基于AMPK信号通路的附子在不同机体状态下对神经—内分泌—免疫网络的生物学效应表达机制研究.pdf

1508摇环球中医药 2023 年 8 月第 16 卷第 8 期摇 Global Traditional Chinese Medicine,August 2023,Vol郾 16,No郾 8基础研究基金项目:国家自然科学基金(82104410)作者单位:100029摇 北京中医药大学王智威(本科生)、邸松蕊(硕士研究生)、黄鹏力(本科生)、谢辰雨(本科生)、王一帆(本科生)、张建军、朱映黎作者简介:王智威(2002-),2020 级在读本科生。研究方向:中药药性机制内涵与功能因子研究。E鄄mail:2898113084 通信作者:张建军(1965-),博士,教授。研究方向:基于中药药性与临床应用的药效机制及物质基础研究。E鄄mail:zhangjianjun ;朱映黎(1989-),博士,讲师。研究方向:中药药性机制内涵与功能因子研究。E鄄mail:zhuyingli1989 基于 AMPK 信号通路的附子在不同机体状态下对神经内分泌免疫网络的生物学效应表达机制研究王智威摇 邸松蕊摇 黄鹏力摇 谢辰雨摇 王一帆摇 张建军摇 朱映黎揖摘要铱摇 目的摇 基于腺苷酸激活蛋白激酶(AMP鄄activiated protein kinase,AMPK)信号通路,研究附子在寒热不同机体状态下对神经内分泌免疫(neural鄄endocrine鄄immune,NEI)网络的生物效应表达机制。方法摇 84 只雄性 KM 小鼠随机分为空白组、虚热模型组、虚寒模型组、虚热附子低剂量(10 g/kg)组、虚热附子高剂量(20 g/kg)组、虚寒附子低剂量(10 g/kg)组、虚寒附子高剂量(20 g/kg)组,每组 12 只。采用醋酸地塞米松建立虚热模型、氢化可的松琥珀酸钠建立虚寒模型,各组灌胃相应药物,连续14 日。采用酶联免疫吸附法(enzyme鄄linked immunosorbent assay,ELISA)检测环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)、环 鸟 苷 酸(cyclic guanosine monophosphatec,cGMP)、去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)、多巴胺(dopamine,DA)、5鄄羟色胺(5鄄hydroxytryptamine,5鄄HT)、三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine,T3)、甲状腺素(thyroxine,T4)、补体 C3(complement 3,C3)、C4、免疫球蛋白 G(immunoglobin G,IgG)、IgM;通过反转录荧光定量 PCR 法(reverse transcriptquantitative PCR,RT鄄qPCR)检测心脏组织脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)、6鄄磷酸果糖激酶鄄2/果糖鄄2,6鄄二磷酸酶 3(6鄄phosphofructo鄄2鄄kinase/fructose鄄2,6鄄biphosphatase 3,PFKFB3)、硬脂酰辅酶A 去饱和酶 1(stearoyl coenzyme A desaturase 1,SCD1)、胰岛素受体底物 2(insulin receptor substrate,IRS2)的 mRNA 表达。结果摇 与虚寒模型组比较,附子高剂量能够显著升高虚寒证小鼠的环核苷酸cAMP、cAMP/cGMP 含量(P0.01),神经递质 NE、DA、5鄄HT 含量(P0.01),内分泌激素 T3、T4 含量(P0.01),免疫因子 C3、C4、IgG、IgM 含量(P0.01),显著降低虚寒证小鼠 cGMP 含量(P0.01),FASN、PFKFB3、SCD1、IRS2 的 mRNA 表达(P0.01,P0.05,P0.01,P0.01);与虚热模型比较,附子对虚热证小鼠的 FASN、SCD1、PFKFB3 的 mRNA 表达则无统计学意义。结论摇辛热中药附子作用于寒热不同机体状态下通过调控 AMPK 信号通路上 FASN、PFKFB3、SCD1 基因 mRNA 表达进而影响 NEI 网络的生物学效应表达不同,并且无论是虚寒状态还是虚热状态,附子均能显著抑制 IRS2的 mRNA 表达,可能是其“效毒冶效应表达不同的机制。