低深度全基因组拷贝数变异测序在复发性流产遗传学诊断中的应用.pdf

收稿日期：2022-12-04基金项目：汕头市医疗卫生科技计划项目（2021048）作者简介：张少芬，硕士，主治医师；徐晓园，博士，主治医师，E-mail：g_汕头大学医学院学报Journal of Shantou University Medical College第36卷 第2期2023年6月Vol.36 No.2June 2023低深度全基因组拷贝数变异测序在复发性流产遗传学诊断中的应用张少芬1，王霄霜2，林桂丽1，徐晓园2（1汕头大学医学院第一附属医院全科医学分院，广东汕头515041；2汕头大学医学院第一附属医院妇产科，广东汕头515041）摘要 目的：探讨基于高通量测序技术的低深度全基因组测序技术在复发性流产胚胎或绒毛组织染色体异常的应用价值。方法：选择2019年3月2021年8月就诊于汕头大学医学院第一附属医院妇产科门诊并确诊为自然流产的患者，孕周为516周，留取流产组织，提取DNA，制备文库，进行流产物染色体低深度全基因组拷贝数变异测序，分析胚胎染色体数目和结构变异结果。结果：197例样本检测全部成功，检出染色体异常样本135例，染色体异常检出率为68.5，其中检出染色体数目异常 104 例（77.0），染色体部分重复/缺失 26 例（19.3），染色体数目异常合并部分重复/缺失 5 例（3.7%），嵌合体10例（7.4）；染色体数目异常以16（11.85%）、X（9.63%）、22（96.67%）、21（5.93%）染色体高发。35岁患者的染色体数目异常率比35岁患者的高（分别为70.0%和51.6%，P0.05）。共检出26例染色体部分重复/缺失，最短序列长度为0.12 Mb，最大片段94.54 Mb。在26例CNVs中，9例CNVs有明确致病性，2例CNVs提示可能致病。其中4个包含微缺失/微重复综合征。结论：低深度全基因组拷贝数变异测序技术能有效检测出流产胚胎绒毛组织染色体的非整倍体和部分重复/缺失情况，有助于明确复发性流产的病因，指导患者优生优育。关键词 高通量测序技术；低深度全基因组测序技术；复发性流产；拷贝数变异中图分类号 R714.21文献标志码 A文章编号 1007-4716(2023)02-0100-06DOI：10.13401/ki.jsumc.2023.02.008Low-depth whole genome copy number variation sequencing for geneticdiagnosis of recurrent abortionZHANG Shaofen1,WANG Xiaoshuang2,LIN Guili1,XU Xiaoyuan2(1.Family Medicine Centre,the First Affiliated Hospital of Shantou University Medical College,Shantou 515041,China;2.Departmentof Obstetrics and Gynecology,the First Affiliated Hospital of Shantou University Medical College,Shantou 515041,China)Abstract Objective:To explore the value of low-depth whole genome sequencing based on high-throughputsequencing technology in the application of chromosomal abnormalities in embryonic or chorionic tissue inrecurrent miscarriage.Methods:Patients who attended the obstetrics and gynecology clinic of the First AffiliatedHospital of Shantou University Medical College from March 2019 to August 2021 and were diagnosed withspontaneous miscarriage at 5-16 weeks of gestation were selected to retain miscarriage tissues,extract DNA,prepare libraries,perform low-depth whole-genome copy number variation sequencing of chromosomes ofmiscarriage products,and analyze embryonic chromosome number and structural variation results.Results:All197 samples were successfully tested,135 chromosomal abnormalities were detected,and the detection rate ofchromosomal abnormalities was 68.5%,including 104 cases of chromosomal number