镉胁迫下构树qRT-PCR内参基因筛选及验证.pdf

DOI:10.12403/j.1001-1498.20220500镉胁迫下构树 qRT-PCR 内参基因筛选及验证李红英1，陈萌笛1，王政博1，郝自远1，刘龙昌1，赵西平1，倪建伟2*(1.河南科技大学园艺与植物保护学院，河南洛阳471000；2.国家林业和草原局国家公园（自然保护地）发展中心，北京100714)摘要：目的 筛选出镉（Cd）胁迫下构树中稳定表达的内参基因，为后续开展构树耐 Cd 的分子机理研究奠定基础。方法 以 Cd 胁迫下构树的根和叶组织为材料，通过实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）检测 10 个候选基因（BpUBE2、BpRPL8、BpActin、BpGAPDH、BpHSP、BpTUA、BpDOUB、Bp-TUB、BpHIS、BpNADH）的表达情况，利用 geNorm、NormFinder、BestKeeper 和 RefFinder 分析软件对候选内参基因的表达稳定性进行综合评估，并通过逆境胁迫响应基因 BpDREB 验证筛选出的内参基因的稳定性。结果 BpDOUB 和 BpNADH 在 Cd 胁迫下构树中基因表达相对稳定，BpGAPDH 表达稳定性最差。以 Bp-DREB 验证内参稳定性时发现，单独或组合使用 BpDOUB 及 BpNADH 为内参基因时，BpDREB 基因表达水平显示出相似的趋势，而稳定性较差的 BpGAPDH 基因未能对 BpDREB 的表达量进行准确校正。结论 Bp-DOUB、BpNADH 基因以及 BpDOUB+BpNADH 基因组合均可作为合适的内参基因，提高 Cd 胁迫下构树相关基因表达分析的可靠性。关键词：构树；内参基因；Cd 胁迫；荧光定量 PCR中图分类号：S718.46文献标识码：A文章编号：1001-1498(2023)04-0129-10构树（Broussonetia papyrifera（L.）Vent.）为桑科（Moraceae）构属（Broussonetia）落叶乔木，自然分布于我国大部分地区和东南亚，是一种典型的乡土树种和先锋植物。其表型性状和遗传多样性丰富，基因组紧凑，常作为木本植物研究的模式材料。因其易繁殖、抗逆性强、生长速度快等优点1，被广泛应用于饲料、造纸和植被恢复等领域。此外，构树还具有药用价值，其类黄酮、多酚、果糖等含量远高于其它植物2-3，构树中的黄酮衍生物对癌细胞有抑制作用4，多酚类物质可以抑制冠状病毒蛋白酶5。近年来，有研究证明，构树对重金属 Cd 有一定的富集和转运能力6，因此，被认为是重金属污染区群落恢复的先锋树种7，其主要通过诱导或增强相关 Cd 抗性基因表达，合成功能性基因来应对 Cd 胁迫8。因此，了解关键基因的表达方式将有助于阐明构树 Cd 胁迫中所涉及的分子机制。实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）因其方便快捷、强特异性和高灵敏度等优势，已成为研究基因转录水平表达量的有效手段。然而，RNA 质量、cDNA 质量、样品稀释倍数以及实验操作准确度等因素都会影响 qRT-PCR 的准确性9，因此，引入适宜的内参基因，对目的基因表达量标准化分析至关重要10。理想的内参基因是能够在细胞中稳定表达、表达量几乎不受外界环境干扰的基因，一般为维持细胞基本生命活动的管家基因（Housekeeper收稿日期：2022-10-25修回日期：2023-03-17基金项目：国家自然科学基金(32171701)；国家自然科学基金(31600552)；河南科技大学博士科研启动基金(13480076)；河南科技大学实验技术开发基金项目(SY2122014)作者简介:李红英，博士，讲师。主要研究方向：农林植物发育相关基因鉴定和调控机理研究。Email：*通讯作者:倪建伟，博士，副研究员。主要研究方向：树木生理代谢、国家公园建设等研究。Email:林业科学研究2023，36（4）：129-138Forest Researchhttp:/gene），如肌动蛋白基因（Actin）、18S 核糖体RNA（18S Ribosome RNA）、微 管 蛋 白 基 因（Tublin）和泛素蛋白基因（Ubiquitin）等；但近年来大量研究证明，随着物种以及组织器官的差异，管家基因的转录水平有可能会发生变化，如在羊草（Leymus chinensis（Trin.）Tzvel.）叶片、茎部以及穗中表达稳定性较高的内参基因分别是Actin、EF-1 和 18S rRNA，而根部表达较为稳定的是 APRT、18S rRNA11。茉莉花（Jasminumsambac（L.）Aiton.）在不同的发育时期以及不同组织中筛选出的最适内参基因也不同12。