揖关键词铱摇 AMPK 信号通路;摇 附子;摇 机体状态;摇 中药药性;摇 NEI 网络揖中图分类号铱摇 R285.5摇 揖文献标识码铱摇 A摇 doi:10.3969/j.issn.1674鄄1749.2023.08.004Research on the mechanism of the expression of biological effect of Fuzi on neuroendocrine immunenetwork in different organismal status based on AMP鄄Activated protein kinase signaling pathwayWANG Zhiwei,DI Songrui,HUANG Pengli,XIE Chenyu,WANG Yifan,ZHANG Jianjun,ZHU YingliBeijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China环球中医药 2023 年 8 月第 16 卷第 8 期摇 Global Traditional Chinese Medicine,August 2023,Vol郾 16,No郾 81509摇Corresponding author:ZHANG Jianjun,E鄄mail:zhangjianjun ;ZHU Yingli,E鄄mail:zhuyingli1989 揖Abstract铱摇 Objective摇 Research on the mechanism of the expression of biological effect of Fuzi onneuroendocrine immune network in different organismal status(cold and heat)based on AMP鄄activatedprotein kinase(AMPK)signaling pathway.Methods摇 KM male mice were randomly divided into controlgroup,deficiency鄄heat model group,deficiency鄄cold model group,deficiency鄄heat+low dose Fuzi group(10 g/kg),deficiency-heat+high dose Fuzi group(20 g/kg),deficiency-cold+low dose Fuzi group(10 g/kg),deficiency-cold+high dose Fuzi group(20 g/kg).The deficiency鄄heat model was induced bydexamethasone acetate and the deficiency鄄cold model was induced by hydrocortisone sodium phosphate for14 days.Enzyme鄄linked immunosorbent assay(ELISA)was used to measure the levels of cAMP,cGMPNE,DA,5鄄HT and the levels of T3,T4,C3,C4,IgG,IgM were detected.The mRNA expressions ofheart tissue of FASN,PFKFB3,SCD1 and IRS2 were detected by RT鄄qPCR.Results摇 Compared with thedeficiency鄄cold model group,high dose Fuzi can significantly increase the levels of neurotransmitters NE,DA,5鄄HT levels(P0.01,P0.01,P0.01),the endocrine hormones T3,T4(P0.01,P0.01)and the immune facters C3,C4,IgG,IgM levels(P0.01),and significantly decrease the cGMP level(P0.01),the mRNA expressions of FASN,PFKFB3,SCD1,IRS2 