abnormalities(77.0%),26cases of partial duplications/deletions(19.3%),5 cases of chromosomal number abnormalities combined withpartial duplications/deletions(3.7%),and 10 cases of chimerism(7.4%);chromosome number abnormalities werehigh for chromosomes 16(11.85%),X(9.63%),22(96.67%),and 21(5.93%).The prevalence of chromosomenumber abnormalities was high with 16(11.85%),X(9.63%),22(96.67%)and 21(5.93%)chromosomes.The rateof chromosome number abnormalities was higher in patients 35 years old than in patients 35 years old(70.0%and 51.6%,P0.05).A total of 26 cases of partial chromosome duplication/deletion were detected among them,with the shortest sequence length of 0.12 Mb and the largest fragment of 94.54 Mb.Among the 26 CNVs,9 CNVs101张少芬，等低深度全基因组拷贝数变异测序在复发性流产遗传学诊断中的应用第 2期were clearly pathogenic and 2 CNVs suggested possible pathogenicity.Four of them contained microdeletion/microduplication syndromes.Conclusion:Low depth whole genome copy number variant sequencing technologycan effectively detect aneuploidy and partial duplication/deletion of chromosomes in the chorionic tissue ofmiscarried embryos,which can help to clarify the etiology of recurrent miscarriage and guide patients to eugenics.Key words high-throughput sequencing technology;low-depth whole-genome sequencing technology;recurrentabortion;copy number variation自然流产（spontaneous abortion，SA）通常是指在妊娠28周以下，胎儿体重小于1 000 g而终止妊娠者1。流产的发生率约为 15%20%，并有逐 年 增 加 的 趋 势2。复 发 性 流 产（recurrentspontaneous abortion，RSA）是指妇女遭受2次或更多次连续自然流产。SA的病因复杂，已知的4种重要病因是母体免疫学因素（包括自身免疫和同种免疫）、易栓因素（包括遗传性和获得性易栓症）、女性生殖道解剖结构异常以及内分泌异常。胚胎染色体异常也是导致SA的常见原因，流产物染色体异常发生率超过50%3。本研究旨在应用低深度全基因组拷贝数变异测序技术（copy number variation sequencing，CNV-seq）进 行 染 色 体 拷 贝 数 变 异（copy numbervariation，CNVs）序列分析，以确定CNVs的类型和临床意义；对各种类型的胚胎染色体异常的比率进行分析，对孕妇年龄与不同类型染色体异常发生率的相关性进行分析，探讨CNV-seq检测技术在检测自然流产遗传学诊断中的应用价值，以获得有意义的遗传病因学信息，为患者再次妊娠和产前诊断提供有用的遗传学指导。1资料与方法1.1研究对象选取2019年3月2021年8月就诊于汕头大学医学院第一附属医院妇产科门诊，诊断为自然流产的孕妇197例，孕妇年龄2142岁，孕周516周。纳入标准：（1）流产孕周28周；（2）RSA患者；（3）难以存活的宫内空孕囊或流产、引产前B超检查提示胚胎或胎儿停止发育；（4）自愿要求进行流产物（胚胎绒毛组织）染色体检测。排除标本收集不合格、中途放弃检测的孕妇。本研究经由汕头大学医学院第一附属医院伦理委员会审核批准，所有研究对象均签署知情同意书。1.2低深度全基因组测序技术检测方法应用CNV-seq对197例自然流产患者的流产组织（胚胎绒毛组织）进行染色体测序。选取大约510 mg的胚胎绒毛组织，用无菌生理盐水冲洗。在无菌标本瓶里保存。利用天根生化科技（北京）有限公司的DNA提取和纯化试剂提取基因组DNA，使用文库构建通用试剂盒进行文库构建，最后使用低深度全基因组测序技术进行序列测序。测序完成后，对获得数据进行生物信息学分析。