多杀性巴氏杆菌快速检测方法研究进展.pdf

232023.8试验研究0 引言多杀性巴氏杆菌是一种可引起畜禽巴氏杆菌病的病原菌，其感染主要引起动物出血性败血症或传染性肺炎。不同种类的动物感染后导致的疾病名称也不一样，如家禽感染P.multocida称禽霍乱，猪感染P.multocida称为猪肺疫，牛感染P.multocida则称为牛出血性败血症等。多杀性巴氏杆菌感染在我国畜禽中广泛存在，是动物临床诊断中重要的病原菌之一，给我国养殖业造成巨大的经济损失1。多杀性巴氏杆菌两端钝圆，呈中央微突出的短杆状或球杆状，不形成芽孢，无鞭毛，且革兰氏染色阴性。根据荚膜抗原（K抗原）可将其分为A、B、D、E和F 5种血清群，基于菌体抗原（O抗原）则可将其分为12种血清型。宿主选择性、致病性及症状等都与血清型有关2-3。快速、准确检测P.multocida对于科学防控畜禽巴氏杆菌病具有重要意义。本文综述了近年国内外报道的P.multocida快速检测方法，以期为我国科学防控畜禽巴氏杆菌病提供方法参考。1 基于免疫学方法1.1 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种实验室常用的收稿日期：2023-06-21基金项目：江苏农林职业技术学院青年扶持项目（2022kj32）；江苏省高等学校基础科学（自然科学）研究面上项目（22KJB180001）作者简介：申秋平（1989-），女，硕士，实验员，研究方向：畜禽病原微生物快速诊断技术研究及应用。*通信作者简介：庄林林（1990-），男，博士，讲师，研究方向：体外诊断技术研究及应用。申秋平，徐佳豪，王新茹，等多杀性巴氏杆菌快速检测方法研究进展J现代畜牧科技，2023，99（8）：23-28doi：10.19369/ki.2095-9737.2023.08.005SHEN Qiuping，XU Jiahao，WANG Xinru，et alResearch Progress of Rapid Detection Methods for Pasteurella MultocidaJModern Animal Husbandry Science&Technology，2023，99（8）：23-28多杀性巴氏杆菌快速检测方法研究进展申秋平，徐佳豪，王新茹，庄林林*（江苏农林职业技术学院，江苏 镇江 212400）摘要：多杀性巴氏杆菌（P.multocida）是一种可引起畜禽巴氏杆菌病的病原菌，其感染主要引起动物出血性败血症或传染性肺炎，给我国畜禽养殖业造成巨大的经济损失。快速、准确检测P.multocida对于畜禽巴氏杆菌病的科学防控具有重要意义。该文综述近年国内外报道的P.multocida快速检测方法，包括免疫学检测技术（酶联免疫吸附试验、间接血凝试验、免疫层析技术、免疫斑点试验、基于免疫磁珠的显色法等）和核酸检测技术（PCR及其衍生技术、多种等温扩增技术、荧光原位杂交以及基于核酸的新型检测方法等），以期为我国科学防控畜禽巴氏杆菌病提供参考方法。关键词：多杀性巴氏杆菌；免疫学方法；核酸检测方法；快速检测中图分类号：S852.612文献标识码：Adoi：10.19369/ki.2095-9737.2023.08.005Research Progress of Rapid Detection Methods for Pasteurella MultocidaSHEN Qiuping，XU Jiahao，WANG Xinru，ZHUANG Linlin*（Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry，Zhenjiang Jiangsu 212400，China）Abstract：Pasteurella multocida（P.multocida）is a pathogenic bacterium that can cause pasteurellosis in livestock and poultryIts infection mainly causes hemorrhagic septicemia or infectious pneumonia in animals，which has caused huge economic losses to our farming industryRapid and accurate detection of P.multocida is of great significance for the scientific prevention and control of