of mice with deficiency鄄cold syndrome(P0.01,P0.05,P0.01,P0.01).Compared with the deficiency鄄heat model group,there are nosignificant differences in the mRNA expressions of FASN,PFKFB3,SCD1of mice by Fuzi.Conclusion摇Fuzi,a pungent鄄hut traditional Chinese medicine,can regulate the mRNA expressions of FASN,PFKFB3,SCD1 in different organismal status(cold and heat)mice via the AMPK signaling pathway lead to thedifferent biological effect on neuroendocrine immune(NEI)network.Meanwhile,no matter in deficiency鄄heat or deficiency鄄cold status,Fuzi can decrease the mRNA expressions of IRS2 significantly,which maybethe mechanism of different expressions of effect鄄toxicity爷of it.揖Key words铱 摇AMPK signaling pathway;摇Fuzi;摇organismal status;摇traditional Chinesemedicinal property;摇 Neuroendocrine Immune(NEI)Network摇 摇 机体状态是中药药性生物效应表达的载体,机体状态不同,中药药性作用于机体的生物学效应亦不同1。神 经内 分 泌免 疫(neural鄄endocrine鄄immune system,NEI)网络将神经、内分泌、免疫三大系统相互间的作用作为整体进行研究,以神经递质、激素、细胞因子等全面系统调控人体功能。研究表明,机体状态不同,NEI 相关指标亦有不同2鄄8。由此表明,NEI 网络对中药基于不同机体状态的生物学效应表达发挥着重要作用。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP鄄activiated proteinkinase,AMPK)被称为细胞的“能量感受器冶9,通过调节下游基因靶点10脂肪酸合成酶(fatty acidsynthase,FASN)影响中枢神经系统以及神经网络的结构11鄄12;通过调控下游靶点136鄄磷酸果糖激酶鄄2/果糖鄄2,6鄄二磷酸酶 3(6鄄phosphofructo鄄2鄄kinase/fructose鄄2,6鄄biphosphatase 3,PFKFB3)产生细胞因子调节免疫系统功能14鄄16;调节下游靶点固醇调节元件结合蛋白 1c(sterol regulatory element bindingprotein鄄1c,SREBP鄄1c)10,而 SREBP鄄1c 又能够进一步调节下游硬脂酰辅酶 A 去饱和酶 1(stearoylcoenzyme A desaturase 1,SCD1)基因表达17,影响内分泌系统功能18;除此之外,还可以调节上游靶点19胰岛素受体底物 2(insulin receptor substrate,IRS2)影响物质代谢,在神经、内分泌、免疫系统中均发挥一定调控作用20鄄22。因此,AMPK 信号通路可通过作用于 IRS2、FASN、PFKFB3、SCD1 基因靶点调节机体 NEI 网络,是连接 NEI 网络的主要信号通路之一。附子为毛茛科乌头属中药,辛、甘,大热,可回阳救逆,补火助阳,散寒止痛,为“回阳救逆第一要药冶,临床常用于治疗风寒湿痹疼痛23。研究表明,辛热中药附子作用于寒热不同机体状态会引起 NEI网络相关指标生物效应不同的改变,但基于 AMPK信号通路调节 NEI 网络相关机制研究尚未见报道。因此,本研究以 NEI 网络为切入点,对辛热中药附子通过 AMPK 信号通路调节 FASN/PFKFB3/SCD1/IRS2 基因作用于寒热不同机体状态小鼠的生物学效应表达机制进行研究。