调节性T细胞过继治疗在自身免疫性疾病中的研究进展.pdf

综述调节性 T 细胞过继治疗在自身免疫性疾病中的研究进展陈慧灵，李萌，姚鹏浩，杨淑钧，曹霞昆明医科大学第二附属医院中心实验室，云南昆明650101摘要：相比传统糖皮质激素联合氨甲蝶呤、硫唑嘌呤等改善自身免疫疾病方案治疗周期长、不良反应程度重的特点，近年来研究显示恢复或逆转调节性 T 细胞(regulatoryTcells，Treg)相关的免疫失衡能有效治疗自身免疫性疾病，在自身免疫性疾病的临床应用方面具有巨大的潜力。本文就近年来 Treg 细胞过继治疗在常见自身免疫性疾病中的研究进展进行概述。关键词：过继细胞治疗；调节性 T 细胞；自身免疫性疾病；系统性红斑狼疮；1 型糖尿病；移植物抗宿主病中图分类号：R392.9文献标志码：A文章编号：2095-5227(2023)06-0708-06DOI：10.3969/j.issn.2095-5227.2023.06.021引用本文：陈慧灵，李萌，姚鹏浩，等.调节性 T 细胞过继治疗在自身免疫性疾病中的研究进展J.解放军医学院学报，2023，44（6）：708-713,封三.Research advances in Treg cell adoptive therapy in autoimmune diseasesCHENHuiling,LIMeng,YAOPenghao,YANGShujun,CAOXiaCentralLaboratory,theSecondAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650101,YunnanProvince,ChinaCorrespondingauthor:CAOXia.Email:Abstract:Thelongtreatmentperiodandseveresideeffectsarethedisadvantagesoftraditionalglucocorticoidscombinedwithmethotrexate,azathioprineandothermethodsforthetreatmentofautoimmunediseases.Inrecentyears,studieshaveshownthatrestoringorreversingTreg-relatedimmuneimbalancecaneffectivelytreatautoimmunediseases,whichhasgreatpotentialforclinicalapplicationinautoimmunediseases.ThisreviewsummarizestheresearchprogressofadoptivetherapyofTregcellsinthetreatmentofcommonautoimmunediseasesinrecentyears.Keywords：celladoptivetherapy;regulatoryTcells;autoimmunediseases;systemiclupuserythematosus;type1diabetesmellitus;graft-versus-hostdiseaseCited as：ChenHL,LiM,YaoPH,etal.ResearchadvancesinTregcelladoptivetherapyinautoimmunediseasesJ.AcadJChinPLAMedSch,2023,44（6）:708-713,insidebackcover.自身免疫性疾病(autoimmunediseases，AID)指由一系列遗传、环境、激素、代谢等因素相互作用导致的自身免疫系统自稳功能异常，包括系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus，SLE)、类风湿关节炎(rheumatoidarthritis，RA)、移植物抗宿主病(graft-versus-hostdisease，GvHD)、1 型糖尿病(type1diabetesmellitus，T1D)等多种疾病1。