高效液相色谱法定量分析硫醇化合物的研究.pdf

第4 9卷 第2期2 0 2 3年6月延 边 大 学 学 报(自然科学版)J o u r n a l o f Y a n b i a n U n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c e E d i t i o n)V o l.4 9 N o.2J u n.2 0 2 3收稿日期:2 0 2 2 1 1 2 5基金项目:国家自然科学基金(2 2 0 6 4 0 1 7)第一作者:李航(1 9 9 8),女,硕士研究生,研究方向为药物分析.通信作者:金东日(1 9 6 5),男,博士,教授,研究方向为药物分析.文章编号:1 0 0 4-4 3 5 3(2 0 2 3)0 2-0 1 7 0-0 5高效液相色谱法定量分析硫醇化合物的研究李航1,林志豪1,金彪2,金东日1(1.延边大学 理学院,吉林 延吉 1 3 3 0 0 2;2.延边大学 分析测试中心,吉林 延吉 1 3 3 0 0 2)摘要:利用高效液相色谱(h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y,H P L C)建立了一种柱前衍生化试剂丙烯酸2 甲氧基苯酯定量分析硫醇化合物的方法.丙烯酸2 甲氧基苯酯与半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽进行衍生化反应所得产物的色谱分离条件为:C i c a e a g e n t M i g h t y s i l R P-1 8 G P(1 5 0mm4.6mm,3m)色谱柱,水 乙腈为流动相(含体积分数为0.1%的甲酸),流速为0.3m L/m i n,进样量为3L.测定结果显示,硫醇化合物的线性范围为0.0 51.0mm o l/L,最低检测限为0.0 1mm o l/L(S/N=3).该结果表明使用丙烯酸2 甲氧基苯酯柱前衍生化法可有效检测出L半胱氨酸胶囊中硫醇化合物的含量,因此该方法对检测硫醇化合物含量具有良好的参考价值.关键词:高效液相色谱法;柱前衍生化;硫醇化合物;L半胱氨酸胶囊;丙烯酸2 甲氧基苯酯中图分类号:O 6 5 7.7 文献标识码:AQ u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f t h i o l c o m p o u n d s b y h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h yL I H a n g1,L I N Z h i h a o1,J I N B i a o2,J I N D o n g r i1(1.C o l l e g e o f S c i e n c e,Y a n b i a n U n i v e r s i t y,Y a n j i 1 3 3 0 0 2,C h i n a;2.A n a l y s i s a n d T e s t i n g C e n t e r,Y a n b i a n U n i v e r s i t y,Y a n j i 1 3 3 0 0 2,C h i n a)A b s t r a c t:A p r e-c o l u m n d e r i v a t i z a t i o n r e a g e n t(2 -m e t h o x y p h e n y l a c r y l a t e)w a s d e v e l o p e d f o r t h e q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f t h i o l c o m p o u n d s b y h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y.T h e c h r o m a t o g r a p h i c s e p a r a t i o n c o n-d i t i o n s o f 2 -m e t h o x y p h e n y l a c r y l a t e w i t h c y s t e i n e,h o m o c y s t e i n e a n d g l u t a t h i o n e d e r i v a t i v e s a r e a s f o l l o w s:C i c a e a g e n t M i g h t y s i l R P-1 8G P(1 5 0mm4.6mm,3m)c o l u m n,w a t e r-a c e t o n i t r i l e i s t h e m o b i l e p h a s e(c o n t a i n i n g 0.1%f o r m i c a c i d b y v o l u m e),w i t h a f l o w r a t e o f 0.3m L/m i n a n d a n i n j e c t i o n v o l u m e o f 3L.