此外，同一植物在不同的环境下内参基因稳定性之间也存在差异，如海州常山（Clerodendrum trichotomumThunb.）内参基因 RPL、AP-2 基因在盐胁迫下表达最稳定，干旱胁迫下 MDH、AP-2 基因表达最稳定，而热胁迫下 UBCE2 和 ACT 表达最稳定13。这说明管家基因只能在特定的组织或处理方式中保持相对稳定，因此，应根据特定的试验条件来选择适合的内参基因，减少试验误差14。本研究以 Cd 胁迫下构树的根和叶为试验材料，根据构树转录组数据选取了 10 个候选内参基因，并通过 qRT-PCR 技术,结合基因稳定性分析软件 geNorm15、NormFinder16、BestKeeper17和 RefFinder18在线分析工具，对 10 个候选内参基因在构树 Cd 胁迫下根和叶片中的表达稳定性进行评估，筛选出表达相对稳定的内参基因，并利用构树逆境胁迫关键基因 BpDREB19进一步验证上述结果的可靠性，为后续开展构树 Cd 胁迫响应基因的功能研究奠定基础。1材料与方法1.1实验材料构树种子购自江苏宿迁天桥区映阳苗木经营部，将种子用 1600mgL1的 GA3 溶液浸泡 24h，蒸馏水冲洗 23 次后播种于草炭土和蛭石混合基质中，置于光照培养箱中（温度 30，湿度60%，光照 12h/黑暗 12h）培养。培养 6 个月后，选取长势良好、大小一致的构树幼苗，参照Xu 等7实验设计并稍作调整，将幼苗小心剥离营养基质后置于 1/2 霍格兰营养液中缓苗 1 周，每3d 更换 1 次，之后加入 400molL1CdCl2进行模拟 Cd 胁迫处理，分别在处理后 0（CK）、3、6、12、24、48、72、96、120h 取其根部与叶片，液氮速冻后放置于80 保存，每个取样时间点均取 3 个重复。1.2实验方法1.2.1总 RNA 提取和 cDNA 第一链合成利用Trizol 法（北京聚合美，MF034）提取 RNA，用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的完整性，使用超微量紫外分光光度计（NanoDrop2000）检测RNA 浓 度 和 纯 度。利 用 M5 Super qPCR RTKit（北京聚合美，MF012）完成 cDNA 第一链合成，置于20 保存备用。1.2.2引物设计根据构树转录组序列，对选定的10 个候选内参基因BpUBE2、BpRPL8、BpActin、BpGAPDH、BpHSP、BpTUA、BpDOUB、Bp-TUB、BpHIS、BpNADH 使用Primer3web（V4.1.0,http:/primer3.ut.ee/）设计引物，并利用 Blast 工具检测引物特异性。引物序列、扩增产物长度和Tm值等详见表 1，引物由通用生物（安徽）股份有限公司合成。1.2.3 qRT-PCR 反 应 条 件 qRT-PCR 采 用SYBRGreen 染料法，按照 2M5HiPerSYBRPremixEsTaq 试剂盒（北京聚合美，MF787）说明书配制 PCR 反应体系为：cDNA 模板 1L，正反向引物(10molL1)各 0.2L，2M5HiPerSYBRPremixEsTaq5L，用 ddH2O 补至 10L。每个样品均设置 3 个重复，利用伯乐公司的 CFX96实时荧光定量PCR 仪对样品进行扩增。PCR 反应程序：95 预变性 30s；95 变性 5s，60退火30s，39 个循环，熔解曲线：以65 到95，每个循环增加 0.5，持续 0.05s 获得解链温度，采集荧光信号。1.2.4引物特异性及扩增效率检测将 cDNA 样本等量混合后用 ddH2O 稀释 1 倍作为模板进行普通 PCR 扩增，用于检测引物的特异性。反应体系为：14.3LddH2O，2L10PCRBuffer，1.6LdNTP（2.5mmolL1），0.1LrTaq（5UL1），cDNA1.5L，上下游引物（10molL1）各0.25L。反应程序为 952min；9810s，6030s，7230s，30 个循环，725min，反应结束后用 2%的琼脂糖凝胶进行引物特异性检测。将 Cd 胁迫下所有样本的 cDNA 取适量等量混合后稀释成6 个梯度（1/3、1/9、1/27、1/81、1/243、1/729），并以此为模板进行 qPCR 扩增，用于标准曲线的绘制，并利用公式E=(31/slope1)130林业科学研究第36卷100%计算引物扩增效率。反应体系和程序如1.2.3 所述。