肠癌患者的转录组数据和417 例具有完整的总生存期和生存状态资料患者的临床数据。经lim-ma差异基因分析，比较RPL4在结直肠癌组织和正常组织的表达情况,并采用Kaplan-Meier生存分析,评估RPL4表达与结直肠癌患者预后的关系。采用TISCH数据库在单细胞测序水平上验证RPL4在肿瘤微环境中表达的主要细胞类型。经GSEA富集分析探究RPL4表达水平上调相关的肿瘤特征情况。采用Cell Miner数据库中癌NCI-60细胞系抗癌药物测试数据，探讨与RPL4基因相关药物的药物敏感性分析。采用HPA数据库和实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）实验分别对组织中RPL4蛋白和mRNA的表达水平进行验证。结果在TCGA结直肠癌的转录组数据中,结直肠癌组织样本中RPL4的表达水平明显高于正常组织,差异有统计学意义（P0.001）。经患者配对差异分析发现,结直肠癌组织样本中RPL4的表达水平大多高于正常组织。经Kaplan-Meier生存分析发现,RPL4低表达组的总生存期明显长于高表达组，差异有统计学意义（P0.05）。在单细胞测序水平分析中,RPL4主要在恶性细胞和大多数免疫细胞高表达，而在上皮细胞几乎不表达。经GSEA富集分析发现，在Hallmark基因集中，主要富集于MYC和氧化磷酸化通路；在KEGG基因集中，主要富集于细胞周期和DNA复制以及氨基酸代谢相关通路，这些通路主要参与调控肿瘤的增殖与分化。药物敏感性分析发现，贝利司他、帕博西尼和小分子XR-11576等8 种药物的IC50值在RPL4高表达组中显著降低，差异有统计学意义（P0.05）。在HPA数据库中,RPL4在结直肠癌组织的蛋白表达水平明显高于正常组织。经实时荧光定量PCR实验验证，在结直肠癌组织中,RPL4的mRNA表达水平明显高于正常组织,差异有统计学意义（P0.05）。结论核糖体基因RPL4有潜力成为用于结直肠癌诊断和预后评估的新型生物学标志物。关键词结直肠癌；预后；核糖体蛋白L4；癌症基因组图谱中图分类号：R735.3doi:10.16680/j.1671-3826.2023.06.05文章编号：16 7 1-38 2 6(2 0 2 3)0 6-0 56 4-0 6Correlation between the gene expression of ribosome protein L4 and the prognosis of colorectal cancerWANG Qiong,ZHANG Cheng,WANG Xin-yu,ZHANG Qian,LIU Yang,LIU Yun-en(1.Shuren International College,ShenyangMedical College,Shenyang 110034,China;2.Department of General Surgery,General Hospital of Northern Theater Command,Sheny-ang 110016,China)Abstract:Objective To investigate the prognostic value and biological significance of ribosomal protein L4(RPL4)in patients withcolorectal cancer.Methods Transcriptome data for 542 colorectal cancer patients and clinical data for 417 patients with complete o-verall survival and survival status were downloaded from the cancer genome atlas(TCGA)database.Limma differential gene analysiswas used to compare the expression of RPL4 in colorectal cancer tissues and normal tissues,and Kaplan-Meier survival analysis wasused to evaluate the relationship between RPL4 expression and prognosis of colorectal cancer patients.TISCH database was used to ver-ify the main cell types of RPL4 expression in the tumor microenvironment at the level of single cell sequencing.GSEA enrichment anal-ysis was used to explore the tumor characteristics related to the up-regulation of RPL4 expression.Based on the test data of NCI-60 cellline anticancer drugs in Cell