大蒜遗传转化体系建立与CRISPR-Cas9敲除蒜氨酸酶基因研究.pdf

为了为大蒜转基因研究和蒜氨酸酶基因研究提供技术支撑和理论依据，本文首先建立了愈伤组织再生培养体系，在基因型、生长发育时期、植物激素配比和外植体来源方面对比 MS、B5、N6 和 SH 基础培养基，明确大蒜愈伤诱导和培养的最适基础培养基为 MS 和 SH，其中以苍山大蒜根尖为外植体、培养基为 MS+1 mg/L 2,4-D+0.1mg/L 6-BA是大蒜愈伤组织诱导的最佳组合；分化阶段为 MS+3 mg/L 6-BA；生根培养和鳞茎诱导阶段则使用不添加任何激素的培养基。然后，通过对影响农杆菌介导遗传转化因素的筛选，得到最佳转化条件：农杆菌菌株选用LBA4404、侵染液组成 MS/LB+100 M As+1%葡萄糖+1%蔗糖为宜，侵染时间 10 min，共培养 3 d，草铵膦筛选浓度为 250 mg/L，在此条件下该方法的遗传转化率为 1.68%。利用 CRISPR-Cas9 敲除技术，成功实现了对鳞茎蒜氨酸酶关键基因的敲除，突变体中目的基因 mRNA的表达量和蒜氨酸酶活均明显下降。关键词关键词:大蒜;遗传转化;愈伤组织;蒜酶中图法分类号中图法分类号:S633.4文献标识码文献标识码:A文章编号文章编号:1000-2324(2023)03-0319-25Establishment of the Genetic Transformation System and Studieson CRISPR-Cas9 Knockout Allinase GeneNIU Zhong-lu1,YANG Cai-xia2,LI Ning-yang1,LI Xiang2*1.College of Food Science and Engineering,Shandong Agricultural University,Taian 271018,China2.State Key Laboratory of Crop Biology,College of Life Sciences,Shandong Agricultural University,Taian 271018,ChinaAbstract:To provide technical support and theoretical basis for garlic transgenic research and allinase gene research.In thispaper,a callus regeneration culture system was established,and MS,B5,N6 and SH were compared in terms of genotype,growth and development stage,plant hormone ratio and the source of explants.The optimal medium for callus induction andculture of garlic was MS and SH.The root tip of Cangshan garlic as explants and medium MS+1 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L 6-BA were the best combinations for callus induction.The differentiation stage was MS+3 mg/L 6-BA.In root culture andbulb induction phase,medium without any hormone was used.Then,by screening factors affecting Agrobacterium-mediatedgenetic transformation,the optimal transformation conditions were obtained:The optimal solution was MS/LB+100 M As+1%glucose+1%sucrose with LBA4404 and infecting liquid.The infection time was 10min,the co-culture was conductedfor 3 days,and the screening concentration