1510摇环球中医药 2023 年 8 月第 16 卷第 8 期摇 Global Traditional Chinese Medicine,August 2023,Vol郾 16,No郾 81摇 材料与方法1.1摇 实验动物SPF 级雄性 KM 小鼠84 只,体质量(20依2)g,购自维通利华实验动物技术有限公司SCXK(京)2021鄄0011,饲养于北京中医药大学 SPF 级实验动物中心。动物房室温为 22 26益,相对湿度 60%70%,光照周期 12 小时。1.2摇 实验药物、试剂与仪器受试药由中药饮片煎煮浓缩制备:附子(四川同创康能药业有限公司,批号:200701),取 500 g 附子,10 倍量水浸泡 1 小时,分两次煎煮,每次 1.5 小时,浓缩后放于 4益冰箱贮存备用。氢化可的松琥珀酸钠(常州四药制药有限公司,批号:20210811D1);醋酸地塞米松片(上海上药信谊药厂有限公司,批号:501210402)。环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)试剂盒(批号:L211201973)、环鸟苷酸(cyclic guanosine mono鄄phosphatec,cGMP)试剂盒(批号:L211228447),以上试剂盒由北京拜尔迪生物技术有限公司提供。去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)试剂盒(批号:E20220720鄄20570A)、多巴胺(dopamine,DA)试剂盒(批 号:E20220720鄄20273A)、5鄄羟 色 胺(5鄄hydroxytryptamine,5鄄HT)试剂盒(批号:E20220720鄄24791A)、三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine,T3)试剂 盒(批 号:E20220720鄄20591A)、甲 状 腺 素(thyroxine,T4)试剂盒(批号:E20220720鄄20401A)、补体 C3(complement 3,C3)试 剂 盒(批 号:E20220720鄄20210A)、补 体 C4 试 剂 盒(批 号:E20220720鄄20211A)、免疫球蛋白 G(immunoglobinG,IgG)试剂盒(批号:E20220720鄄20509A)、免疫球蛋白 M(immunoglobin M,IgM)试 剂 盒(批 号:E20220720鄄20513A),以上检测试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司。RNA 提取液(货 号:G3013),购自 Servicebio。电子天平(型号:PL鄄203),梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;酶标分析仪(型号:DR鄄200BS),无锡华卫德朗仪器有限公司;台式离心机(型号:TGL鄄16c),上海安亭科学仪器厂;冷冻离心机(型号:neofuge15R),HealForce;全自动生化分析仪(型号:Chemray鄄240),深圳雷杜生命科技;研磨仪(货号:KZ鄄芋鄄FP),Servicebio;台式高速冷冻型微量离心机(货号:D3024R),DragonLab;荧光定量 PCR 仪(货号:CFX),Bio鄄rad。1.3摇 分组与给药适应性喂养 7 天后,84 只小鼠按体质量进行编号,再按照随机数字表法分为 7 组,每组 12 只,分别为:空白组、虚热模型组、虚寒模型组、虚热附子低剂量组、虚热附子高剂量组、虚寒附子低剂量组、虚寒附子高剂量组。每日上午(7:00)进行灌胃,虚热、虚寒附子低剂量组给予附子生药量 10 g/kg,虚热、虚寒附子高剂量组给予附子生药量 20 g/kg,灌胃剂量为1.2 mL/100 g;空白组、虚热模型组和虚寒模型组于灌胃等剂量蒸馏水,连续给药 14 天。1.4摇 造模方法适应性喂养 7 天后,每日下午(16:00)空白组给予等量蒸馏水,虚热组小鼠灌胃醋酸地塞米松(0.35 mg/kg)、虚寒组小鼠灌胃氢化可的松琥珀酸钠(35 mg/kg),制备虚热、虚寒模型,根据体质量调整灌胃剂量,连续造模 14 天;模型表现同文献一致24鄄26,表示造模成功。1.5摇 取材方法实验第 15 天,采用摘眼球取血,室温静置 2 小时,在 4益条件下以 3000 r/min 离心 15 分钟后取上层血清,留存用于血清指标的检测。冰上取小鼠肾脏称重后快速放于液氮中,后转入-80益冰箱保存,用于指标检测。