Miner database,the drug sensitivity analysis of drugs related to RPLA gene was discussed.HPA databaseand real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction(PCR)were used to verify the expression levels of RPL4 protein andmRNA in tissues,respectively.Results In the transcriptome data of TCGA colorectal cancer,the expression leyel of RPL4 in colorec-tal cancer tissue samples was significantly higher than that in normal tissues,with statistical significance(P0.001).The expressionlevel of RPL4 in colorectal cancer tissue samples was higher than that in normal tissues.Kaplan-Meier survival analysis showed that the基金项目：辽宁省科学技术计划项目（2 0 2 2-NLTS-14-03）第一作者：王琼（1997-），女，山西朔州人，硕士通信作者：柳云恩，E-mail:565.ClinJMedOffJun,2023临床军医杂志2023年6 月第51卷第6 期overall survival of low RPL4 expression group was significantly longer than that of high RPL4 expression group,and the difference wasstatistically significant(P0.05).In single-cell sequencing level analysis,RPL4 was highly expressed mainly in malignant cells andmost immune cells,but hardly expressed in epithelial cells.GSEA enrichment analysis showed that the Hallmark gene concentrationwas mainly concentrated in MYC and oxidative phosphorylation pathway.KECG gene concentration was mainly concentrated in cell cy-cle,DNA replication and amino acid metabolism related pathways,which were mainly involved in the regulation of tumor proliferationand diferentiation.Drug sensitivity analysis showed that IC50 values of Bellistat,Palbocinib and small molecule XR-11576 were sig-nificantly decreased in RPL4 high expression group,the difference was statistically significant(P0.05).In the HPA database,RPL4protein levels were significantly higher in colorectal cancer tissue than in normal tissue.Real-time fluorescence quantitative PCR testconfirmed that the mRNA expression level of RPL4 in colorectal cancer tissues was significantly higher than that in normal tissues,andthe difference was statistically significant(P0.05).Conclusion The RPL4 gene has the potential to become a new biological mark-er for the diagnosis and prognosis evaluation of colorectal cancer.Key words:Colorectal cancer;Prognosis;Ribosomal protein L4;The cancer genome atlas结直肠癌是全球最常见的癌症之一，也是致癌死亡的主要原因1。近年来,结直肠癌发病率明显增加,约占所有癌症的10%，是癌症死亡的第二大常见原因，严重危害身体健康2-3。