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e l i n e a r r a n g e o f t h i o l c o m p o u n d s w a s 0.0 5-1.0mm o l/L a n d t h e l o w e s t d e t e c t i o n l i m i t w a s 0.0 1mm o l/L(S/N=3),a n d t h e c o n t e n t o f t h i o l c o m p o u n d s i n L-c y s t e i n e c a p s u l e s c o u l d b e e f f e c t i v e l y d e t e c t e d.T h e r e f o r e,t h e p r o p o s e d m e t h o d e x h i b i t g o o d r e f e r e n c e v a l u e f o r t h e d e t e c t i o n o f t h i o l c o m p o u n d c o n t e n t.K e y w o r d s:h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y;p r e-c o l u m n d e r i v a t i z a t i o n;t h i o l c o m p o u n d;L-c y s t e i n e c a p s u l e s;2 -m e t h o x y p h e n y l a c r y l a t e 小分子硫醇是生物体内多种蛋白质的重要组成部分,它主要包括半胱氨酸(C y s)、高半胱氨酸(H c y)以及谷胱甘肽(G S H).研究显示这3种硫醇化合物均具有较强的抗氧化性,在生物体内不 第2期李航,等:高效液相色谱法定量分析硫醇化合物的研究仅参与许多重要的生理反应,而且还能够有效清除体内所产生的过剩自由基,以及维持细胞压的动态平衡1.另外研究还显示,C y s、H c y和G S H在细胞内的含量变化与体内的多种疾病密切相关.例如:当人体内的C y s含量过多或过少时都会引起儿童生长缓慢、肝脏损害、肌肉松弛和身体肥胖等疾病2-4.健康成年人体内血清中的H c y超过1 5m o l/L(正常水平在91 3m o l/L)时,不仅会造成先天性缺陷和认知功能障碍,还会引起心血管疾病、阿尔茨海默病等5-7.G S H的含量对细胞的生长、代谢以及对癌症患者放化疗的耐药性等均有显著影响8.因此,对C y s、H c y和G S H等小分子硫醇进行快速、灵敏、精准的检测可有助于阐明疾病的发生和发展机制,并为预防和治疗疾病提供新的思路.目前检测硫醇化合物的常见方法有H P L C法9、毛细管电泳法1 0、电化学分析法1 1、红外光谱法1 2、紫外 可见光谱法1 3和荧光光谱法1 4等方法.由于H P L C法具有分析速度快、检测灵敏度高和样品用量少等优点,以及丙烯基可与硫醇化合物的巯基发生M i c h a e l加成反应1 5,因此本文利用H P L C法建立了一种柱前衍生化定量分析硫醇化合物的方法.实验表明,该方法可有效测定L半胱氨酸胶囊中半胱氨酸的含量.1 实验部分1.1 实验仪器先行者C P 1 1 4电子分析天平,奥豪斯仪器上海有限公司;T G L-1 5 B离心机,上海安亭科学仪器厂;6 7 9 4-4 2 0 D磁力加热搅拌器,C O R N I NG公司;XW-8 0 A旋涡混合器,上海驰唐电子有限公司;H B-1 0 0恒温金属浴,杭州大和热磁电子有限公司;S P D-1 6高效液相色谱仪,日本岛津公司;AV-A s c e n d 5 0 0 HD超导傅里叶核磁共振谱仪,B RUK E R公司;N-1 0 0旋转蒸发仪,上海爱朗仪器有限公司.1.2 实验试剂2甲氧基苯酚(分析纯)、丙烯酰氯(分析纯)、氘代氯仿,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;碳酸氢钠(分析纯),国药集团化学试剂有限公司;乙腈(分析纯),天津市大茂化学试剂厂;二氯甲烷(分析纯)、甲醇(分析纯),天津市富宇精细化工有限公司;甲酸(色谱级)、三乙胺(分析纯)、无水硫酸镁(分析纯),天津市科密欧化学试剂有限公司;L半胱氨酸,上海吉尔生化有限公司;乙腈(L C-M S级)、高半胱氨酸、谷胱甘肽,北京伊诺凯试剂有限公司;舒邦L半胱氨酸胶囊,湖北舒邦药业有限公司;超纯水,采用K e r t o n e L a b M I N I-D仪自制.1.3 衍生化试剂丙烯酸2 甲氧基苯酯的合成按照文献1 6 中的方法合成衍生化试剂丙烯酸2 甲氧基苯酯.