调节性 T 细胞(regulatoryTcells，Treg)在预防自身免疫和维持免疫稳态中起关键作用，是诱导强大的抗肿瘤免疫反应的主要细胞群。人类和动物发生 AID 和炎症性疾病的主要原因是 Treg 细胞发育或功能障碍以及 T 细胞亚群失衡2。Treg 细胞表面表达分子细胞毒性 T 淋巴细胞相关蛋白 4、肿瘤坏死因子受体家族基因、程序性死亡-1 等，其特征是高水平表达 IL-2 受体-链(CD25)和特异性转录因子叉头盒蛋白 3(transcriptionfactorforkheadboxprotein3，Foxp3)，Foxp3 是 CD4+CD25+Treg细胞分化发育和功能稳定的关键转录因子3-4。当这些关键分子出现异常时，个体就更容易发生AID，研究发现人类和小鼠的免疫调节失调、多内分泌腺病、肠病、X-连锁(immunedysregulation，polyendocrinopathy，enteropathy，X-linked，IPEX)综合征均为 Foxp3 基因突变引发的严重 AID5。因此，维持 Treg 细胞比例平衡或修复其功能障碍意味着可能能够有效治疗 AID。过继细胞疗法(adoptivecelltherapy，ACT)是一种通过获取患者或健康人体内的免疫细胞，采用体外培养、扩增、抗原刺激等方法，将目标免疫细胞输入到患收稿日期：2022-07-11基金项目：国家自然科学基金项目(82060306)；云南省领军人才培养计划(L-2017014)；云南省生物医药重大专项(202102AA100007-4)作者简介：陈慧灵，女，硕士。研究方向：自闭症。Email:通信作者：曹霞，女，教授，博士生导师，科技教育处处长兼中心实验室负责人。Email:708解放军医学院学报Acad J Chin PLA Med Sch Jun 2023，44（6）https:/者体内的细胞疗法。目前 ACT 研究常用的细胞包括树突状细胞(dendriticcell，DC)、自然杀伤(naturalkiller，NK)细胞和肿瘤浸润性淋巴细胞等6。本文将总结近年来 Treg 细胞过继疗法在 AID中的研究进展，为未来的临床治疗提供新的帮助。1 1 调节性 T 细胞在结缔组织自身免疫性疾病中的研究1.1系统性红斑狼疮SLE 是一种免疫系统攻击全身健康细胞和组织的疾病，特点是体内异常产生自身抗体，这些自身抗体主要针对凋亡细胞表面可识别的核酸成分和 RNA 结合蛋白，形成免疫复合物沉积于循环系统，因无法被清除进而损伤组织和器官7。在一项临床试验中，1 例患有活动性皮肤病的 SLE 患者静脉输注了 1108个自身多克隆 Treg细胞，氘追踪显示外周血中 Treg 细胞短暂存在，活化的 Treg 细胞在病变组织中积累，1 型辅助性 T 细胞(typehelperTcells，Th1)产生的干扰素-(interferon-，IFN-)减少，而白细胞介素-17(interleukin-17，IL-17)增加，最终患者的皮肤炎症得到了缓解和改善，临床病情并未恶化8。但该研究的局限性在于纳入的受试者样本量严重不足，可重复性未知。自体 Treg 过继细胞治疗如图 1 所示。1.2类风湿关节炎RA 的特征是滑膜炎症和增生、自身抗体的产生、软骨和骨破坏，以对称性多发性关节炎为重要临床表现，亦可导致血管、代谢、骨骼等领域的进行性破坏和共病9。Treg/Th17细胞平衡失调是 RA 发病的重要原因，大多数研究认为 RA 患者关节液中 Treg 细胞数量显著增多，而功能受损，以至于不能抑制效应 T 细胞(effectorTcells，Teff)的增殖和细胞因子的分泌10。胶原诱发的关节炎(collageninducedarthritis，CIA)模型与人类风湿病关节炎具有相似的免疫学和病理学特征，以慢性、多发性末端关节炎、关节损伤等表现为主，由型胶原蛋白(typecollagen，C)诱发，是研究 RA 的高质量动物模型11。