以HG19基因组序列为参照，计算每个测序序列的CNVs，得到每个染色体的拷贝数值，判断染色体片段的重复或缺失，最后绘制检测结果图并完成分析。另外，采用短串联重复序列技术对其母亲的外周血和流产组织进行分析，排除了三倍体和多倍体倍性的影响。1.3结果分析CNVs的致病性分析主要参考OMIM（https:/www.omim.org/）、DECIPHER（https:/decipher.sanger.ac.uk）、ClinGen（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/dbvar/clingen）等数据库。CNVs的临床意义根据美国医学遗传与基因组学协会指南划分为5个级别：致病CNVs、可能致病 CNVs、变异型不确定意义 CNVs、可能良性CNVs和良性CNVs4。1.4统计学方法应用SPSS 25.0统计软件进行分析，计数资料以例数或百分率表示，组间比较用卡方检验；均为双侧检验，检验水准=0.05。2结果2.1流产组织染色体检测结果197 例样本检测全部成功，CNV-seq 检测结果：异常染色体135例（见表1），占68.5%（135/197），阴性标本占31.5%（62/197）。染色体数目异常共104例，占比77.0%（104/135），染色体部分重复/缺失26例，占比19.3%（26/135），数目异常合并染色体重复/缺失 5 例，占比 3.7%（5/135）。数目异常染色体中，发现常染色体三体63102汕头大学医学院学报第36卷例，克氏综合征（核型为47，XXY）2例。三倍体10例，占比7.4%（10/135）。5例复合三体。单体 14 例，占比 10.4%（14/137），包括 X 单体 13例，21单体1例。嵌合体10例，占比7.4%（10/135）。染 色 体 数 目 异 常 以 16 号（16/135，11.9%）、X 号（13/135，9.6%）、22 号（9/135，6.7%）、21号（8/135，5.9%）染色体高发。2.2孕妇年龄与RSA胚胎染色体异常的相关性197例RSA组织中，排除既有染色体数目异常又有染色体部分重复/缺失的染色体，将RSA样本按年龄分成2组，即高龄组（35周岁）与对照组（35周岁），对其染色体数目及染色体部分重复/缺失的异常发生率进行对比，结果显示，2个年龄段的胚胎染色体数目异常发生率差异具有统计学意义（2=3.933，P0.05）。见表2。在135例异常RSA组织中，随着母体年龄的增长，流产胚胎染色体数目异常的发生率逐步升高，呈正相关趋势，而染色体的重复/缺失发生率则与其年龄呈负相关趋势。见图1。2.3染色体部分重复/缺失与致病性情况197例流产物样本中，共检出26例染色体部分重复/缺失，最短序列长度为0.12 Mb，最大片段94.54 Mb，其中片段长度10 Mb的微缺失/微重复有18个。在26例染色体部分重复/缺失中，9例CNVs有明确致病性，2例CNVs提示可能致病，15例CNVs未找到明确致病信息。在检测出的致病性染色体部分重复/缺失中（见表3），发现4个包含微缺失/微重复综合征，即4号染色体短臂末端缺失综合征，8号染色体重组综合征，17p13.3缺失综合征和压力性麻痹易感性遗传性神经病。3讨论RSA的病因复杂，超过一半的SA是由染色体异常引起，其他多种因素也可能发挥作用。原因包括：女性年龄、解剖和染色体异常、遗传、内分泌、胎盘异常、感染、吸烟和饮酒、心理因素、接触重金属等环境因素、环境污染和辐射等。其中，染色体异常是首要因素，占所有自然流产的50%65%5。随着全面二孩、三孩政策正式实施，不少符合生育政策的家庭正式把二孩、三孩计划提上日程，其中不乏超过35岁以上的高龄妇女，高龄孕妇在自然流产后患严重抑郁症和焦虑症的风险增加6。由此所带来的心理负担，让表1胚胎染色体异常构成类型单体X单体21单体三体47，XXY3-三体4-三体5-三体7-三体8-三体9-三体11-三体13-三体14-三体15-三体16-三体18-三体20-三体21-三体22-三体复合三体14-三体合并15-三体16-三体合并21-三体11-三体合并20-三体21-三体合并22-三体7-三体合并10-三体三倍体嵌合体染色体数目异常合并染色体部分重复/缺失染色体部分重复/缺失合计检出例数13122311251336162189111111010526135构成比/%9.60.71.51.52.20.70.71.53.70.72.22.24.411.91.50.75.96.70.70.70.70.70.77.47.43.719.3100图1不同类型染色体异常发生率与孕妇年龄的关系组别35岁35岁2值P值例数15740染色体数目异常例数81283.930.047发生率/%51.670.0染色体部分重复/缺失例数2833.660.056发生率/%17.87.5表2不同年龄段孕妇染色体异常统计103张少芬，等低深度全基因组拷贝数变异测序在复发性流产遗传学诊断中的应用第 2期她们迫切希望知晓流产原因。对流产绒毛进行遗传学检查，不仅能确定其病因，而且能为流产的预防、诊断和治疗提供有价值的参考数据。如果流产物检查正常，可进一步再排除内分泌、免疫等其他方面的问题；若发现染色体数目异常，可避免不必要的检测及花费；若发现有染色体部分重复/缺失，应对其双亲染色体进行进一步的检测。若绒毛染色体有两条染色体异常，其中一条片段重复的，另一条片段缺失的，那么它的父母亲很有可能是平衡易位携带者；若同一染色体既有重复又有缺失，则其双亲有可能是倒位携带者7。