1.2.5候选内参基因稳定性分析通过荧光定量PCR 得出 10 个候选基因在 Cd 胁迫下构树不同组织中的 CT值，使用 MicrosoftExcel2016 软件整理原始 CT值，并分别采用基于 MicrosoftExcel2010 的 3 个 基 因 稳 定 性 评 价 软 件（geNorm、NormFinder、BestKeeper）和 在 线 分 析 工 具RefFinder（https:/ 个候选内参基因的稳定性进行综合评价，筛选出构树在 Cd 胁迫下的最佳内参基因。1.2.6内参基因稳定性验证选择构树逆境胁迫响应基因 BpDREB 用于验证筛选出的内参基因的稳定性。以 Cd 胁迫下构树的 cDNA 为模板，使用荧光定量 PCR 技术，以最佳候选基因及其组合作为标准化因子，以不稳定的内参基因作为比较，使用 2CT法分析 BpDREB 基因在构树根部和叶片中的相对表达量，实验设置 3 个重复，反应体系和程序如 1.2.3 所述。2结果与分析2.1RNA 质量检测RNA 样品浓度为 160287ngL1，A260/280的值为 2.02.2，这表明 RNA 无蛋白或酚类污染，纯度较高。琼脂糖凝胶电泳结果（图 1）显示：各样本的 RNA 主带清晰，无弥散拖尾现象，且 28SrRNA 条带的亮度约为 18SrRNA 条带的2 倍，这表明 RNA 无明显降解，完整性良好，可用于后续实验。2.2引物特异性及扩增效率检测以 Cd 胁迫下构树根和叶等量混合的 cDNA 为模板进行常规 PCR 扩增，结果（图 2）表明：所表1构树 10 个候选内参基因的引物序列及扩增效率Table1Primersequencesandamplificationefficiencyof10candidatereferencegenesinB.papyrifera基因名称Genesymbol引物序列(5-3)Primersequences(5-3)退火温度Tm/扩增产物长度AmplificationLength/bp扩增效率AmplificationEfficiency/%相关系数R2BpUBE2BpUBE2-F:AGGTTCGCTTCCTCACCAAAA52.4154102.810.995BpUBE2-R:TCATCAGGGTTTGGAGCACTC54.4BpRPL8BpRPL8-F:TGATCACCGACATCATCCACG54.418590.550.992BpRPL8-R:TCTGATCGGAAGGACATTGCC54.4BpActinBpActin-F:TCCTCCTCAACTCTCCTCCTG56.319393.430.990BpActin-R:TTGCCCAGCTCTCCAAATGAT52.4BpGAPDHBpGAPDH-F:CCATGGAAGGACTTGGGGATC56.315690.430.995BpGAPDH-R:GTTCACTCCCACCACGTATGT54.4BpHSPBpHSP-F:CCAGCGCTGATGTTAGATTGC54.417492.660.993BpHSP-R:TTGCCATCAGAGCCTTTTCCT52.4BpTUABpTUA-F:TCGAAAGGCCAACATACACCA52.417596.590.997BpTUA-R:GAGATGACAGGGGCATACGAG56.3BpDOUBBpDOUB-F:CCTGATCTTCGCCGGAAAACA54.419497.480.999BpDOUB-R:TGGAGAGGGTTGAAGAGAGCT54.4Bp-TUBBp-TUB-F:CGGAACTGACGCAACAAATGT52.411893.570.994Bp-TUB-R:ACCTCCTTCGTGCTCATCTTG54.4BpHISBpHIS-F:GTCTTGGAGCTGGCTGGTAAT54.4129102.210.993BpHIS-R:ACCACCGGCTATTGTTCCTTT52.4BpNADHBpNADH-F:TCCTTTGAATTCTCCGCCCAA52.419197.180.987BpNADH-R:GAAGCCCGTGAACTTGAAACC54.4BpDREBBpDREB-F:TAAACCAGCTCACCCAATCCC54.427490.990.989BpDREB-R:CGGTTCTTGGGGAGTCTGATC56.3第4期李红英，等：镉胁迫下构树 qRT-PCR 内参基因筛选及验证131有引物目标片段单一明亮，无引物二聚体及非特异性扩增现象，且条带大小与预期相符。进一步利用 qRT-PCR 技术验证引物特异性，结果（图 3）表明：各候选内参基因的溶解曲线均呈单一溶解峰，说明所用引物都能进行特异性扩增。经计算，各候选内参基因扩增效率（E）为 90.43%102.81%，相关系数（R2）为 0.9870.999（表 1）。以上结果表明，各候选基因特异性和扩增效率良好，可用于后续实验。2.3内参基因稳定性分析2.3.1内参基因 CT值分析CT值与基因表达量呈反比，CT值越低基因表达水平越高。