将邻甲氧基苯酚(0.6 2g,5mm o l)、二氯甲烷(1 2.5m L)、三乙胺(0.7 5m L)置于冰水浴中的圆底烧瓶中,然后在搅拌下缓慢滴加入含有0.5m L丙烯酰氯的2.5m L二氯甲烷,室温下反应过夜;反应液用饱和碳酸氢钠溶液洗涤3次,并水洗3次;用无水硫酸镁将反应液干燥后再旋转蒸发掉溶剂,得0.5 6 3 2g淡黄色油状液体,收率为6 3.2%.1H NMR(5 0 0MH z,C D C l3):7.2 57.1 8(m,1 H),7.0 8(d d,J=7.9,1.6H z,1 H),7.0 16.9 3(m,2 H),6.6 2(d d,J=1 7.3,1.3H z,1 H),6.3 6(d d,J=1 7.3,1 0.5H z,1 H),6.0 1(d d,J=1 0.5,1.3H z,1 H),3.8 3(s,3 H);1 3C NMR(1 2 5MH z,C D C l3):1 6 4.1,1 5 1.2,1 3 9.6,1 3 2.4,1 2 7.6,1 2 6.9,1 2 2.8,1 2 0.8,1 1 2.5,5 5.9;MA L D I-TO F-M S,m/zM+N a+:2 0 1.1.4 溶液的配制衍生化试剂:首先,准确称取丙烯酸2 甲氧基苯酯8 9.1m g(0.5mm o l),加入乙腈溶液后将其配制成浓度为5 0mm o l/L的储备液;然后,再将配 制 的 储 备 液 依 次 稀 释 为2 5、2 0、1 0、5、1mm o l/L的储备液.标准 对 照 溶 液:分 别 配 置1 0 mm o l/L的C y s、H c y、G S H混合标准品储备液.将3种硫醇化合物用乙腈 水(体积比为2 27 8)混合标准品溶液稀释成为1mm o l/L.供试品溶液:取L半胱氨酸胶囊1粒(0.4 0g/粒),将内容物倾出后研磨成细粉;细粉装入离心管后加入适量乙腈 水(体积比为2 27 8),超声并离心1 0m i n(7 0 0 0r/m i n),并取其上清液将其配制成浓度为0.5mm o l/L的溶液.171延边大学学报(自然科学版)第4 9卷 1.5 衍生化反应分别将2 0mm o l/L的丙烯酸2 甲氧基苯酯(2 0L)和1mm o l/L的C y s、H c y、G S H混合溶液(2 0L)加入到1.5m L聚丙烯离心管中,用漩涡混合器振荡1m i n后将其放入到恒温金属浴(5 5)中反应2 h.反应结束后,取反应液3L进行H P L C检测.1.6 色谱条件色谱柱为M i g h t s i l R P-1 8G P(1 5 0mm4.6mm,3m);流动相A为水溶液(含体积分数为0.1%的甲酸),流动相B为乙腈(含体积分数为0.1%的甲酸);有机相的体积分数为2 6%;流速为0.3m L/m i n;柱温为2 5;UV检测器波长为2 7 0n m;进样量为3L.2 结果与分析2.1 丙烯酸2 甲氧基苯酯的结构确认邻甲氧基苯酚与丙烯酰氯发生反应生成的丙烯酸2 甲氧基苯酯的色谱图如图1所示.由图1可以看出,丙烯酸2 甲氧基苯酯的质量分数为9 5%.进一步综合衍生化试剂的核磁共振氢谱、碳谱和基质辅助飞行时间质谱可知,反应所得的目标产物为丙烯酸2 甲氧基苯酯.图1 丙烯酸2 甲氧基苯酯的液相色谱图2.2 丙烯酸2 甲氧基苯酯与含硫醇化合物发生衍生化反应的条件为探讨最佳的衍生化反应条件,分别从反应温度、时间、摩尔比对其进行分析.2.2.1 反应温度对衍生化反应的影响在2 5、4 5、5 5、6 5、7 5下将C y s、H c y、G S H混合溶液与衍生化试剂进行反应.反应完成后,分别取少量反应液进行H P L C分析.以反应温度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制的衍生化产物的峰面积随反应温度变化的曲线如图2所示.由图2可知,反应温度在2 55 5时,衍生化产物的峰面积随反应温度的升高而增加;当反应温度高于5 5时,其变化趋势逐渐保持平稳:因此,本文将最佳反应温度确定为5 5.图2 反应温度对衍生化反应的影响2.2.2 反应时间对衍生化反应的影响将C y s、H c y、G S H混合溶液与衍生化试剂分别反应1 0、3 0、6 0、1 2 0、1 8 0m i n.反应完成后,取少量反应液进行H P L C分析.以反应时间为横坐标、峰面积为纵坐标绘制的衍生化产物的峰面积随反应时间变化的曲线如图3所示.由图3可知,当反应时间在1 01 2 0m i n时,衍生化产物的峰面积随反应时间的增加而增加,当反应时间大于1 2 0m i n时,其变化趋势逐渐保持平稳:因此,本文将最佳反应时间确定为1 2 0m i n.图3 反应时间对衍生化反应的影响2.2.3 反应摩尔比对衍生化反应的影响将C y s、H c y、G S H混合溶液与衍生化试剂分别在摩尔比为11、15、11 0、12 0、12 5下进行反应.