需告知染色体异常患者再次自然受孕时胚胎染色体异常的概率，必要时，建议其进行三代试管。现在还没有一种完美无缺的染色体检测技术8。常规染色体核型分析是公认的检测染色体异常的金标准，它可以检测出染色体的数目异常和大的结构异常。核型分析需要组织细胞培养和较长的检测时间。对操作人员技术要求高，稳定性差。核型分析分辨率有限，无法检测到CNVs。这些缺点限制了它的应用9。染色体微阵列分析是一种快速有效的染色体分析技术，它可以通过一次编号1234567891011CNV-seq检测结果seqhg19del(4)(q34.3q35.2)chr4:g.181740001_190940000delseqhg19del(X)(p22.11)chrX:g.22840001_23000000delseqhg19dup(12)(q24.31)chr12:g.125440001_125660000dupseqhg19 dup(10)(q22.1q26.3)chr10:74880000-135440000;seqhg19del(13)(q33.2q34)chr13:105040000-115100000seqhg19del(21)(q11.2-q21.3)chr21(g.15060000-30260000)1seqhg19del(7)(q11.22)chr7(g.69180000-69460000)1seqhg19del(1)(p36.33-p36.21)Chr1(g.820000-15400000)seqhg19dup(1)(p36.21-p36.13)Chr1(g.15440000-18280000)seqhg19del(15)(q11.1q21.1)Chr15(g.20180000-48300000)；seqhg19dup(18)(p11.32q22.1)Chr18(g.120000-64720000)seqhg19dup(2)(q22.3q37.3)Chr2(g.148480000-243020000)23del(4)(p16.3-p15.1)Chr4(g.40000-28640000)dup(12)(q23.1-q24.33)Chr12(g.100280000-133820000)23seqhg19 dup(1)(q31.1q44)seqhg19dup(7)(q22.1-q36.3)Chr7(g.102020000-159138663)seqhg19del(15)(q26.1-q26.3)Chr15(g.93820000-102400000)seqhg19del(8)(p23.3p23.1)Chr8(g.160000-6920000)seqhg19del(8)(p23.1p22)Chr8(g.8110000-13270000)seqhg19dup(8)(p22)Chr8(g.13360000-15920000)seqhg19dup(8)(p22)Chr8(g.15920000-16980000)seqhg19del(16)(p13.12p13.11)Chr16(g.14620000-15640000)seqhg19del(17)(p13.3-p13.2)Chr17(g.0-3960000)seqhg19del(17)(p13.1-p11.1)Chr17(g.9260000-22240000)结果判读4q34.3-q35.2缺失9.20 Mb，主要临床表征为严重的生长发育迟缓，特殊面容，动脉导管未闭，指/趾畸形，智力障碍，自闭症，注意力缺陷多动障碍，睡眠障碍等；巨脑室，特殊面容，心血管系统异常，指/趾畸形，手足异常，肌张力低下，胃食管反流，复发性鼻炎等。Xp22.11缺失0.16 Mb和12q24.31重复0.22 Mb，未找到明确致病信息。10q22.1-q26.3重复60.56 Mb。临床表型为发育迟缓、先天性异常等；重复综合征是以远端手足裂畸形为特征，有些患者伴有智力低下、颜面部畸形为临床表型的综合征；定义为致病性。13q33.2-q34缺失10.06 Mb。主要表现为张力减退，面部异常，喂养困难，胃食管反流，精神运动发育迟滞，中度至重度智力障碍，关节过度活动等。21q11.2-q21.3缺失15.20 Mb。表型为颜面部畸形、生长发育迟缓、心脏发育畸形、肢端发育畸形、智力低下。综上，考虑该缺失可能致病。7q11.22缺失0.28 Mb。患者以智力低下、语言延迟、发育迟缓、自闭症为主要临床表型；定义为致病性。综上，考虑该变异为可能致病。1p36.33-p36.21缺失14.58 Mb，致病性；1p36.21-p36.13重复2.84 Mb，不明确。15q11.1-q21.1缺失28.12 Mb，致病性。18p11.32-q22.1重复64.60 Mb，考虑该变异为致病性。2q22.3-q37.3嵌合性重复94.54 Mb，部分三体的占比约为40%。重复综合征。致病性。4p16.3-p15.1缺失28.6 Mb，该缺失与Wolf-Hirschhorn综合征重叠。考虑该变异为致病性。12q23.1-q24.33嵌合型重复33.54 Mb，部分三体占比约为40%，综上，考虑该变异为致病性。1q31.1-q44重复61.86 Mb，致病性。7q22.1-q36.3 嵌合性重复 57.12 Mb，其中三拷贝的占比约为 30%，致病性。15q26.1-q26.3缺失8.58 Mb，致病性。8号染色体发生复杂重排。