1.6摇 指标检测1.6.1摇 一般观察摇实验期间记录各组小鼠造模给药后毛发、精神活动状态以及每 3 天小鼠体质量的变化。1.6.2摇检测血清 cAMP、cGMP 指标摇采用酶联免疫吸附法,按照 ELISA 试剂盒步骤操作进行,完成后置于酶标仪测定吸光值,根据标准曲线计算,检测 cAMP、cGMP 水平。1.6.3摇 血清中神经递质 NE、DA、5鄄HT 检测摇采用酶联免疫吸附法检测小鼠血清中去甲肾上腺素 NE、DA、5鄄HT 含量水平,完成后置于酶标仪测定吸光值,根据标准曲线算出。1.6.4摇血清 T3、T4 检测摇根据试剂盒说明书,酶联免疫吸附法检测小鼠血清中内分泌物质 T3、T4含量水平。1.6.5摇 血清 C3、C4、IgG、IgM 检测摇 采用酶联免疫吸附法检测小鼠血清中 C3、C4、IgG、IgM 含量水平,具体操作步骤参考试剂盒说明书。1.6.6摇检测心脏组织 FASN、SCD1、IRS2、PFKFB3环球中医药 2023 年 8 月第 16 卷第 8 期摇 Global Traditional Chinese Medicine,August 2023,Vol郾 16,No郾 81511摇的 mRNA 表达摇利用反转录荧光定量 PCR 法(reverse transcript quantitative PCR,RT鄄qPCR)测定四种基因 mRNA 表达。具体引物序列见表 1。反应体系包含 1.0 滋L cDNA、10 滋mol/L 引物 0.3 滋L,Premix Taq 5 滋L,EvaGreen 0.5 滋L,加 ddH2O 补充至 10 滋L,95益 5 分钟预变性后,95益10 秒寅60益30秒,40 个循环。采用 2-驻驻Ct分析相对基因表达差异。表 1摇 引物序列基因引物序列(5爷寅3爷)退火温度(益)产物长度(bp)FASNF:TGAATCAGCCCCACGCAGTR:CCGAGTCAGTCTTGGAGGACAT60益297PFKFB3F:CTCTTACAACTTCTTCCGCCCTR:ACTGCAATCTGTCCACCTTCCTT60益120SCD1F:GTTAGCACCTTCTTGCGATACACTR:GTGAAGTTGATGTGCCAGCG60益218IRS2F:CAGGACCTTCCCAGTAAACGGR:GTAGCTTAGGGTCTGGGTTCTCC60益1311.7摇 统计学方法采用 SPSS 20.0 进行统计分析,数据用均值依标准差(x依s)表示,进行正态分布、方差齐性分析及组间数据比较用单因素方差(One鄄way ANOVA)分析,符合正态分布时采用方差齐性分析,各组方差齐时采用最小显著法(LSD)进行统计分析,方差不齐时采用 Dunnett爷s 进行统计分析,P0.05 代表有统计学意义。2摇 结果2.1摇 附子对虚热、虚寒机体状态小鼠一般状况及体质量的影响与空白组比较,虚热模型组小鼠出现毛发偏黄、大便秘结、小便黄、暴躁易怒等现象,虚寒模型组小鼠出现精神萎靡、被毛无光泽、活动减少、抱团等现象。与虚热模型组比较,附子组小鼠症状加重;与虚寒模型组比较,附子组小鼠精神状态有很大程度改善。与空白组比较,虚热模型组和虚寒模型组小鼠体质量在第7 天均开始显著降低(P0.01,P0.05);与虚热模型组比较,虚热附子低剂量组小鼠体质量在第 14 天显著升高(P0.05),而虚热附子高剂量组小鼠体质量未有改善,变化趋势与虚热模型组相似;与虚寒模型组比较,虚寒附子高剂量组体质量在第 14 天显著升高(P0.05)。结果见表 2。表 2摇 附子对虚热、虚寒机体状态小鼠的影响小鼠体质量的影响(x依s)组别鼠只第 1 天(g)第 7 天(g)第 14 天(g)空白组1236.55依1.7341.15依2.2843.92依2.68虚热模型组1235.31依2.4835.92依2.44b36.13依2.88b虚寒模型组1236.48依1.6837.63依2.14a38.42依2.22b虚热附子低剂量组 1235.99依2.1137.69依2.1138.95依2.64c虚热附子高剂量组 1234.93依2.4336.76依2.9436.48依3.99虚寒附子低剂量组 1236.52依2.1438.22依2.5939.70依2.65虚寒附子高剂量组 1236.63依2.9739.10依3.3141.07依3.56eF1.0995.1929.676P0.3710.0000.000注:与空白组比较,aP0.05,bP0.01;与虚热模型组比较,cP0.05,dP0.01;与虚寒模型组比较,eP0.05,fP0.01。