目前未见报道 Treg 细胞过继治疗 RA 的临床试验，可从动物研究中体现最新进展，一种是异体多克隆 Treg 细胞过继治疗，另一种是生成抗原特异性Treg 细胞过继治疗，分别如图 2、图 3 所示。从野生型雄性 DBA/1J 小鼠脾细胞分离纯化出CD4+CD25-T 细胞，与成熟耐受性 DC 一起培养，生成 CD4+CD25+Treg 细胞，然后经尾静脉向 CIA小鼠注射 1106个 Treg 细胞，结果显示，小鼠体内肿瘤坏死因子-(tumornecrosisfactor-alpha，TNF-)、IL-17 和 IL-6 水平降低，IFN-、IL-10和转化生长因子-(transforminggrowthfactor-，TGF-)水平升高，CIA 的严重程度降低，病情进展延缓。TNF-与 CIA 发病有关，IFN-可抑制单核巨噬细胞向破骨细胞分化，抑制 Th17 的发育和功能12。研究发现，人外周血单个核细胞分离出的 CD8+Treg 细胞显示出 Foxp3 和 CD103 的高表达，具有强抑制能力，并在炎症微环境中稳定存在。当 CIA 小鼠经尾静脉注射 4106个人 CD8+Treg 细胞后，小鼠的临床评分、抗胶原 IgG 抗体水平和软骨破坏降低，CIA 严重程度减轻13。在最新研究中，Sun 等14分离 CIA 小鼠的脾和淋巴结 CD4+T 细胞，并诱导培养成 C抗原特异性 Treg 细胞，经尾静脉向 CIA 小鼠注射 3106个该细胞，观察到关键的炎症因子 TNF-被抑图 1 自体 Treg 过继细胞治疗Fig.1 autologous Treg adoptive cell therapy解放军医学院学报Acad J Chin PLA Med Sch Jun 2023，44（6）https:/709制，CIA 病情得到逆转，转移的 Treg 细胞频率在治疗后 8 周没有明显变化，在外周血的含量也是相对稳定的。2 2 调节性 T 细胞在神经肌肉自身免疫性疾病中的研究2.1多发性硬化多发性硬化症(multiplescler-osis，MS)是一种活化的 CD4+T 细胞介导的中枢神经系统 AID，其特征是脱髓鞘以及神经元损伤和轴突丧失15。MS 患者静息的 CD4+CD25+CD45RA+CCR7+Treg 细胞减少，活化的 CD4+CD25hiCD45RA-FOXP3hiTreg 细胞增加16。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimentalautoimmuneencephalomyelitis，EAE)小鼠可以很好地模拟 MS的发展，从 C57/B6 小鼠淋巴结和脾中分离出 Treg细胞，分别进行 3 组治疗，结果显示：(1)0.5106个 Treg 细胞减少了面部异位痛，降低 EAE 小鼠星形胶质细胞的免疫反应性，并增加三叉神经通路中的髓鞘化，但不影响病程的进展；(2)腹腔注射 2106个 Treg 细胞可抑制 EAE 的进展和疼痛行为；(3)在 EAE 诱导前 1d 腹腔注射激活的Treg 细胞，可长期抑制疾病进展17。目前的研究确定了 CCR8+Treg 细胞在免疫抑制中发挥关键作用，在 EAE 小鼠发病过程中给予 CCL1-Ig 可增强CCR8+Treg 细胞的体内增殖，同时诱导 CD39、颗粒酶 B 和 IL-10 的表达，从而有效抑制 EAE18。这为未来 MS 的研究提供了新思路，我们推测 CCR8+Treg 细胞过继治疗或许能够有效改善 MS。2.2重症肌无力重症肌无力是由针对乙酰胆碱受体(acetylcholinereceptor，AChR)、肌肉特异性激酶或突触后肌膜中其他 AChR 相关蛋白的抗体引起的获得性 AID，表现为受累肌肉无力和易疲劳，劳累后加重且休息后减轻，病情稳定但病程反复19。