animal pasteurellosisThe paper reviewed the rapid detection methods for P.multocida reported in recent years，including immunology-based detection methods（enzyme-linked immunosorbent assay，Indirect hemagglutination assay，immunochromatographic techniques，dot immunobinding assay，immunomagnetic bead-based colorimetric method，etc.）and nucleic acid-based detection methods（PCR and its derivative techniques，multiple isothermal amplification techniques，fluorescent in situ hybridization，and novel nucleic acid-based detection methods，etc.），with a view to providing methodological references for the scientific prevention and control of livestock and poultry pasteurellosis in ChinaKeywords：Pasteurella multocida，immunological methods，nucleic acid-based detection methods，rapid detection24 2023.8试验研究免疫学检测技术，可用于检测样品中的抗体或抗原。ELISA具有简单、快速、重复性好等优点。使用弱毒株包被ELISA板建立的一种可检测鸡P.multocida抗体的方法4。其敏感性比琼扩法高约3个数量级，且与鸡新城疫、传染性支气管炎等血清无交叉反应性。Poolperm P等5使用X-73株热提取抗原为包被抗原，开发一种间接ELISA方法。该方法的敏感性和特异性分别为94.7%、87.2%，适用于临床检测鸭P.multocida抗体。此外，以破碎的菌体作为包被抗原，同样可用于建立间接ELISA方法，并在兔巴氏杆菌病检测中表现出良好的应用性能6。通过重组蛋白进行动物免疫可获得特定的单克隆或多克隆抗体。Liu R等7开发了一种基于重组外膜蛋白（rOmpH）的间接ELISA方法以检测鸭P.multocida抗体。与微孔凝集试验相比，该方法的特异性和敏感度分别可达95%、100%。经165份样品验证表明，该方法具有较好的临床适用性。此外，卢艳等8以OmpH重组蛋白为包被抗原，建立一种阻断ELISA方法。结果显示，该方法具有较高的敏感性和可重复性，且临床样品验证结果与Western Blot的符合率达91.38%。此外，抗原包被作为间接ELISA中的重要步骤，直接影响检测方法的应用性能。研究表明，全菌抗原建立的禽P.multocida ELISA方法在敏感性、特异性等方面优于超声波裂解抗原和脂多糖蛋白抗原9。1.2 间接血凝试验间接血凝试验（IHA）是将抗原（抗体）包被于红细胞表面以制备致敏载体，然后将其与相应的抗体（抗原）结合，使红细胞聚集引起可见的凝集反应。顾万钧等10使用禽P.multocida致敏的绵羊红细胞测定免疫鸡的血清抗体效价。结果表明，IHA具有较好的特异性和敏感性，且间接血凝效价与对抗强毒攻击的保护作用一致。毛春生等11通过优化间接血凝试验及抗原制备条件建立了一种检测鸡血清中P.multocida抗体的方法。该方法具有简单、敏感、特异等优势。1.3 免疫层析技术免疫层析技术是一种基于免疫反应原理的简单、便捷且易于操作的方法，可用于快速检测样品中的特定生物分子，如蛋白质、抗原或抗体。为快速检测鸭血清中P.multocida抗体，程龙飞等12将兔抗鸭免疫球蛋白G（IgG）标记胶体金，制备了一种简单快速的胶体金试纸条。结果表明，效价116（琼脂扩散试验）的鸭抗多杀性巴氏杆菌血清1320倍稀释后使用该方法仍可检测到。该方法与大肠杆菌、鸭疫里默氏菌、金黄色葡萄球菌血清等无交叉反应性，且具有较好的重复性。经ELISA验证，该方法阳性和阴性的符合率分别为94.03%、100%，适于在兽医临床中推广应用。1.4 免疫斑点试验免疫斑点试验（DIA）是一种常见的免疫学检测技术，用于检测样品中特定的抗原或抗体。