2.2摇 附子对虚热、虚寒机体状态小鼠血清环核苷酸水平的影响与空白组比较,虚热模型组 cAMP、cAMP/cGMP含量显著升高(P 0.05,P 0.01),虚寒模型组cAMP、cAMP/cGMP 含量显著降低(P 0.01),而cGMP 含量显著升高(P0.05);与虚寒模型组比较,虚热附子高剂量组 cGMP 含量显著降低(P0.01),而cAMP、cAMP/cGMP 含量显著升高(P0.01)。结果见表 3。2.3摇 附子对虚热、虚寒机体状态小鼠神经递质的影响与空白组比较,虚热模型组 NE、DA 含量显著升高(P0.01),5鄄HT 含量显著降低(P0.01),而虚 寒 模 型 组 NE、DA、5鄄HT 含 量 均 显 著 降 低(P0.05);与虚寒模型组比较,虚热附子高剂量组 NE、DA、5鄄HT 含量显著升高(P0.05)。结果见表 4。1512摇环球中医药 2023 年 8 月第 16 卷第 8 期摇 Global Traditional Chinese Medicine,August 2023,Vol郾 16,No郾 8表 3摇 附子对虚热、虚寒机体状态小鼠血清环核苷酸水平的影响(x依s)组别鼠只给药剂量cAMP(nmol/mL)cGMP(nmol/L)cAMP/cGMP空白组12-7.83依1.125.34依0.831.51依0.35虚热模型组120.35 mg/kg8.94依1.26a5.01依1.131.84依0.31b虚寒模型组1235 mg/kg4.84依1.18b7.95依0.92b0.62依0.16b虚热附子低剂量组1210 g/kg8.35依1.125.37依1.151.61依0.33虚热附子高剂量组1220 g/kg8.37依1.005.11依1.091.70依0.36虚寒附子低剂量组1210 g/kg5.92依0.79e7.30依0.750.81依0.10虚寒附子高剂量组1220 g/kg7.06依1.16f5.98依0.82f1.21依0.33fF21.98717.34529.851P0.0000.0000.000注:与空白组比较,aP0.05,bP0.01;与虚热模型组比较,cP0.05,dP0.01;与虚寒模型组比较,eP0.05,fP0.01。表 4摇 附子对虚热、虚寒机体状态小鼠神经递质的影响(x依s)组别鼠只给药剂量NE(ng/mL)DA(pg/mL)5鄄HT(ng/mL)空白组12鄄4.03依0.7073.90依9.62123.92依15.58虚热模型组120.35 mg/kg6.58依1.08b87.01依7.85b74.90依21.36b虚寒模型组1235 mg/kg2.74依0.51b59.84依10.39b77.58依16.59b虚热附子低剂量组1210 g/kg5.94依1.0684.62依7.5088.37依13.13虚热附子高剂量组1220 g/kg6.06依1.1187.06依7.3886.91依20.63虚寒附子低剂量组1210 g/kg3.17依0.7663.64依10.7992.04依18.07虚寒附子高剂量组1220 g/kg4.13依0.79f70.11依10.36f124.21依20.93fF35.44017.97815.064P0.0000.0000.000注:与空白组比较,aP0.05,bP0.01;与虚热模型组比较,cP0.05,dP0.01;与虚寒模型组比较,eP0.05,fP0.01。2.4摇 附子对虚热、虚寒机体状态小鼠内分泌水平的影响与空白组比较,虚热模型组 T3、T4 含量显著升高(P0.01),而虚寒模型组 T3、T4 含量显著降低(P0.01)。与虚热模型组比较,虚热附子低、高剂量组 T3含量显著降低(P0.05);与虚寒模型组比较,虚寒附子低、高剂量 T3 含量显著升高(P0.01),虚寒附子高剂量组 T4 含量显著升高(P0.05)。结果见表 5。2.5摇 附子对虚热、虚寒机体小鼠免疫水平的影响与空白组比较,虚热模型组 C3、C4、IgG、IgM 含量显著升高(P0.01),虚寒模型组 C3、C4、IgG、IgM含量显著降低(P0.01);与虚热模型组比较,虚热附子低剂量组 C3 含量显著降低(P0.05);与虚寒模型组比较,虚寒附子低剂量组IgG、IgM 含量显著升高(P0.01),虚寒附子高剂量组 C3、C4、IgG、IgM 含量均显著升高(P0.05)。结果见表 6。