研究发现，过继转移健康大鼠的 Treg 细胞能够缓解实验性自身免疫性重症肌无力(experi-图 2 异体 Treg 过继细胞治疗Fig.2 allogeneic Treg adoptive cell therapy图 3 抗原特异性 Treg 过继细胞治疗Fig.3 antigen specific Treg adoptive cell therapy710解放军医学院学报Acad J Chin PLA Med Sch Jun 2023，44（6）https:/mental autoimmune myasthenia gravis，EAMG)大鼠的症状，而尾静脉注射 EAMG 大鼠自身的Treg 细胞并不能抑制疾病的发展，甚至会导致病情恶化20，表明 EAMG 大鼠的 Treg 细胞存在功能缺陷。而最近的研究显示，将 EAMG 大鼠的CD4+细胞与体外生成的骨髓来源的 DC 一起培养诱导生成 CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞，即 DC-EAMG-Treg 细胞，向患病 3 周的 EAMG 大鼠尾静脉注射 1106个 DC-EAMG-Treg 细胞后，EAMG大鼠的临床评分和体液 AChR 特异性反应降低，病情得到改善，这显示过继转移 DC-EAMG-Treg细胞有抑制 EAMG 病情发展的作用21。3 3 调节性 T 细胞在内分泌自身免疫性疾病中的研究3.11 型糖尿病T1D 是一种慢性疾病，表现为 细胞丢失或破坏引发胰岛素分泌缺乏，由胰岛浸润自身反应性 CD4+和 CD8+T 细胞引起22。以下将从动物研究和临床试验两个方面进行阐述。研究报道，小鼠多能干细胞能诱导 T1D 小鼠的细胞生成抗原特异性 Treg 细胞，该 Treg 细胞具有抑制自身免疫的能力。经尾静脉向 T1D 小鼠注射 3106个该抗原特异性 Treg 细胞后，观察到血糖水平降低，IL-10 和 TGF-分泌增加，致病性CD8+T 细胞的迁移和活性被抑制，CD8+与 CD4+T 细胞的比例降低。IL-10 可降低黏附分子-1 的表达，抑制致病性免疫细胞在受损胰岛中的积累，避免额外的损伤23。同种异体胰岛移植的 T1D 患者需要终身服用免疫抑制药物以防止移植排斥，但这会引起不良反应并增加感染和恶性肿瘤的易感性。一项临床试验首次纳入 5 例接受门静脉同种异体胰岛移植的 T1D 患者，在标准免疫抑制方案下输注(0.141.27)106/kg 多克隆自体 Treg 细胞，该剂量范围内未观察到相关的不良反应，这表明 ACT 在同种异体胰岛移植中是安全可行的24。IL-2 是免疫稳态维持的关键分子，低剂量 IL-2治疗 T1D 的临床试验已取得一定的成果，但最近的临床试验显示低剂量 IL-2 与多克隆自体 Treg 细胞联合过继治疗并没有改善患者的胰岛代谢功能和 C 肽水平，不仅如此，患者体内的 C 肽水平甚至持续下降，所以该试验在第二疗程终止。不过这项联合治疗引起了内源性 Treg 细胞数量的增加，一些患者的穿孔素和颗粒酶 B 激活的 CD8+T细胞、黏膜相关的不变性 T 细胞和 NK 细胞的扩增，以及活化的 CD8+T 细胞亚群的克隆扩增25。除以上研究，也有一些改良的 Treg 细胞具有潜在的疗效，如抗原提呈细胞诱导脐带血来源的CD4+CD25-T 细胞生成的胰岛素原特异性 Treg 细胞可以为 AID 治疗提供低风险、HLA 完全匹配的自体细胞26。3.2卵巢早衰卵巢早衰(prematureovarianin-sufficiency，POI)是指 40 岁以下女性卵巢生发和激素功能的停止，典型特征是闭经、高促性腺激素性性腺功能减退症和不孕症，以激素替代治疗为主27。POI 患者外周血 CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞比例和 FOXP3mRNA 表达水平低于健康人群，IFN-和肾上腺皮质自身抗体水平升高，TGF-1 水平降低，CD4+CD69+活化 T 细胞增加，这提示 POI 是一种 AID28-29。研究表明，透明带糖蛋白 3 肽诱导 Balb/c 小鼠生成 POF 动物模型小鼠，从正常 Balb/c 小鼠的脾中分离、纯化和培养 Treg细胞后，腹腔注射 5105个 CD4+CD25+Treg 细胞至 POI 小鼠可能具有保护作用。