通过对箱线图（图 4）进行分析可知：大部分基因 CT值分布在 2128 之间，表达丰度适中。此外，由箱线图跨度可初步判定 BpGAPDH（21.5932.58）的 CT值 跨 度 广，基 因 表 达 稳 定 性 较 弱，而BpNADH（25.8627.36)）、BpDOUB（23.0925.12）、BpUBE2（21.7823.67）的 CT值跨度小，基因表达较稳定。以上结果表明，构树中不同内参基因在 Cd 胁迫下具有不同的表达水平，从 CT值变化跨度推测 BpNADH、BpDOUB 和 BpUBE2表达量较稳定，是潜在的最佳候选内参基因。2.3.2geNorm 分析通过 geNorm 软件计算各候选内参基因在构树 Cd 胁迫下不同组织中表达稳定性的 M 值，该软件是以M=1.5 为临界值，M 值越小，则内参基因的稳定性越高20。geNorm 分析结果（图 5A）表明：在 Cd 胁迫下构树各候选内参基因 M 值均低于 1.5，即各候选内参基因表达都相对稳定，稳定性排序从高到低依次为 BpDOUB（0.35）=BpUBE2（0.35）BpNADH（0.399）BpHIS（0.443）BpActin（0.501）BpTUA（0.535）BpHSP（0.567）BpRPL8（0.666）Bp-TUB（0.776）BpGAPDH（1.416）。为确定内参基因的最佳数量，使用配对变异系M1234567891011121314151617182 000 bp1 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp28 S18 S注：M:DL2000DNAMarker,19:CdCl2胁迫下构树 0、3、6、12、24、48、72、96、120h 的叶片;1018:CdCl2胁迫下构树 0、3、6、12、24、48、72、96、120h 的根部。Notes:M:DL2000DNAMarker,19：LeavesofB.papyrifera undercadmiumstressat0，3，6，12，24，48，72，96，120h;1018:Rootsof B.papyriferaundercadmiumstressat0，3，6，12，24，48，72，96，120h.图1构树 Cd 胁迫下叶片与根部总 RNA 电泳图Fig.1ElectrophoresisoftotalRNAfromleavesandrootsundercadmiumstressinB.papyriferaMBpUBE2 BpRPL8BpActin BpGAPDH BpHSPBpTUABpDOUB Bp-TUBBpHISBpNADH2 000 bp1 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp图2构树候选内参基因常规 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳Fig.2AgarosegelelectrophoresisofconventionalPCRproductsofcandidatereferencegenesofB.papyrifera132林业科学研究第36卷数Vn/（n+1）对 10 个候选内参基因进行分析，Vn/（n+1）的临界值为 0.15，当 Vn/（n+1）0.15时，说明选择 n 个基因作为内参基因即可保证结果稳定可靠。由图 5B 可知：本实验所有样品的V2/3BpNADH（0.208）BpActin（0.214）BpHIS（0.287）BpUBE2（0.324）BpTUA（0.328）BpHSP（0.740）Bp-TUB（0.815）BpRPL8（1.246）BpGAPDH（3.947），即 在 Cd 胁 迫 下 构 树 中 BpDOUB（0.175）和 BpNADH（0.208）表达稳定性较高，而 BpGAPDH（3.947）的稳定性最低，不适合作为内参基因使用。65707580859095Temperature,Celsius65707580859095Temperature,CelsiusMpelt peakMpelt peakBpUBE2050100150200250300350d(RFU)/dT65707580859095Temperature,CelsiusMpelt peakBpGAPDH050100150d(RFU)/dT65707580859095Temperature,CelsiusMpelt peakBpDOUB050100150200d(RFU)/dT65707580859095Temperature,CelsiusMpelt