通常使用特定抗原或抗体溶液滴在固相载体上，形成斑点。该方法具有操作简单、快速、成本可控等优点。Choi K H等13建立一种DIA法来检测火鸡血清中P.multocida抗体。试验结果表明，DIA的特异性优于ELISA，适用于临床快速诊断。1.5 其他基于免疫学的新型检测方法为快速检测牛源A型P.multocida，郑冰洁等14用单克隆抗体作为捕获探针偶联到磁珠表面以构建免疫磁珠，发挥特异性捕获作用。辣根过氧化物酶标记另一株单克隆抗体作为检测探针，与捕获的P.multocida相互作用，建立了一种“双抗夹心”免疫显色方法。该方法针对牛源A型P.multocida的检测限为1.0105 CFU/mL，具有良好的特异性、可重复性及临床适用性。1.6 免疫学检测方法的优缺点免疫学检测方法是实验室常用的快速检测方法。ELISA是目前实验室最常用的免疫学技术，具有易于操作、可重复性好等优点，但存在潜在的交叉反应性，检测时间相对较长，且需要特定的仪器，如酶标仪等。IHA方法相对简单、成本低廉，但易受红细胞状态影响，且结果判读需有一定经验。免疫层析技术简单、快速，适于现场快速检测，但敏感性和特异性有待提高。DIA操作简便、快速且无需复杂设备，但结果的定量分析能力有限，且特异性和敏感性也有待提升。磁珠具有高比表面积以及生物相容性等，其与免疫学技术的联合提供了更加准确、快速、灵敏的检测方法，有望在畜禽临床诊断中发挥重要作用。2 核酸检测方法2.1 基于聚合酶链式反应的方法2.1.1 常规聚合酶链式反应聚合酶链式反应（PCR）是通过模拟DNA复制过程体外扩增DNA片段的技术15。施少华等16基于kmt基因建立的PCR方法最低可检测出1 ng/L的P.multocida基因组DNA，且与其他禽源菌基因组DNA无交叉反应性。宫强等17基于禽多杀性巴氏杆菌ptfA基因设计并合成引物，建立并优化了一种PCR方法。结果表明，该方法针对P.multocida基因组DNA的检测限可达1 pg/L，且与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等无交叉反应性。为鉴定野生水禽P.multocida血清I型，Rocke T E等18开发了一种血清型特异性PCR方法，与其他15种血清型无交叉反应性。该方法可在24 h内检出样品中的P.multocida血清I型，且检测限低至2.3 cells/mL。不同温度的储存条件和不同组织对禽巴氏杆菌基因252023.8试验研究组DNA的检测也有重要影响。Shivachandra S B等19研究表明，禽病料组织在20 和4 的条件下储存40 d后，经PCR检测仍未阳性，而在37 仅能储存不超过3 d。此外，来自骨髓的基因组PCR检测结果的重复性明显优于来源于肝、肺、肾、心脏等组织。进一步地，该团队通过对2次禽类霍乱暴发中获得的多杀性巴氏杆菌的表型和基因型进行鉴别研究发现，与传统方法相比，分子检测和分型的方法具有快速、敏感、特异等优势，适于作为禽霍乱暴发时的快速诊断工具20。2.1.2 多重PCR多重PCR（mPCR）是在PCR反应体系中加入2对及以上的引物以同时扩增出多个目标基因片段的方法。张曼等21基于禽P.multocida、副鸡嗜血杆菌和大肠杆菌特异性基因设计3对特异性引物，建立了一种可快速检测上述3种病原菌的mPCR方法。结果表明该方法针对禽多杀性巴氏杆菌的检测限为24.3 pg/L。经83份临床样品验证，该方法检测结果与PCR具有较高的一致性。考虑到常规生化测试并非在所有的情况下都能准确鉴别P.multocida的3个亚种，Ujvri B等22基于gatD和16S rRNA基因设计引物，建立了一种可快速区分检测P.multocida亚种的mPCR方法。经70多株参考株及分离株验证，该方法可特异性检测P.multocida。杨莉等23建立mPCR可一步法检测牛P.multocida、支原体以及结核分枝杆菌。针对牛P.multocida DNA的检测限为3.07510-2 ng/L。此外，仇桂玲等24采用荚膜和脂多糖mPCR对P.multocida分离株进行分型鉴定，结果表明，目前广东部分地区P.multocida的荚膜型和脂多糖型仍分别以A和L1为主。该结果与高明燕等25对20092017年华东地区禽多杀性巴氏杆菌流行株分析结果一致。为一步法检测兔P.multocida和兔出血症病毒（RHDV），王豪杰等26基于P.multocida kmt1基因和RHDV VP60基因建立了一种双重PCR方法。结果表明，该方法对P.multocida质粒的检测限为17.9 拷贝/L，且临床样品检测结果与常规PCR一致。