虽然 ACT 组小鼠卵巢重量和卵泡数量并未明显改善，但与未经治疗的 POI 组相比有一定的效果，可以观察到ACT 组小鼠血清促卵泡生成素、促黄体生成素和抗透明带抗体浓度显著降低，而雌二醇和抗穆勒氏激素浓度显著升高30。4 4 调节性 T 细胞在消化系统自身免疫性疾病中的研究4.1自身免疫性肝炎自身免疫性肝炎(autoim-munehepatitis，AIH)是以 T 淋巴细胞为主介导的自身免疫反应的慢性进行性肝炎症性疾病，其特点有血清谷草转氨酶(aspartateaminotransferase，AST)和谷丙转氨酶(alanineaminotransferase，ALT)水平升高，血清自身抗体阳性31。异体肝星状细胞(hepaticstellatecells，HSC)以细胞-细胞接触的方式增强 TCR 接触诱导的 Treg 细胞增殖，增强体外 Treg 细胞的抑制活性，抑制 Teff 的增殖。从C57BL/6 小鼠中分离出脾 CD4+CD25+Treg，再与原代和二代 HSC 细胞共同培养 72h，当每只小鼠经尾静脉注射 1106个 HSC-Treg 细胞后，观察到由刀豆蛋白 A 诱导的小鼠 AIH 的严重程度减轻，血清 AST 和 ALT 水平显著降低，Treg 细胞和 Th17 细胞反应的平衡得到调节32。一项临床试验发现 4 例 AIH 患者接受静脉输注自体多克隆 GMP 级 CD4+CD25hiTreg 细胞后，22%44%Treg 细胞在AIH 患者肝中保留长达72h，安全性较好，无重度不良反应，最大剂量为 8.6107个细胞。输注的 Treg 细胞抑制了组织损伤 Teff，解放军医学院学报Acad J Chin PLA Med Sch Jun 2023，44（6）https:/711表达 CXCR3、CD39、CTLA-4 和 Foxp3，CXCR3是一种参与炎症肝招募的趋化因子受体33。尽管该临床试验纳入的受试者数量不足，但这表明过继转移的 Treg 细胞能够较好地归巢到 AIH 患者的肝中，Treg 细胞过继疗法可能是治疗早期 AIH 的有效方式，这为后续的临床试验提供了研究基础。4.2炎症性结肠炎炎症性结肠炎包括溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis，UC)和克罗恩病。UC 是一种病因不明的慢性炎症性肠病，影响结肠和直肠，UC 的炎症通常局限于黏膜层，导致肠壁的浅表损伤，肠道 Teff 细胞过多，黏膜 Treg 细胞增殖不足34。Wang 等35分 离 纯 化 出 BALB/c 雄 性 小 鼠CD4+CD25+Treg 细胞，以每只小鼠 1106个细胞过继转移至肠炎模型小鼠，结果显示 ACT 组疾病活动指数评分低于其余组，且杯状细胞和炎性细胞数量减少，与肠炎组相比，ACT 组的 IL-1、TNF-、NO 和 PGE2 水平明显降低，该研究表明，过继转移小鼠的 CD4+CD25+Treg 细胞可以缓解小鼠肠炎。一项临床试验纳入了 1 例患有难治性 UC和相关原发性硬化性胆管炎(primarysclerosingcholangitis，PSC)的患者，该患者接受单次输注1106/kg 体外扩增的自体多克隆 Treg 细胞后，在第 12 周显示出临床、生化、内镜和组织学反应迹象，PSC 明显改善，肝酶降低，这种明显的效果持续了 4 周，然后数值再次开始增加36。这些发现表明，Treg 细胞过继疗法可能对难治性 UC 有效，并可能是 PSC 的潜在治疗途径。5 5 调节性 T 细胞在其他自身免疫性疾病中的研究5.1移植物抗宿主病GvHD 由供体来源 T 细胞引起，这些 T 细胞在来自主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)不相关供体的异位造血干细胞移植后攻击受体组织37。辐射后的小鼠接受同种异体骨髓移植(allo-geneicbonemarrowtransplant，BMT)后发生急性GvHD，经尾静脉注射供体来源的 5105个调节性 1 细胞(Tregulatory1cells，Tr1)，治疗后 CD4+CD25+Foxp3+T 细胞数量增加，部分过继转移的 Tr1 分化为 Foxp3+Treg 细胞，Th2/Th1 和 Treg/Th17 增加，小鼠的生存时间延长，临床 GvHD 评分下降，临床表现改善38。