8p23.3-p23.1缺失6.76 Mb，8p23.1-p22嵌合性缺失5.16 Mb，其中一拷贝的占比约为40%，8p12发生4.04 Mb嵌合性重复，三拷贝的占比约为65%；8p22区发生1.06 Mb重复，8号染色体重组综合征。综上，考虑致病性。16p13.12-p13.11缺失1.02 Mb。该变异不明确。17p13.3-p13.2缺失3.96 Mb，亦称Miller-Dieker综合征；致病性。17p13.1-p11.1嵌合性缺失12.98 Mb，其中一拷贝的占比约为30%。遗传性压迫易感性神经病综合征。考虑该变异为致病性。表3染色体致病性部分重复/缺失检出情况分析104汕头大学医学院学报第36卷实验，在整个基因组中检测到非平衡染色体异常。然而，它的缺点是通量低，检测成本高。此外，荧光原位杂交局限于对探针杂交的依赖，无法检测到探针未覆盖的区域和确切断点的变异10。高通量测序技术与传统检测方法相比显著提高了染色体异常的检出率，具有明显的技术优势。CNVseq采用高通量测序技术对样本DNA进行低深度全基因组测序。CNV-seq 具有几个优点，包括对标本质量的低要求、检测时间短、高通量、能够检测小于100 kb的染色体CNVs以及更准确地检测断裂点11。尽管这项技术有很多优点，但是它无法检测到平衡易位，倒位或点突变和染色体整倍体9。总之，不同的染色体检查方法都有各自的优势与不足，应该取其所长，以求为临床精确诊疗提供新的思路和方法。本研究对197例RSA患者的流产组织进行了CNV-seq检测，并结合短串联重复序列技术，检测出异常染色体135例，占68.5%（135/197）。数目异常染色体共104例，最常见的非整倍体主要发生在16、X、22和21号染色体上。其中16-三体异常占比最高，与张华等7的研究结果一致，16-三体也被称为“流产染色体”，是导致早期流产的常见遗传原因之一12。与其他染色体三体发生机制不同，同源染色体近端区域在重组过程中出现缺失，这可能是16-三体在染色体数目异常中发生率最高的原因13。单体型染色体主要出现在X染色体单体上，这一点与闵爱萍等8的研究相符。在减数分裂时，性染色体不能分开而使一条性染色体缺失，是单体型染色体异常的原因，这一现象的出现，多是由于父系性染色体缺失所致。众所周知，35岁以上的妇女生育力下降，因为母亲的年龄与卵母细胞的质量有关。这是由于减数分裂期间的染色体分离误差率随着母亲年龄的增加而增加，并导致染色体数目异常14。本研究表明，流产胚胎染色体数目异常发生率随着孕妇年龄的增加呈递增趋势，而染色体部分重复/缺失异常发生率与孕妇年龄呈现负相关趋势。这与马韵翼等13，15的研究结果一致。我们可能需要更多的病例来证实这一点。除染色体数目异常外，染色体部分重复/缺失异常也是导致流产的遗传因素之一。由于基因组中CNVs的数量非常多，并且包含大量的基因，因此识别与流产相关的特定基因是一个挑战。本研究采用CNV-seq技术检测出染色体部分重复/缺失26例，其中可能致病或致病性CNVs 11例，包括微缺失/微重复综合征4例，这是传统的核型分析技术所无法检测到的。井宣等16的研究表明，结合高通量测序胚胎植入前遗传学筛查技术对植入前胚胎行染色体筛查，对最具发育潜能的优质胚胎进行移植，不仅能够减少移植胚胎数，同时还可提高胚胎着床率和临床妊娠率，降低流产率。因此，通过对RSA夫妇的胚胎染色体进行基因学原因分析，可以为以后的怀孕提供更好的依据。综上所述，RSA的病因除了大部分取决于遗传因素之外，还包括内分泌、免疫、解剖、血栓前状态、环境因素和营养等等17，均需要进行全面的评估，才能为患者下次的成功妊娠做出有效的指导。CNV-seq技术能有效检测出流产胚胎绒毛组织染色体的非整倍体和部分重复/缺失情况，有助于明确复发性流产的病因，指导患者优生优育。参考文献1MUTTUKRISHNA S,JAUNIAUX E,GREENWOLD N,et al.Circulating levels of inhibin A,activin A andfollistatin in missed and recurrent miscarriagesJ.HumReprod,2002,17(12):3072-3078.2QUENBY S,GALLOS I D,DHILLON-SMITH R K,etal.Miscarriage matters:the epidemiological,physical,psychological,and economic costs of early pregnancy lossJ.Lancet,2021,397(10285):1658-1667.3自然流产诊治中国专家共识编写组.自然流产诊治中国专家共识(2020年版)J.中国实用妇科与产科杂志,2020,36(11):1082-1090.4RICHARDS S,AZIZ N,BALE S,et al.Standards andguidelines for the interpretation of sequence variants:ajoint consensus recommendation of the American Collegeof Medical Genetics and Genomics and the Associationfor Molecular PathologyJ.Genet 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