反应完成后,取少量反应液进行H P L C分析.以反应摩尔比为横坐标、峰面积为纵坐标绘制的衍生化产物的峰面积随反应摩尔比的变化曲线如图4所示.由图4可以看出,当反应摩尔比在小于2 0范围内时,衍生化产物的峰面积随反应摩271 第2期李航,等:高效液相色谱法定量分析硫醇化合物的研究尔比的增加而增加,当反应摩尔比大于2 0时,其变化趋势逐渐保持平稳:因此,本文将最佳反应摩尔比确定为12 0.图4 反应摩尔比对衍生化反应的影响2.3 色谱条件的选择为了完全分离3种物质(丙烯酸2 甲氧基苯酯分别与C y s、H c y、G S H进行反应所得的衍生化产物),本文利用不同流动相比(流动相A与B的体积比分别为4 85 2、5 84 2、6 83 2、7 42 6、7 72 3)进行分离,其中流动相A为水溶液(含体积分数为0.1%的甲酸),流动相B为乙腈(含体积分数为0.1%的甲酸).不同流动相比例下3种物质的保留时间变化如图5所示.由图5可知,当流动相B的体积分数为2 6%时,3种衍生化产物的峰的保留时间分别为1 1、1 3、1 5m i n.当流动相A与B的体积比为7 42 6时,3种物质的H P L C图如图6所示.由图6可以看出,该条件下可快速洗脱和完全分离3种产物.图5 3种产物的峰的保留时间随流动相B体积分数的变化趋势图6 丙烯酸2 甲氧基苯酯与C y s、G S H、H c y分别反应所得衍生物的液相色谱图2.4 线性关系及最低检测限按1.5中衍生化方法将丙烯酸2 甲氧基苯酯分别与1.0、0.5、0.2、0.1、0.0 5mm o l/L的C y s、H c y、G S H标准品混合液进行衍生化反应.反应完成后,取少量反应液进行H P L C分析.以C y s、H c y、G S H标准品溶液浓度为横坐标、衍生化产物的峰面积为纵坐标建立的线性方程及相关系数和最低检测限见表1.2.5 胶囊样品含量的测定由于实际样品中的其他掺杂物质可能会消耗衍生化试剂,因此本文采用过量的衍生化试剂进行反应:在5 5的恒温金属浴条件下,将0.5mm o l/L的供试品溶液与2 0.0mm o l/L的衍生化试剂反应2h,然后进行H P L C检测.根据表1中C y s的线性方程计算胶囊中的半胱氨酸含量,经计算其含量为0.0 2g(药品标示成分含量为每1 0 0g含L半胱氨酸1 8.0g).表1 3种硫醇化合物的线性方程、相关系数和最低检测限线性方程相关系数最低检测限/(mm o l/L)C y sy=4 6 5 2 7 6x-8 2 2 9.70.9 9 9 10.0 1H c yy=1 7 7 4 8 5x+2 3 4 0 40.9 7 0 00.0 1G S Hy=3 3 4 5 2 4x+2 4 9 2 60.9 9 0 30.0 1371延边大学学报(自然科学版)第4 9卷 3 结论本文采用柱前衍生化H P L C法对3种硫醇衍生物(以衍生化试剂丙烯酸2 甲氧基苯酯与C y s、H c y、G S H 3种硫醇进行衍生化反应所生成的硫醇衍生物)进行分离检测显示,该方法不仅具有良好的灵敏度(线性范围为0.0 51.0 mm o l/L,最低检测限为0.0 1mm o l/L),而且还具有反应条件温和、操作简单等优点;因此,该方法可为实际生物样品中的硫醇检测提供良好参考.参考文献:1 N I U L Y,GUAN Y S,CHE N Y Z,e t a l.B O D I P Y-b a s e d r a t i o m e t r i c f l u o r e s c e n t s e n s o r f o r h i g h l y s e l e c t i v e d e t e c t i o n o f g l u t a t h i o n e o v e r c y s t e i n e a n d h o m o c y s t e i n eJ.J o u r n a l o f t h e Am e r i c a n C h e m i c a l S o c i e t y,2 0 1 2,1 3 4:1 8 9 2 8-1 8 9 3 1.2 CHE N D G,Z HON G C,Z HAO Y,e t a l.A t w o-d i m e n s i o n a l m o l e c u l e w i t h a l a r g e c o n j u g a t i o n d e-g r e e:s y n t h e s i s,t w o-p h o t o n a b s o r p t i o n a n d c h a r g e t r a n s p o r t a b i l i t yJ.J o u r n a l o f M a t e r i a l s C h e m i s t r y C,2 0 1 7,5:5 1 9 9-5 2 0 6.3 L I D P,Z HAN G J F,C U I J,e t a l.A