在另一研究中，辐射后的小鼠在接受 BMT 的第 11 天经尾静脉注射 5106个供体来源的 CD4+CD25hiCD62L+Treg 细胞，显示急性 GvHD 的临床和组织学征象得到改善，生存率提高，CD4+CD25hiCD62L+Treg 细胞迁移到淋巴结和急性 GvHD 的靶器官(主要是胃肠道)，抑制常规 T 细胞的增殖，成功治疗了胃肠道和淋巴组织的组织损伤，促进胃肠道的组织再生39。在临床试验中，3 例难治性 GvHD 儿童经静脉输注 3106/kg 多克隆扩增的供体 Treg 细胞，其中 2 例患者表现出持续 1 年临床改善，GvHD 活性显著降低，无直接相关的不良反应40。该研究局限在于受试者数量不足，且需要进一步的对照研究来证实这些令人鼓舞的效果，并最终为 Treg细胞过继治疗难治性 GvHD 奠定基础。嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，CAR)-Treg 细胞治疗可以将 Treg 细胞靶向到组织破坏部位或移植组织去发挥更好的效应，主要优点是能够识别目标组织中表达的完整蛋白质，而不是仅限于 MHC-类或类抗原41。在 GvHD 的动物实验中 CAR-T 技术已取得初步成果，CD19-CAR-Treg 细胞过继后抑制了免疫缺陷小鼠的抗体产生，降低了小鼠发生 GvHD 的风险，安全性较好42。Treg 细胞过继治疗难治性 GvHD 不是完全安全的，此前报道过患者接受 ACT 后发生皮肤恶性肿瘤而死亡，这表明治疗的机会与风险并存，而且 GvHD 患者被感染的机会高于其他 AID 患者，需要注意非血液疾病系统肿瘤的发生。5.2免疫调节失调、多内分泌病、肠病、X-连锁综合征IPEX 为 X 连锁隐性遗传模式，仅男性发病，患者通常会出现肠病、AID、皮炎、嗜酸性粒细胞增多和血清 IgE 升高43。慢病毒 Foxp3 基因转导(lentiviraltransferofFoxp3，LV-Foxp3)可以将CD4+Teff 细胞转化为 Treg 样细胞，即 CD4LVFoxp3细胞，同时保留了 Teff 细胞相似的 TCR 库。当Foxp3 基因缺陷的 IPEX 样人源化小鼠接受过继转移 2106个 CD4LVFoxp3细胞后，小鼠 CD4+记忆T 细胞的过度增殖被抑制，且与不注射 CD4LVFoxp3细胞的对照组小鼠相比存活时间更长，小鼠体内抗原启动 T 细胞的体内扩增或肿瘤清除也未受到影响44。6 6 结语近年来，Treg 细胞过继治疗方法在 AID、肿瘤等疾病中迅速发展，也衍生出多种细胞疗法，但很多研究存在的问题是过继后的 Treg 细胞数量和治疗效果无法很好维持，有些甚至会回到基线值，因此需要更多的动物实验和高质量临床试验来验证 Treg 细胞过继治疗 AID 运用于临床实践中712解放军医学院学报Acad J Chin PLA Med Sch Jun 2023，44（6）https:/的可靠性。目前国内外对此仍在探索，Treg 细胞数量和功能缺陷的情况在每种 AID 中各不相同，而 Treg 细胞过继治疗可以根据特定患者进行靶向性和高度个性化治疗，相较于常规治疗的免疫抑制力更强，是一种前景广阔的治疗方式。作者贡献作者贡献陈慧灵：文章构思和撰写，制图；李萌、曹霞：指导修改文章；姚鹏皓、杨淑钧：查阅文献，文献解读。利益冲突利益冲突所有作者声明无利益冲突。参考文献Bach JF.The hygiene hypothesis in autoimmunity：the role ofpathogens and commensalsJ.Nat Rev Immunol，2018，18（2）：105-120.1Savage PA，Klawon DEJ，Miller 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