尽管早期筛查方法和治疗方案的研究发展有助于显著改善结直肠癌患者预后，但结直肠癌仍然存在较大的健康隐患4。虽然,辅助化疗取得了一定效果,但肿瘤的异质性和疾病的危险因素使得结直肠癌患者的临床转归和治疗反应差异很大5。因此,通过肿瘤生物学的多样性,筛选更有意义的诊断标志物用于患者风险分层和早期发现，可能会延长结直肠癌患者的总生存期。核糖体蛋白L4（r i b o s o m a l p r o t e i n L4，RPL4)属于核糖体家族,该基因编码核糖体蛋白，是6 0 S亚基的组成部分。有研究报道,核糖体的缺乏伴随着p53通路的激活6 。RPL4与肿瘤的发生、发展密切相关,RPL4 的表达上调与肿瘤患者的预后呈负相关，可促进肿瘤细胞的增殖和分化。Wang等7 研究发现,过氧化物还原蛋白PRDX2可以结合RPL4,从而阻碍RPL4-MDM2结合，并导致p53降解，促进结直肠癌细胞增殖。但目前关于RPL4在结直肠癌中功能方面的研究报道较少见，RPL4可能是一个具有前景的治疗靶点，可为结直肠癌患者提供个体化治疗，并为临床治疗奠定理论基础。本研究旨在探讨RPL4在结直肠癌患者中的预后价值及生物学意义。现报道如下。1材料与方法1.1数据下载及处理从癌症基因组图谱(thecancergenomeatlas,TCGAGDC,https:/portal.gdc.cancer.gov/)数据库中下载结直肠癌及正常结直肠组织的mRNA测序数据和临床信息8 其中，具有完整信息的有52 4例结直肠癌患者的mRNA测序，42 例患者可进行配对差异分析，417例患者具有完整的总生存期和生存状态，将上述患者的临床数据纳人研究。此外,对mRNA-seq数据的mRNA表达量用log2（U M I+1）进行标准化，并通过其平均值反映映射到多个探针的基因。在本研究中，数据经过质量控制，排除存活时间30d、信息不明确患者的结直肠癌样本。1.2RPL4表达情况及生存分析将TCGA中结直肠癌患者按RPL4 mRNA表达排序,根据其中位值,将结直肠癌患者分为RPL4高表达组和RPL4低表达组。采用“survival”（3.2-13版本）和“sur-vminer”R包进行Kaplan-Meier生存分析，构建RPL4高表达组和低表达组组间的Kaplan-Meier生存曲线,评估RPL4 是否为总生存期的预后因素。1.3RPL4的单细胞数据分析在肿瘤免疫单细胞中心(http:/p-genomics.org/documenta-tion/,TISCH)进行相关的单细胞分析9。分析参数如下：RPL4（基因）、主要谱系（细胞类型注释）和结直肠癌（癌症类型）。通过TISCH内部处理后可视化每种细胞类型中RPL4的表达水平。1.4GSEA富集分析斤采用GSEA软件，利用从分子特征数据库（MSigDB，h t t p s:/w w w.g s e a-m s i g-db.org/gsea/index.jsp）下载的京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)数据集和Hallmark基因集对RPL4高表达和低表达组进行通路富集分析，探讨RPL4在结直肠癌中的生物学功能10 。将错误发现率 2.0 定义为截止标准。1.5药物敏感性分析通过国家癌症研究所研究中心建立的Cell Miner数据库下载经过处理后的RNA表达数据（RNA：RNA-s e q）和药物数据（Com-566ClinJMedOffiJun,2023临床军医杂志2023年6 月第51卷第6 期pound activity:DTP NCI-60)1,选取经过 546 种临床试验和314种美国食品和药物管理局（foodanddrug administration,FDA）批准的药物结果。采用最近邻平均impute.knn函数补齐药物缺失数据，采用limma包计算RPL4高表达组和低表达组间的药物敏感性。1.6免疫组织化学法通过在线数据库人类蛋白质图谱HumanProteinAtlas（H PA，h t t p s:/www.proteinatlas.org/）分析RPL4基因在结直肠肿瘤组织和正常组织中蛋白水平的表达情况12 O1.7实实时荧光定量聚合酶链反应由北部战区总医院普通外科收集2 0 例结直肠癌组织及对应癌旁标本。采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-timefluorescence quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测RPL4的mRNA表达水平,按照新一代RNA提取试剂NucleoZOL（M NG，德国，货号：740404.200）说明书步骤提取结直肠组织的总RNA,使用紫外分光光度仪检测mRNA含量。随后采用天根反转录试剂盒，制备2 0 l体系cDNA，最终采用天根荧光定量聚合酶链反应（polymerasechain reaction,PCR）试剂盒对cDNA进行PCR反应。引物序列设计如下，RPL4-Forward：A G A T-GAATTGTACGGCACTTGG,RPL4-Reverse:GACTCT-GCGATGGATCTTCTTG;GAPDH-Forward:GTCTC-CTCTGACTTCAACAGCG。