王锦祥等27根据kmt1和fcbD基因设计引物建立的双重PCR，可同时检测及区分兔源F型和A/D型P.multocida。此外，高瑞等28建立的双重PCR可同时检测牛源P.multocida和溶血性曼氏杆菌，具有良好的敏感性、特异性和临床适用性。朱新贵等29基于16S rRNA以及kmt1基因建立的mPCR在猪P.multocida快速检测中同样取得了良好的应用效果。Shivachandra S B等30研究表明，荚膜mPCR可用于鉴别不同血清型的多杀性巴氏杆菌，且具有较高的特异性。该研究结论同样得到Townsend K M等31研究的支持。因此，荚膜mPCR技术适于禽霍乱的常规诊断和流行性病学调查，且为准确鉴别禽霍乱具体病原提供了有力技术支持。李霄阳等32基于P.multocida及其A、B荚膜群建立的mPCR方法，准确、特异且重复性好，有望替代血清学方法用于牛巴氏杆菌病的诊断。2.1.3 荧光定量PCR荧光定量PCR（qPCR）是一种基于PCR技术的定量分析方法，用于检测和测量目标DNA序列的数量。它结合了PCR扩增技术和荧光探针技术，通过监测荧光信号的累积来确定目标DNA的数量。许腾林等33根据kmt1基因保守区设计引物和核酸探针，建立了一种可快速检测P.multocida的qPCR方法。该方法可特异性检测多杀性巴氏杆菌，且检测限可达1.75101拷贝/L，优于常规PCR。经临床样品验证，该qPCR方法与细菌分离鉴定结果一致，且敏感性与李明桃34基于P.multocida 16S rRNA建立的qPCR方法相当。为同时检测禽P.multocida及其荚膜A型的快速检测方法，刘本金等35基于P.multocida kmt1基因建立并优化了一种双重qPCR方法。该qPCR方法对重组质粒的检测限为10拷贝/L，比常规PCR高2个数量级，且具有良好的重复性。为特异、敏感检测兔源F型P.multocida，王锦祥等36以fcbD为靶基因建立的qPCR方法检测限可达10 拷贝/L，且批内、批间变异系数均小于3%。赵静等37以SYBR Green I为荧光染料、kmt1为靶基因建立的qPCR在牛P.multocida检测应用中同样表现出良好的临床适用性。2.1.4 套式PCR套式PCR是一种基于PCR的核酸扩增技术，其原理是先用一对外引物对目标基因进行扩增，得到一段较长的DNA片段，以该片段作为另一对内引物扩增的模板，得到大量相对较短的扩增片段。套式PCR技术具有准确、特异、敏感等优点，已广泛应用于基因分析、病原体检测等领域。为了高敏、特异性检测羊P.multocida与布鲁氏菌，吴昊天等38基于P.multocida kmt1和布鲁氏菌bcsp31基因分别设计了内外2对引物，建立一种双重套式PCR方法。该方法对kmt1的检测限为70.9拷贝/L，同时具有良好的特异性和临床适应性。汤细彪等39根据产毒素P.multocida toxA基因设计2对引物，建立了一种可快速、特异检测猪鼻拭子中P.multocida的套式PCR方法。该方法的检测限为26 CFU菌量的DNA，且与细菌分离鉴定的符合率达96.58%。2.2 核酸等温扩增技术2.2.1 环介导等温扩增技术环介导等温扩增（LAMP）是2000年由Notomi T等40报道的一种核酸恒温扩增技术。该技术无需核酸变性过程，可在6065 等温条件下对靶序列进行快速扩增。施少华等41利用LAMP方法对禽P.multocida进行快速检测，结果表明LAMP方法可在65 恒温、1 h内完成检26 2023.8试验研究测，且检测限可达100 pg/L。Bhimani M等42基于kmt1基因设计LAMP引物建立了一种可快速检测P.multocida的方法，可在65、30 min内完成检测，且检测限为22.8 pg/L，比PCR法低2个数量级。王锦祥等43基于fcbD基因设计引物，建立了一种可快速检测兔源F型P.multocida的LAMP方法，检测限为1102拷贝/L，且具有良好的特异性和重复性。Pascual-Garrigos A等44开发了用于牛P.multocida快速检测的比色LAMP方法，具有66.7%100%的分析灵敏度和100%的分析特异性。孙建华等45基于P.multocida的PlpB基因建立的LAMP方法可在20 min内完成DNA扩增及检测。此外，LAMP方法在牦牛、兔P.multocida检测中同样表现出良好的应用性能46-47。2.2.2 重组酶聚合酶扩增技术重组酶聚合酶扩增（RPA）是近年发展起来的一种核酸等温扩增技术，能够在室温下高效扩增DNA，具有反应时间短、灵敏度高等优点。