of phosphine oxalammonium was 250 mg/L.Under these conditions,the geneticconversion rate of this method was 1.68%.Using CRISPR-Cas9 knockout technique,the key gene of bulb allinase wassuccessfully knocked out,and the mRNA expression of target gene and allinase activity in the mutant were significantlydecreased.Keywords:Allium sativum L.;genetic transformation;callus;allinase大蒜(Allium sativum L.)为百合科葱属植物，原产于伊朗东北部和中亚地区，在全球范围内被用来制作各种菜肴，是我国现存最早记载的可药食两用的作物之一1。众多研究表明大蒜具有多种药理功能，如抗菌、驱虫、抗氧化、抗炎、抗癌等功能，与抗生素相比大蒜还可以增强免疫系统的保护能力2-5。这些药理功能主要是由大蒜素及其代谢化合物发挥作用，大蒜素是蒜氨酸酶催化蒜氨酸的产物6。研究还发现，蒜氨酸酶与大蒜加工过程中的绿变反应有关，它直接参与第一步的绿变反应过程7。通过减弱蒜氨酸酶活性（添加酶抑制剂、加热钝化等方法）探究蒜氨酸酶与绿变的关系，发现大蒜的绿变程度与蒜氨酸酶活性密切相关，对于打破休眠的大蒜蒜氨酸酶活性越高绿变程收稿日期收稿日期:2022-12-24修回日期修回日期:2023-02-22基金项目基金项目:国家自然科学基金面上项目(31972000);山东省重点研发计划项目(2021TZXD001)第第 1 作者简介作者简介:牛忠露(1997-)女,硕士研究生,主要从事食品营养与人类健康研究.E-mail:*通讯作者通讯作者:Author for correspondence.E-mail:320山东农业大学学报(自然科学版)第 54卷度越强8-10。因此，蒜氨酸酶是大蒜中非常重要的一类酶，它在大蒜中具体的功能需要依靠分子生物学的手段去验证，该验证过程是以组织培养和遗传转化体系为基础的。在目前已建立的农杆菌介导的大蒜遗传转化体系中，大部分受体材料选择的是愈伤组织。如以大蒜芽原基、根系、种子和气生鳞茎诱导的愈伤组织为受体建立农杆菌介导的遗传转化体系11-14，但是这些体系普遍存在转化效率低的问题，转化效率在 0.1%1.47%。大蒜愈伤组织遗传转化的效率受多种因素的影响，如愈伤组织的诱导效率、农杆菌菌株、侵染时间、共培养条件等。其中愈伤组织的诱导效率根据基因型、激素配比、培养条件的不同而存在明显的差异。裴雁曦等15以鳞茎盘为外植体，通过计算机模拟推测得出了 2,4-D、NAA 和 6-BA 与愈伤组织诱导率之间的回归方程，愈伤组织最佳诱导培养基为 MS+0.981.14 mg/L 2,4-D+0.931.90 mg/L NAA+1.911.36 mg/L 6-BA。孔素萍16以大蒜鳞茎盘、茎尖、根尖和试管苗叶片为外植体探究在不同激素配比下各外植体的愈伤诱导率，其中愈伤诱导能力较高的是鳞茎盘和根尖，根尖在任何激素配比下的全部诱导出愈伤组织，鳞茎盘最佳诱导培养基为 B5+2 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA，最高愈伤诱导率也可到100%。唐巧玲等17以根尖为外植体诱导愈伤组织，得出最佳诱导配方为 MS+1 mg/L 2,4-D+0.1mg/L 2ip，愈伤诱导率为 56.06%。为提高农杆菌介导的大蒜遗传转化的效率，本研究首先对影响大蒜愈伤组织诱导及培养的因素进行探究，在该阶段除了使用了前人研究所用的 MS 和 B5 基础培养基，还将 SH 和 N6 基础培养基第一次用于大蒜愈伤诱导并对比它们之间的差异；此外，参考玉米和小麦用胚诱导愈伤的方法，首次选用了鳞茎膨大期不同发育阶段的大蒜进行愈伤组织的诱导18,19。其次，本研究将前人研究所用的遗传转化的条件进行系统的对比，筛选出最佳条件，以期建立更加高效的农杆菌介导的大蒜遗传转化体系。最后，将 CRISPR-Cas9 技术应用于大蒜蒜氨酸酶基因并对转基因植株进行探究，可以为未来大蒜的转基因研究提供技术支撑和理论依据，也为蒜氨酸酶基因的研究和大蒜绿变的研究提供基因资源和参考。1材料材料与方法与方法1.1实验材料实验材料实验所用成熟期大蒜品种包括莱芜大蒜、金乡大蒜、苍山大蒜和邳州大蒜。