G A PD H-Re v e r s e:AC-CACCCTGTTGCTGTAGCCAA。PCR反应条件为预变性：95、30 s;变性：95、10 s,60、30 s,40 个循环；退火/延伸：6 0、30 s。记录CT值，按照2-CT 法计算RPL4在正常结直肠组织和结直肠癌组织中表达的相对水平。1.8丝统计学方法在线数据统计分析均在R软件（版本4.1.1）（https:/www.r-project.org/）和Perl软件（版本10.0.2 2 0 0 0.6 7 5）中进行。定量PCR检测采用GraphPadPrismv8.0软件进行统计学分析，组内比较采用配对t检验。以P0.05为差异有统计学意义。2绍结果2.1RPL4在结直肠癌中表达上调与较差预后相关丝结直肠癌组织样本中RPL4的表达水平明显高于正常组织，差异有统计学意义（P0.001，图1a）。将42 例配对患者进行差异分析，结直肠癌组织样本中RPL4的表达水平大多高于正常组织（图1b）。生存分析结果显示，将纳人的417 例具有完整信息的结直肠癌患者根据中位值将其分为RPL4高表达组和低表达组，低表达组的总生存期明显长于高表达组,差异有统计学意义（P0.05,图2）。1000FP0.001正常组织结直肠癌组织1.0RPL4低表达组600RPL4高表达组8000.86004000.64000.42002000.2a02正常组织结直肠癌组织正常组织结直肠癌组织024681012时间/个月图1TCGA数据库数据a.结直肠癌组织中RPL4的表达高于正常组织;b.在每个患者的肿瘤组织中,RPL4的表达水平普遍高于正常组织；y轴为样本RPL4表达的log2（T PM）值】图2RPL4的Kaplan-Meier生存分析结果2.2RPL4在结直肠癌中单细胞分析使用TISCH数据库在GSE166555数据集中分析RPL4在CRC中的13种细胞类型（包括免疫细胞、基质细胞、恶性细胞等）的表达水平（图3），结果发现，RPL4主要表达于恶性细胞和免疫细胞。RPL4在原发性结直肠癌患者的肿瘤微环境中广泛表达于T细胞、B细胞、DC细胞等免疫细胞类型,但在上皮细胞表达较低。2.33RPL4在结直肠癌的GSEA富集分析经GSEA分析发现，在RPL4高表达组的结直肠癌患者中,在Hallmark基因集中主要在MYC 和氧化磷酸化通路显著富集（图4a），在KEGG基因集中主要在DNA复制和细胞周期通路显著富集，这些通路与肿瘤的生长、增殖密切相关（图4b）。结果表明,RPL4可能在肿瘤进展中起一定作用。2.4丝结直肠癌中RPL4与药物敏感性的相关性研究对RPL4高、低表达组进行差异分析，比较组间的药物的半数最大抑制浓度（IC50）,结果显示，用567ClinJMedOffi6,Jun,2023临床军医杂志2023年6 月第51卷第6 期于治疗肿瘤的贝利司他、帕博西尼和小分子XR-11576等8 种药物的IC50值在RPL4高表达组中显著降低（P0.05,图5）。结果表明,结直肠癌中RPL4高表达预示着贝利司他和帕博西尼等药物的治疗效果较好。2.5RPL4在结直肠癌组织的表达情况通过CRC_GSE166555RPL4Plasma4.0Celltype(major-lineage)3.5BCD4TconvFibroblasts3.0CD8THthelialCoATconvDCEndothelial2.5MyofibroblastsEpithelialCDFibroblasts2.0gnantMastMalignantMast1.5Mono/MacroMono/MacroMyofibroblasts1.0PlasmaEndothelialTprolif0.50图3GSE166555中RPL4在13种主要细胞类型中的的表达水平DNA_REPAIR-E2F_TARGETSAMINOACYL_TRNA_BIOSYNTHESISG2M_CHECKPOINT0.8CELL_CYCLEMTORCI_SIGNALINGDNA_REPLICATIONMYC_TARGETS_V1MISMATCH_REPAIRMYC_TARCETS_V2PYRIMIDINE_METABOLISM0.6OXIDATIE_PHOSPHORYLATION0.6UNFOLDED_PROTEIN_RESPONSE0.40.40.20.200高表达低表达高表达低表达图4GSEA分析(a.高RPL4表达组和低RPL4表达组在Hallmark基因集中GSEA分析显示的RPL4表达相关的显著上调通路;b.高RPL4表达组和低RPL4表达组在KEGG基因集中GSEA分析显示的RPL4表达相关的显著上调通路）2002OJO202a5bRPL4RPL4RPL4RPL4RPL4RPL4RPL4RPL4高表达组低表达组高表达组低表达组高表达组低表达组高表达组低表达组000JO-JOJo5f2RPL4RPL4RPL4RPL4RPL4RPL4RPL4RPL4高表达组低表达组高表达组低表达组高表达组低表达组高表达组低表达组图5RPL4高、低表达组抗肿瘤药物半数最大抑制浓度比较a.硝酸益康唑（Econazole nitrate）;b.贝利司他（Belinos-tat）;c.CU D C-30 5;d.双氢青蒿素（Artenimol）;e.帕博西尼（Palbociclib）;f.