2.6摇附子对虚热、虚寒机体小鼠 FASN、PFKFB3、SCD1、IRS2 基因 mRNA 表达的影响与空白组比较,虚热模型组 FASN、PFKFB3、SCD1、IRS2 的 mRNA 表达显著升高(P 0.01,P0.01,P0.05,P 0.05),虚寒模型组 FASN、PFKFB3、SCD1、IRS2 的 mRNA 表 达 显 著 升 高(P0.01,P0.05,P0.01,P0.05);与虚寒、虚热模型组比较,虚寒附子高剂量组FASN、PFKFB3、SCD1、IRS2 的 mRNA 表达均显著降低(P0.01,P0.05,P0.01,P0.01),虚热附子高 剂 量 组 IRS2 的 mRNA 表 达 均 显 著 降 低(P0.05)。结果见表 7。环球中医药 2023 年 8 月第 16 卷第 8 期摇 Global Traditional Chinese Medicine,August 2023,Vol郾 16,No郾 81513摇表 5摇 附子对虚热、虚寒机体状态小鼠内分泌的影响(x依s)组别鼠只给药剂量T3(pg/mL)T4(ng/mL)空白组12-1416.46依242.2147.23依5.70虚热模型组120.35 mg/kg1932.20依240.00b59.41依6.48b虚寒模型组1235 mg/kg710.71依132.61b26.07依4.56b虚热附子低剂量组1210 g/kg1618.70依192.26d56.48依7.19虚热附子高剂量组1220 g/kg1670.95依211.47d58.87依5.71虚寒附子低剂量组1210 g/kg940.25依180.39f31.15依6.73虚寒附子高剂量组1220 g/kg1160.91依231.55f40.62依8.97fF52.48050.563P0.0000.000注:与空白组比较,aP0.05,bP0.01;与虚热模型组比较,cP0.05,dP0.01;与虚寒模型组比较,eP0.05,fP0.01。表 6摇 附子对虚热、虚寒机体状态小鼠免疫因子的影响(x依s)组别鼠只给药剂量C3(滋g/mL)C4(滋g/mL)IgG(mg/mL)IgM(滋g/mL)空白组12-73.50依8.9299.12依15.379.96依1.432208.36依315.37虚热模型组120.35 mg/kg98.77依9.72b132.07依16.24b14.73依1.86b3160.96依326.84b虚寒模型组1235 mg/kg54.74依6.69b75.50依9.40b6.92依1.23b1607.56依159.77b虚热附子低剂量组1210 g/kg83.78依11.05c125.00依14.7113.55依1.912893.28依330.36虚热附子高剂量组1220 g/kg91.93依9.19127.99依17.0214.11依1.982970.36依267.98虚寒附子低剂量组1210 g/kg63.79依6.4886.16依10.408.96依1.34f1869.34依235.22f虚寒附子高剂量组1220 g/kg72.01依7.84f106.71依11.69f9.54依1.83f2077.63依245.02fF38.40130.10838.37958.264P0.0000.0000.0000.000注:与空白组比较,aP0.05,bP0.01;与虚热模型组比较,cP0.05,dP0.01;与虚寒模型组比较,eP0.05,fP0.01。表 7摇 附子对虚热、虚寒机体状态小鼠 Fasn、PFKFB3、SCD1、IRS2 基因 mRNA 表达的影响(x依s)组别鼠只给药剂量FASNPFKFB3SCD1IRS2空白组3-0.75依0.111.00依0.180.39依0.070.81依0.17虚热模型组30.35 mg/kg1.04依0.16b1.49依0.12b0.55依0.03a1.23依0.17a虚寒模型组335 mg/kg1.04依0.05b1.44依0.10a0.74依0.10b1.13依0.26a虚热附子高剂量组320 g/kg0.85依0.101.20依0.300.50依0.140.43依0.04d虚寒附子高剂量组320 g/kg0.76依0.08f1.07依0.06e0.35依0.06f0.45依0.08fF5.4864.8199.07115.752P0.0130.0200.0020.000注:与空白组比较,aP0.05,bP0.01;与虚热模型组比较,cP0.05,dP0.01;与虚寒模型组比较,eP0.05,fP0.01。