peakBp-TUB050100150d(RFU)/dT65707580859095Temperature,CelsiusMpelt peakBpNADH050100150d(RFU)/dT65707580859095Temperature,CelsiusMpelt peakBpHIS050100200250300150d(RFU)/dT65707580859095Temperature,CelsiusMpelt peakBpHSP050100200150d(RFU)/dT65707580859095Temperature,CelsiusMpelt peakBpTUA050100200250150d(RFU)/dT050100150200d(RFU)/dTBpRPL865707580859095Temperature,CelsiusMpelt peak050100150250200d(RFU)/dTBpActin200图3构树 10 个候选内参基因溶解曲线图Fig.3Meltingcurvesofthe10candidatereferencegenesofB.papyriferaBpUBE2BpRPL8BpActinBpGAPDHBpHSPBpTUABpDOUBBp-TUBBpHISBpNADH2022242628303234CT 值CT Value图4构树 10 个候选内参基因 CT值箱线图Fig.4BoxplotoftheCTvaluesof10candidatereferencegenesofB.papyrifera第4期李红英，等：镉胁迫下构树 qRT-PCR 内参基因筛选及验证133BpUBE2BpRPL8BpActinBpGAPDHBpHSPBpTUABpDOUBBp-TUBBpHISBpNADH00.51.01.52.02.53.03.54.0表达稳定值Expression stability value(S)稳定性低Least stable genes稳定性高Most stable genes图6NormFinder 软件分析构树内参基因表达稳定性Fig.6ExpressionstabilityofthecandidatereferencegenesofB.papyriferacalculatedbyNormFindersoftware2.3.4BestKeeper分析Bestkeeper主要是通过比较各候选内参基因 CT值之间的标准偏差（SD）和变异系数（CV）来评价基因的稳定性22。当 SD 值1.0，不适合作为内参基因，其余 9 个候选基因的 SD 值均BpHIS（0.47）BpUBE2（0.48）BpDOUB（0.55）BpActin（0.61）BpHSP（0.67）BpTUA（0.71）Bp-TUB（0.93）BpRPL8（0.95）BpGAPDH（3.40），其中，BpNADH 的SD 和CV 值最小（SD=0.32，CV=1.19），稳定性最好。2.3.5RefFinder分析为避免单一内参基因评价程序引起结果误差，通过在线分析工具 RefFinder对 3 个软件的基因表达稳定性排序进行几何平均值计算，几何平均值越小，基因的表达稳定性越高。结果（表 3）所示，各基因综合稳定性排序从高到低依次为 BpDOUB（1.41）BpNADH（2.34）BpUBE2（2.59）BpHIS（2.83）BpActin（4.16）BpTUA（6.24）BpHSP（6.74）Bp-TUB（8.24）BpRPL8（8.74）BpGAPDH（10.00）。说 明BpDOUB（1.41）和 BpNADH（2.34）表达稳定性优于其它基因，可作为 Cd 胁迫下构树 qRT-PCR分析首选内参基因，而 BpGAPDH（10.00）基因表达最不稳定，不宜作为 Cd 胁迫下构树的内参基因。2.3.6内参基因稳定性验证为验证筛选出的内参基因可靠性，采用 qRT-PCR 技术对 Cd 胁迫下BpDREB 基因在构树叶片以及根部的表达模式进行研究，使用筛选出的最佳内参基因 BpDOUB、BpNADH 及其组合 BpDOUB+BpNADH 作为标准化因子，以最不稳定的内参基因 BpGAPDH 为表2Bestkeeper 软件分析构树内参基因的表达稳定性和排名Table2AnalysisofexpressionstabilityandrankingofcandidatereferencegenesofB.papyriferabyBestKeepersoftware基因名Genename变异系数CV标准偏差SD排名RankBpNADH1.190.321BpHIS1.980.472BpUBE22.100.483BpDOUB2.320.554BpActin2.270.615BpHSP2.590.676BpTUA3.090.717Bp-TUB3.540.938BpRPL84.000.959BpGAPDH12.853.4010BpUBE2BpRPL8BpActinBpGAPDHBpHSPBpTUABpDOUBBp-TUBBpHISBpNADH00.40.81.21.6平均表达稳定性Average