青蒿素酯（Artesunate）；g.XR-1157 6;h.人参皂苷(RH1)568ClinJMedOffic,Jun,2023临床军医杂志2023年6 月第51卷第6 期HPA数据库提供的结直肠癌组织和正常组织中RPL4蛋白的表达情况发现，与正常结直肠组织比较，结直肠癌组织中RPL4的蛋白表达水平上调,并且主要位于基质细胞（图6）。为了验证RPL4的mRNA表达水平情况，进行qRT-RCR实验，在结直肠癌组织中,RPL4的mRNA表达水平明显高于正常组织,差异有统计学意义（P0.05）。见图7。RPL42.5P0.052.01.51.00.506a6b正常组织结直肠癌组织图6RPL4的免疫组化染色结果(a.正常结直肠组织;b.结直肠癌组织）图7RPL4 的 qRT-PCR3讠讨论结直肠癌被认为是一种遗传性疾病,腺瘤-癌序列是结直肠癌发展的基础。目前，比较认可的靶向和免疫治疗仅在有限的患者亚群中显示出有效性13。由于这些原因,越来越需要定义个体患者的分子和生物学景观，实现个体化治疗极为迫切。本研究从多组学途径发现，RPL4是结直肠癌的预后生物标志物,可以有效地预测药物治疗疗效。此外,本研究结果可以为进一步研究RPL4在结直肠癌进展机制中的潜在作用提供一些线索。首先，本研究基于TCGA数据评估RPL4在结直肠癌中的表达水平，结果显示，与正常结直肠组织比较,结直肠癌组织的RPL4表达水平明显增加，配对差异分析也得到相同的结果,并且在单细胞测序水平上得到验证。然后,本研究对结直肠组织进行了临床样本测试,qRT-PCR结果表明,RPL4在20个结直肠癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织,进一步验证了RPL4在结直肠癌中的mRNA表达水平上调。在HPA数据库中对RPL4在蛋白水平表达进行验证，免疫组织化学结果显示,RPL4在结直肠癌中的蛋白表达水平上调。上述研究结果表明,RPL4在结直肠癌中表达异常上调,导致癌细胞的生长和增殖,与不良预后相关。本研究与RPL4相关的潜在药物敏感性分析表明，硝酸益康唑、贝利司他、帕博西尼等对开发RPL4靶点治疗方面显示出巨大潜力。Weng等14研究发现,硝酸益康唑是一种抗真菌化合物,在胰腺癌方面有较多研究，益康唑可作为自噬抑制剂抑制肿瘤生长，通过调节ATF3/ID-1/AKT轴刺激自噬启动，同时破坏溶酶体生物发生，从而诱导胰腺导管腺癌细胞中过度的自噬体积累和ER应激介导的细胞凋亡。贝利司他是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，在2 0 14年经FDA认证用于治疗复发或难治性外周T细胞淋巴瘤患者15。帕博西尼是CDK4/CDK6 的抑制剂，一般与其他药物联合使用,治疗激素受体呈阳性的晚期乳腺癌患者16 Sorokin等17 临床研究发现，MEK抑制剂和CDK4/CDK6的抑制剂联合使用可治疗KRAS突变的结直肠癌患者,提高治疗效果和安全性，并且揭示了靶向治疗的耐药机制。因此,本研究的结果和推导的假设可能为进一步深入研究提供一些线索。综上所述，核糖体基因RPL4有潜力成为用于结直肠癌诊断和预后评估的新型生物学标志物。本研究初步对RPL4在结直肠癌的表达水平、富集分析和药物敏感性进行研究，表明其作为癌症预后生物标志物的潜在功能及其有效预测药物治疗反应的潜在功能。虽然，本研究通过生物信息学分析确定了RPL4在结直肠癌中的潜在价值，但仍有不足，该项研究无法证明RPL4与这些预测药物的直接相互作用。此外，本研究从在线数据库中收集测序数据进行分析,这不可避免地存在一定的系统误差。笔者认为，该项研究的进一步临床应用和机理研究需要通过实验进行证明。（收稿日期：2 0 2 3-0 6-14；本文编辑：谷媛上接第56 3页）（收稿日期：2 0 2 3-0 6-13；本文编辑：杨雪莹）569Clin J Med Offic,Jun,20232023年6 月第51卷第6 期临床军医杂志参考文献：1Zhou H,Zhu L,Song J,et al.Liquid biopsy at the frontier of de-tection,prognosis and progression monitoring in colorectal can-cerJ.Mol Cancer,2022,21(1):86.2Siegel RL,Wagle NS,Cercek A,et al.Colorectal cancer statistics,2023J.CA Cancer J Clin,2023,73(3):233-254.3Biller LH,Schrag D.Diagnosis and treatment of metastatic colorec-tal cancer:a reviewJ.JAMA,2021,325(7):669-685.4Dekker E,Tanis PJ,Vleugels JLA,et al.Colorectal cancer J.Lancet,2019,394(10207):1467-1480.5Ali SR,Jordan M,Nagarajan P,et al.Nerve density and 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