r a t i o m e t r i c f l u o r e s c e n t p r o b e f o r f a s t d e t e c t i o n o f h y d r o g e n s u l-f i d e a n d r e c o g n i t i o n o f b i o l o g i c a l t h i o l sJ.S e n s o r s&A c t u a t o r s:B C h e m i c a l,2 0 1 6,2 3 4:2 3 1-2 3 8.4 Z HANG Y D,WANG X,B A I X Y,e t a l.H i g h l y s p e c i f i c C y s f l u o r e s c e n c e p r o b e f o r l i v i n g m o u s e b r a i n i m a g i n g v i a e v a d i n g r e a c t i o n w i t h o t h e r b i o t h i-o l sJ.A n a l y t i c a l C h e m i s t r y,2 0 1 9,9 1(1 3):8 5 9 1-8 5 9 4.5 CHAO J B,L I M,L I U Y M,e t a l.F l u o r e s c e n c e d e t e c t i o n a n d i m a g i n g i n z e b r a f i s h a n d A r a b i d o p s i s t h a l i a n a b a s e d o n C y s/H c y b r e a k i n g s p a c e e f f e c tJ.S e n s o r s a n d A c t u a t o r s:B C h e m i c a l,2 0 1 9,2 9 8:1 2 6 8 4 4.6 HUAN G Y H,ME I J,MA X.A n o v e l s i m p l e r e d e m i t t e r c h a r a c t e r i z e d w i t h A I E p l u s i n t r a m o l e c u l a r c h a r g e t r a n s f e r e f f e c t s a n d i t s a p p l i c a t i o n f o r t h i o l-c o n t a i n i n g a m i n o a c i d s d e t e c t i o nJ.D y e s a n d P i g m e n t s,2 0 1 9,1 6 5:4 9 9-5 0 7.7 CHE N H,TAN G Y H,L I N W Y.R e c e n t p r o g r e s s i n t h e f l u o r e s c e n t p r o b e s f o r t h e s p e c i f i c i m a g i n g o f s m a l l m o l e c u l a r w e i g h t t h i o l s i n l i v i n g c e l l sJ.T r e n d s i n A n a l y t i c a l C h e m i s t r y,2 0 1 6,7 6:1 6 6-1 8 1.8 陈莉,黎俊波,陈杜刚.生物硫醇荧光探针的研究进展J.有机化学,2 0 2 1,4 1(2):6 1 1-6 2 3.9 N I A N N,HA D J MOHAMMA D I M R.T h e a p p l i-c a t i o n o f t h r e e-p h a s e s o l v e n t b a r m i c r o e x t r a c t i o n b a s e d o n a d e e p e u t e c t i c s o l v e n t c o u p l e d w i t h h i g h-p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y f o r t h e d e t e r m i-n a t i o n o f f l a v o n o i d s f r o m v e g e t a b l e a n d f r u i t j u i c e s a m p l e sJ.A n a l y t i c a l M e t h o d s,2 0 1 9,1 1:5 1 3 4-5 1 4 1.1 0 Z HAN G Y,Z HAN G Y T,Z HU L Q,e t a l.H i g h s e n s i t i v i t y d e