每年 6 月份分别从当地采收后晾干、置于冷库-2.5 储存。然后选取无明显病斑、无机械损伤的大蒜置于 4 储藏 30d 打破休眠。所用鳞茎膨大期的大蒜品种为金乡大蒜，种植于山东农业大学汶阳现代农业产业园。4 月份大蒜生长发育开始进入鳞茎膨大阶段，从 4 月中旬开始取材，间隔 10 d 取材 1 次，共取 3 次，这 3 次即为初期、中期和后期的材料。去除根须、叶片等的大蒜鳞茎部分作为外植体使用。实验所用的 CRISPR-Cas9 敲除载体为山东农业大学作物学国家重点实验室提供的 SV-Cas9 载体，所用的农杆菌菌株 GV3101、LBA4404、EHA105均采购于上海唯地生物技术有限公司。1.2实验方法实验方法1.2.1 用于大蒜愈伤组织诱导的外植体的获取及消毒处理 大蒜的消毒处理：去除大蒜外层保护叶，用流水冲洗 30 s，接着用 75%乙醇浸泡 15 min，然后在超净工作台内，用无菌水冲洗 3 遍，再用4%次氯酸钠消毒 30 min，取出后用无菌水冲洗 3 遍。鳞芽基部、贮藏叶和茎尖的获取：取已消毒的大蒜鳞茎按图 1 所示的部位取材。鳞芽基部和贮藏叶处理为厚度 0.10.2 cm、再切割成 0.5 cm2大小的组织块接种于培养基上，由于鳞茎膨大初期和中期的大蒜鳞茎较小，接种时只能取鳞芽基部。根尖的获取：取已消毒的大蒜鳞茎，置于 25 的黑暗环境中进行生根培养，时间大约为 1 星期，即可得到无菌苗。然后按图 1 所示的部位取无菌苗的大蒜根尖部位 1 cm 左右进行接种。将外植体接种在愈伤诱导培养基上，以上处理每个培养皿接种 16 块材料，重复 3 次。30 d 后统计各处理组的愈伤诱导率，愈伤诱导率=（出愈外植体数接种外植体数)100%。第 3期牛忠露等:大蒜遗传转化体系建立与 CRISPR-Cas9敲除蒜氨酸酶基因研究321图图 1 外植体取材位置外植体取材位置Fig.1 Location of explants（a）根尖；（b）贮藏叶；（c）茎尖；（d）鳞芽基部。（比例尺：1 cm）(a)Root tip;(b)Storage leaf;(c)Stem tip;(d)The base of garlic clove.(Scale:1 cm)1.2.2 愈伤诱导培养基设计 愈伤诱导培养基的设计包括 MS、B5、N6、SH 四种基础培养基，-萘乙酸(-naphthaleneacetic acid,NAA）和 2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D）两种生长素，6-苄氨基腺嘌呤（6-benzylaminopurine,6-BA）一种细胞分裂素，并添加了蔗糖（30 g/L）和琼脂（7 g/L），pH=5.8，于高压蒸汽灭菌锅中 121 下灭菌 21 min，倒平板后放置备用。为探究 MS、SH、B5 和 N6 基础培养基对愈伤诱导的影响，实验设置了从不同产地的大蒜（莱芜大蒜、金乡大蒜、苍山大蒜和邳州大蒜）、不同外植体来源（茎尖、鳞芽基部、贮藏叶和根尖）和不同发育时期（鳞茎膨大初期、中期、后期和成熟期）这 3 个方面来进行对比。为探究不同发育期对愈伤诱导的影响，实验选取金乡大蒜的鳞茎膨大期初期、中期、后期和成熟期 4 个时期的鳞芽基部进行愈伤组织诱导。由于鳞茎膨大初期和中期的大蒜鳞茎较小，接种时外植体没有区分部位，后期和成熟期取了鳞芽基部和贮藏叶进行诱导。愈伤诱导培养基具体设计见表1。探究不同外植体部位及不同品种的愈伤诱导差异，愈伤诱导培养基的激素配比详细设计如表 2。根据以上实验结果筛选出愈伤诱导最佳的基础培养基，愈伤诱导能力最强的外植体部位和品种，然后将其接种在表 3 的愈伤诱导培养基上，明确愈伤诱导率最高的 2,4-D 和 6-BA 的配比。表表 1 愈伤诱导培养基种类愈伤诱导培养基种类Table 1 Callus induction medium type 基础培养基Basic medium生长素Auxin浓度/mgL-1ConcentrationMS2,4-D2.0NAA2.0B52,4-D2.0NAA2.0N62,4-D2.0NAA2.0SH2,4-D2.0NAA2.0表表 2 愈伤诱导培养基种类愈伤诱导培养基种类Table 2 Callus induction medium type 基础培养基Basic medium2,4-D/mgL-16-BA/mgL-1MS2.00.5B52.00.5N62.00.5SH2.00.5322山东农业大学学报(自然科学版)第 54卷表表 3 2,4-D/6-BA 浓度比值浓度比值Table 3 2,4-D/6-BA concentration ratio2,4-D/mgL-16-BA/mgL-12,4-D/6-BA比值1.00.1101.00.522.00.1102.00.543.00.1303.00.561.2.3 愈伤组织的继代培养 愈伤组织继代培养基和培养条件采取和诱导愈伤组织同样的条件和配方。