expression stability(M)配对差异值Pairwisc variation(V)稳定性低Least stable genes稳定性高Most stable genesAV2/3V3/4V4/5V5/6V6/7V7/8V8/9V9/1000.050.100.150.200.250.300.350.400.45B图5通过 geNorm 软件分析构树 10 个候选内参基因的平均表达稳定性(A)和最适数目(B)Fig.5Averageexpressionstability(A)andoptimumnumber(B)of10candidatereferencegenesofB.papyriferaanalyzedbygeNormsoftware134林业科学研究第36卷参照，对 BpDREB 基因表达水平进行验证。结果（图 7）表明：使用不同的内参基因得到的BpDREB 表达量之间存在较大差异。分别以稳定性 好 的 BpDOUB、BpNADH 以 及 BpDOUB +BpNADH 作为内参基因时，BpDREB 基因的表达模式一致。总体来看，在 Cd 处理下，构树叶片及根部的 BpDREB表达量均呈上调趋势，叶片中BpDREB 的表达量在96h 达到最高点，根部 72h达到最高点；而用最不稳定的内参基因 BpGAPDH为参照时，会导致完全不同的结果。因此，不合适的内参基因会导致目的基因表达水平偏差，影响实验的准确性，进一步验证了以BpDOUB 和BpNADH作为内参基因的可靠性。361224487296120胁迫时间/h00.51.01.52.02.5相对表达量Relative expresionABpDOUBBpNADHBpDOUB+BpNADHBpGAPDHBpDOUBBpNADHBpDOUB+BpNADHBpGAPDH361224487296120胁迫时间/h0123465789相对表达量Relative expresionB注：A,CdCl2胁迫下构树的叶片;B,CdCl2胁迫下构树的根部Notes:A,theleafofthe B.papyriferaundercadmiumstress;B,theleafofthe B.papyriferaundercadmiumstress图7用BpDREB验证构树 Cd 胁迫下筛选的内参基因的稳定性Fig.7ValidationofthestabilityofreferencegenesscreenedforcadmiumstressinB.papyriferawithBpDREB3讨论土壤重金属污染已成为目前亟待解决的环境问题之一，Cd 是最具威胁的重金属元素，对植物生长和人体健康都造成严重威胁。作为重金属区群落恢复的先锋树种，构树对重金属 Cd 具有极高的富集能力6，研究构树抗逆机制，解析其响应 Cd 的基因表达调控网络，挖掘构树相关抗逆基因，有助于阐明构树 Cd 胁迫适应机制。实时荧光定量 PCR是分析基因表达水平和调控模式的主要手段之一，选择表达稳定的内参基因是准确分析目的基因表达量的前提，以往研究结果表明，内参基因不具有绝对通用性，若不经筛选而以常见管家基因为内参基因，得到的结果精确度大幅度降低，甚至得到错误结果23。以往构树基因表达研究常直接以Actin24-25为内参，可能存在一定误差。近年来，随着构树基因组测序的完成26和构树转录调控水平研究的深入，开展构树内参基因筛选能够为后续功能基因的表达分析提供重要的基础。在非模式植物中，结合植物转录组数据库进行内参基因筛选是有效的方法之一，目前已在杉木（Cunninghamia lanceolata（Lamb.）Hook.）27、麦缘锦楸（Catalpa fargesiiBur.）28、福建柏（Fokienia hodginsii（Dunn）HenryetThomas.）29等多种植物中应用。有研究发现，在甘蓝型油菜（Brassica napusL.）转录组数据库挖掘到的内参基因 UXS3、SAP5、ARFA1E 的表达稳定性优于传统内参基因 Actin730。