t e c t i o n o f e s c h e r i c h i a c o l i b a s e d o n t h e m e a s u r e m e n t o f-g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y b y m i c r o-c h i p c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s c o m b i n e d w i t h f i e l d-a m p l i f i e d s a m p l e i n j e c t i o nJ.A n a l y t i c a l M e t h o d s,2 0 1 9,1 1:1 5 5 8-1 5 6 5.1 1 Z HAN G Y N,N I U Q Y,GU X T,e t a l.R e c e n t p r o g r e s s o n c a r b o n n a n o m a t e r i a l s f o r t h e e l e c t r o-c h e m i c a l d e t e c t i o n a n d r e m o v a l o f e n v i r o n m e n t a l p o l l u t a n t sJ.N a n o s c a l e,2 0 1 9,1 1(2 5):1 1 9 9 2-1 2 0 1 4.1 2 HAG EMANN L T,MC C A R TN E Y M M,F UN G A G,e t a l.P o r t a b l e c o m b i n a t i o n o f F o u r i e r t r a n s-f o r m i n f r a r e d s p e c t r o s c o p y a n d d i f f e r e n t i a l m o b i l i-t y s p e c t r o m e t r y f o r a d v a n c e d v a p o r p h a s e a n a l y s i sJ.A n a l y s t,2 0 1 8,1 4 3(2 3):5 6 8 3-5 6 9 1.1 3 J I AN G T,WAN G X,WAN G G,e t a l.L i g h t-a c t i v a t e d“c y c l e-r e v e r s i b l e i n t r a m o l e c u l a r c h a r g e t r a n s f e r”f l u o r e s c e n t p r o b e:m o n i t o r i n g o f p H i t r a c e c h a n g e i n d u c e d b y UV l i g h t i n p r o g r a mm e d c e l l d e a t hJ.C h e m i c a l C o mm u n i c a t i o n s,2 0 1 9,5 5(3 6):5 2 7 9-5 2 8 2.1 4 L I R R,HUAN G X Y,L U G L,e t a l.A f l u o r e s-c e n c e a n d UV/v i s a b s o r p t i o n d u a l-s i g n a l i n g p r o b e w i t h a g g r e g a t i o n-i n d u c e d e m i s s i o n c h a r a c t e r i s t i c s f o r s p e c i f i c d e t e c t i o n o f c y s t e i n eJ.R S C A d-v a n c e s,2 0 1 8,8:2 4 3 4 6-2 4 3 5 4.1 5 L I H D,J I N L Y,KAN Y H,e t a l.A v i s u a l a n d“t u r n-o n”f l u o r e s c e n t p r o b e f o r r a p i d d e t e c t i o n o f c y s t e i n e o v e r h o m o c y s t e i n e a n d g l u t a t h i o n eJ.S e n s o r s a n d A c t u a t o r s B:C h e m i c a l,2 0 1 4,1 9 6:5 4 6-5 5 4.1 6 金彪,张敬东,王思宏.2氨基3(3(苄氧基)3氧代 丙 基)硫代 丙 酸 的 合 成 J.化 学 试 剂,2 0 1 8,4 0(1 0):1 0 0 2-1 0 0 4.471