3摇 讨论机体状态是中药药性生物学效应表达的载体,对药物体内代谢生态环境具有重要作用,寒热机体状态不同亦会使同一中药的生物效应表达也不同1。NEI 网络对于中药基于不同机体状态的生物学效应表达发挥着重要作用。研究表明,AMPK 信号通路是连接 NEI 网络的主要信号通路之一。因此,本文对辛热药附子作用于寒热不同机体状态后NEI 网络生物效应不同进行了探察,并通过 AMPK信号通路 FASN/PFKFB3/SCD1/IRS2 基因靶点对其不同生物学效应表达机制进行了深入研究。现代研究表明,机体寒热状态的产生与神经2鄄4、内分泌5鄄6、免疫7鄄8、环核苷酸水平27状态1514摇环球中医药 2023 年 8 月第 16 卷第 8 期摇 Global Traditional Chinese Medicine,August 2023,Vol郾 16,No郾 8的异常息息相关。环核苷酸系统 cAMP 和 cGMP 作为细胞间信息传导的第二信使,与物质代谢中密切相关,在维持机体神经内分泌免疫网络的平衡中起重要作用28。寒热不同机体状态中环核苷酸的表达有明显的差异,虚热时,cAMP,cAMP/cGMP升高,虚寒时,cAMP、cAMP/cGMP 降低29,为中医微观辨证之一30。结果显示,地塞米松组小鼠症状基本符合阴虚(虚热)表观诊断指标;氢化可的松组小鼠症状基本符合阳虚(虚寒)表观诊断指标。辛热中药附子干预虚寒、虚热小鼠后,虚寒小鼠cAMP,cAMP/cGMP 含量升高,体质量能够增长至正常水平,状态恢复;而虚热小鼠 cAMP,cAMP/cGMP仍处于高水平体质量则出现负增长,精神状态未得到改善。因此表明,附子作用于寒热不同机体状态时,环核苷酸差异性表达,且对于体重与精神状态的改变呈相反趋势。同时,机体状态不同,NEI 网络相关指标亦有不同。研究表明,虚热状态下,交感神经兴奋,NE 和DA 含量增加、5鄄HT含量减少2;而虚寒状态下,中枢神经系统被抑制,NE 和 DA 含量减少,5鄄HT 含量增加或减少,其减少原因可能与 5鄄HT 系统受到损坏有关3鄄4。而神经递质水平的异常,则会进一步影响到内分泌与免疫系统。研究表明,虚热状态下,内分泌功能亢进,T3 和 T4 含量增加5,虚寒状态下,T3 和 T4 含量则会减少6。另外,研究发现虚热状态下,IgG、IgM、补体 C3 均升高,免疫功能呈现为相对亢进状态,其机制可能为阴不制阳,阳气相对亢进,正气处于“虚冶的相对亢奋状态7;虚寒状态时机体免疫力低下,降低 IgG、IgM、补体 C3 的合成8。本实验中虚热模型组小鼠神经递质(NE、DA)、内分泌激素(T3、T4)、免疫因子(C3、C4、IgG、IgM)的含量均升高,神经递质 5鄄HT 含量降低;表明虚热状态下小鼠的 NEI 网络异常表现为:中枢神经系统亢奋,内分泌激素分泌增加,免疫功能亢奋7。虚寒模型组小鼠神经递质(NE、DA、5鄄HT)、内分泌激素(T3、T4)、免疫因子(C3、C4、IgG、IgM)含量均降低;表明虚寒状态下小鼠 NEI 网络异常表现为:中枢神经系统抑制,内分泌激素分泌减少,免疫功能低下。附子作用于寒热不同机体状态小鼠后,低剂量附子能使虚寒小鼠的 T3、IgG、IgM 水平得到恢复,高剂量附子能使纠正虚寒证小鼠神经递质水平低下、内分泌系统和免疫功能的紊乱;而虚热证小鼠经附子干预后,小鼠神经递质、内分泌因子和免疫因子仍处于异常水平,表明附子在寒热不同机体状态下对 NEI 网络系统具有不同的生物学效应。AMPK 信号通路作为连接 NEI 网络的主要信号通路之一,能够通过 FASN、PFKFB3、SCD1、IRS2 基因进行调节。研究表明 FASN 能够影响中枢神经系统11,以及神经网络的结构方面12,且在甲状腺功能亢进(虚热)状态下被诱导上调31。PFKFB3 能够诱导巨噬细胞的糖酵解通量增加,增强 M1 型巨噬细胞的促炎功能,抗原呈递 MHC 复合物高表达,在机体免疫应答过程中发挥重要作用14鄄16。另外,SCD1 的表达不仅影响内分泌甲状腺18,且参与炎症反应32鄄33。也就是说,AMPK 信号通路通过调节FASN、PFKFB3、SCD1 基因靶点参与调控 NEI 网络的生理功能,本研究结果显示,附子能够显著抑制虚寒小鼠 FASN、PFKFB3、SCD1 的 mRNA 表达,而对虚热状态小鼠 FASN、PFKFB3、SCD1 基因表达无统计学差异。表明,附子作用于寒热不同机体状态下通过调控 AMPK 信号通路上 F