本研究结合构树转录组数据库，初步选择 10 个常见管家基因作为候选内参表3构树候选内参基因在 RefFinder 中的稳定性排名Table3RankofstabilityofcandidatereferencegenesofB.papyriferainRefFinder方法MethodCd胁迫下构树内参基因稳定性排序Rankingorderundercdcl2treatmentin B.papyrifera(Better-Good-Average)12345678910BestKeeperBpNADHBpHISBpUBE2BpDOUBBpActinBpHSPBpTUABpB-TUBBpRPL8BpGAPDHNormfinderBpDOUBBpNADHBpActinBpHISBpUBE2BpTUABpHSPBpB-TUBBpRPL8BpGAPDHgeNormBpUBE2/BpDOUBBpNADHBpHISBpActinBpTUABpHSPBpRPL8Bp-TUBBpGAPDH推荐综合排名RecommendedcomprehensiverankingBpDOUBBpNADHBpUBE2BpHISBpActinBpTUABpHSPBp-TUBBpRPL8BpGAPDH第4期李红英，等：镉胁迫下构树 qRT-PCR 内参基因筛选及验证135基因，通过 qRT-PCR 技术，并结合 geNorm、NormFinder和BestKeeper软件对构树 Cd 胁迫下不同组织器官表达稳定性进行评估。由于各软件的运算逻辑及使用的统计学方法不同，各分析软件中内参基因表达稳定性排名略有差异，如 geNorm与 NormFinder 软件分析结果均显示BpDOUB 基因表达稳定性最好，而 Bestkeeper软件分析结果则显示 BpNADH 基因表达较稳定。这种现象在杨树（Populus deltoides）31、扇脉杓兰（CypripediumjaponicumThunb.）32以及其它植物内参基因研究中也有出现。RefFinder 是一种候选内参基因稳定性综合分析的程序，已被广泛用于内参基因筛选研究中13,27。为对内参基因稳定性进行综合评价，本研究利用 RefFinder 对 10 个候选内参基因稳定性进行综合评估，基因表达稳定性从高到低依次为：BpDOUB、BpNADH、BpUBE2、BpHIS、BpActin、BpTUA、BpHSP、Bp-TUB、BpRPL8、BpGAPDH。为避免单个内参基因造成实验误差，通常选择 2 个或多个基因作为内参基因调整系统偏差，得到更准确的基因表达定量结果，本研究中用 geNorm 软件确定了内参基因最佳数量，各候选内参基因的变异系数（V2/3）均0.15，说明在 Cd 胁迫下构树仅需要 2 个内参基因即可得到可靠结果。最终确定BpDOUB 和 BpNADH 为 Cd 胁迫条件下构树荧光定量结果标准化分析的最佳内参基因组合。DREB 是植物中特有的转录因子，植物遭受逆境胁迫后，DREB 通过与逆境抗性基因启动子区的 DRE/CRT（脱水反应元件）顺式元件发生特异性相互作用，调节一系列下游基因（包含 DRE/CRT 元件）的表达，增强植物逆境的抗性19，已经在构树8、甘薯（Dioscorea esculenta(Lour.)Burkill）33、刚毛柽柳（Tamarix hispidaWilld.）34等多种植物研究中发现 DREB基因可以被重金属Cd 诱导上调表达，可用于验证筛选出的内参基因的可靠性。本研究分别使用筛选出的最佳内参基因 BpDOUB、BpNADH 及其组合为内参基因，同时以稳定性最差的基因 BpGAPDH为参照，分析Cd 胁迫下 BpDREB 基因在构树根部以及叶片中的表达模式，结果显示：使用表达稳定的基因（BpDOUB、BpNADH）进行基因表达水平归一化时，逆境胁迫响应基因 BpDREB 在 Cd 处理下构树的根部和叶部表达模式基本一致，均为上调表达，而用不稳定的 BpGAPDH 基因为参照时，基因表达水平明显不同，进一步验证了筛选出的内参基因的准确性。综上表明，选择适合的内参基因对于分析目的基因表达变化至关重要。4结论本研究通过 qRT-PCR 技术并结合内参基因稳定性分析软件 geNorm、NormFinder、BestKeeper和 RefFinder对候选内参基因的表达稳定性进行评价，确定 BpDOUB 和 BpNADH 为构树 Cd 胁迫条件下最适内参基因组合，并通过逆境胁迫响应基因 BpDREB 进一步验证筛选的内参基因的准确性。本研究结果为构树 Cd 胁迫下目的基因表达分析提供了可靠的内参基因，为开展构树耐 Cd 机理研究和重要功能基因发掘奠定基础。参考文献：YALLEYMK,ADUSUD,BUNYAMINAR,et al.Naturalregen-erationofindigenoustreespeciesinBroussonetia papyriferainvaded sites in pra-anum forest 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