为了快速检测P.multocida，Zhao G等48应用免疫层析（LFD）建立了一种RPA-LFD方法。RPA可在39 恒温、30 min内将P.multocida基因组DNA扩增至可检测级别。RPA-LFD方法的检测限为120 拷贝/反应。与培养方法相比，RPA-LFD方法的灵敏度和特异性分别为100%和67.20%。2.2.3 重组酶介导等温核酸扩增技术重组酶介导等温核酸扩增（RAA）技术是一种基于重组酶的核酸扩增技术，利用重组酶的特性，可以在37（优选温度）恒温条件下实现高效、准确的核酸扩增。为了实现简单、快速检测P.multocida，杜秋明等49基于kmt1基因设计引物及探针，建立了一种荧光RAA方法。该RAA方可在39 恒温、20 min内完成靶基因扩增，与其他细菌及寄生虫无交叉反应。该方法检测限为10 拷贝/L，且具有较好的可重复性。临床样品验证表明，该RAA方法检测结果与qPCR一致。2.3 荧光原位杂交荧光原位杂交（FISH）是一种可在细胞中寻找和识别特定DNA序列的技术，其基本原理是将荧光标记的探针与目标基因的DNA序列进行杂交，然后通过荧光显微镜进行检测与定位。Mbuthia P G等50基于多杀性巴氏杆菌16S rRNA设计了一种特异性寡核苷酸探针，结果表明，使用该探针可将P.multocida与巴氏杆菌科的其他细菌种属和肠杆菌科区分开。2.4 基于核酸的其他检测方法Corney B G等51以16S rRNA基因为靶标，设计MGB（minor groove binder）探针建立了一种5Taq核酶检测方法。针对禽多杀性巴氏杆菌，该方法检测限可达约10 CFU菌量的DNA。经参考株和临床分离株验证，该方法与其他巴氏杆菌属及禽病毒均无交叉反应性，具有良好的特异性和临床检测适用性。为了实现P.multocida现场即时检测，Hao J等52提出了一种基于CRISPR-Cas12a的可视化检测平台（Cas12a-NEye），在不使用激发光的情况下，阳性样品用肉眼可见明显的红色，而阴性样品则为蓝色。该方法检测限为1拷贝，且与其他病原菌无交叉反应。经临床样品验证，该方法检测结果与qPCR一致，且可在1.5 h内完成检测（包括约1 h的DNA提取及25 min的Cas12a-NEye检测）。基因芯片技术是一种可用于基因检测及分析的高通量分子技术。肖国生53构建了一种基因芯片可同时检测P.multocida、胸膜肺炎放线杆菌和猪肺炎支原体，并在临床检测及分型中展示出良好的应用价值。2.5 核酸检测方法的优缺点核酸检测技术在P.multocida快速检测及鉴别中发挥着越来越重要的作用。PCR及其衍生技术具有灵敏、特异、速度快、结果准确等优势，但该类方法需要精确的热循环条件，且要么需使用存在安全隐患的核酸染料，要么需使用价格较高的修饰引物。等温扩增技术无需热循环设备，检测速度快，且结果呈现方式多样，但相比于PCR，该类技术成熟度仍有待提高，且需要注意非特异性扩增的可能性。FISH可定位检测DNA或RNA，但操作步骤相对复杂，且需要荧光显微镜设备。基于核酸的新型检测方法，如基因芯片等，具有高效、准确、特异等优点，但相关方法技术门槛仍较高，目前难以推广使用。3 小结与展望近年国内外报道了多种多杀性巴氏杆菌快速检测方法，主要可分为基于免疫学及核酸检测2大类。其中，免疫学检测方法主要包括ELISA、IHA、免疫层析技术、DIA、基于免疫磁珠的显色法等。这些方法具有快速、简便等优点，但也存在一定的局限性，如准确性和灵敏度仍有待提高。相比于免疫学方法，核酸检测方法具有更高的灵敏度和检测速度。目前，该类方法主要包括PCR及其衍生技术、等温扩增技术、荧光原位杂交以及其他新型检测方法等。通过靶向P.multocida特定基因或序列，可大幅提高检测的准确性和特异性。但目前这类方法在一些方面也有待改进，如需要特殊仪器、操作要求及技术门槛较高等。未来通过提升技术成熟度、改进现有设备、简化操作流程，降低对操作技巧和经验的依赖性，将更好地满足临床检测P.multocida的需求。随着多学科交叉及技术的融合创新，也将有望实现更高效、更智能的快速检测。272023.8试验研究参考文献1Davies R L，MacCorquodale R，Reilly SCharacterisation of bovine strains of Pasteurella multocida and comparison with isolates of avian，ovine and porcine originJVet 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