取诱导的初代愈伤组织，设置愈伤组织的继代周期分别为 30 d，接种于愈伤组织继代培养基上进行培养。培养条件与初代愈伤组织培养条件相同。1.2.4 植物激素的配置 1 mg/ml-萘乙酸（NAA）配制方法：取 30 mg NAA 置于容器中，先加 2 mL无水乙醇，充分溶解后再加 28 mL 去离子水。2 mg/mL 2,4-D 配置方法：取 2,4-D 固体 60 mg，先用微量的无水乙醇溶解，溶解后加入 30 mL 水，水浴加热至溶解，常温或 4 保存。1 mg/mL 6-BA配制方法：取 6-BA 30 mg，先用微量 1 mol/L NaOH 溶解，后加入 30 mL 去离子水，常温或 4 保存。1.2.5 培养条件 黑暗环境，温度为 25 1，培养时间 30 d。1.2.6 愈伤组织的分化培养 将胚性愈伤组织接种到分化培养基上进行芽再生培养。愈伤组织诱导芽再生的培养基配方采 MS 培养基，添加激素为 3.0 mg/L 的 6-BA。同时培养基中添加蔗糖（30 g/L）和琼脂（7 g/L），pH=5.8。培养基于高压蒸汽灭菌锅中 121 下灭菌 21 min 后取出放置备用。分化培养共 120 d，每 30 d 继代 1 次，每个培养皿接种 20 5 块愈伤组织，重复 3 次，培养条件为光照培养，光照强度 200 molm-2s-1，光照时间 12 h/d，培养温度为 25 1。待分化培养结束后统计出芽率=分化出芽的愈伤组织块数/接种的总愈伤组织块数100%1.2.7 试管苗诱导形成试管鳞茎 愈伤组织经分化形成不定芽，待其高度达到 35 cm 时，接入另一种固体培养基中（MS，120 g/L 的蔗糖，7 g/L 的琼脂，pH=7.5）诱导生成试管鳞茎，培养条件为光照培养，光照强度 200 molm-2s-1，光照时间 12 h/d，培养温度为 251。培养 6 周左右，试管鳞茎基本成熟，从培养瓶中将其取出，洗去表面培养基，于阴凉处晾干。将收获的试管鳞茎放置在4 下 1 个月，打破休眠，然后栽种在花盆中，待萌发后统计萌发率。萌发率=萌发的试管鳞茎数/栽种的试管鳞茎数100%。1.2.8 试管苗诱导生根及移栽 生根培养基为 MS 基础培养基，添加 30 g/L 的蔗糖、7 g/L 的琼脂，pH=5.86.0，不添加任何激素。将丛生的试管苗分割成单个的试管苗，去除枯叶及死叶，用无菌水冲洗干净基部的培养基，转移至生根培养进行生根培养，培养大约 40 d，注意观察记录生长状况并统计生根率。生根率=接种苗数/生根苗数100%。待生根后的试管苗长至 3 片真叶，生根 34 条时进行移栽。育苗钵的规格为 810 cm，育苗基质为珍珠岩、蛭石、泥炭土（1:3:6）混合均匀制得的。育苗钵中装 2/3 的育苗基质，灭菌；生根的试管苗从育苗瓶中取出，用无菌水把基部和根上的培养基冲洗干净移栽至准备好的育苗钵中，保持培养基质湿润，用保鲜膜将材料封起来，23 d 后逐渐去掉保鲜膜。先放至在弱光条件下，长至有新叶生出时再放置在正常光照条件下培养。最后统计移栽成活率，移栽成活率=移栽苗数/移栽成活苗数100%。1.2.9 CRISPR-Cas9 敲除载体的构建（1）利用 2 对引物扩增带有两个敲除靶点的片段。先以 SV-Cas9 载体为模板，用引物 MT1T2-F0 和 MT1T2-R0 扩增，回收 PCR 产物做模板，再用 CAP-F 和CAP-R 引物扩增，回收 PCR 产物“目的片段”，用于载体构建。PCR 的反应程序为：预变性 95 3 min，变性 95 15 s，退火 58 15 s，延伸 72 30 s，彻底延伸 72 5 min，35 个循环。PCR反应体系如表 4。第 3期牛忠露等:大蒜遗传转化体系建立与 CRISPR-Cas9敲除蒜氨酸酶基因研究323（2）HpaI 单酶切 SV-Cas9 载体，回收载体片段（长度约 18 000 bp）。按表 5 所列的反应体系混合制样，然后轻弹、混匀、短暂离心，再去磷酸化：将样品置于 37 30 min，加 1 L FastAp 置于 37 15 min，然后置于 85 5 min。用 1%的琼脂糖凝胶电泳与原质粒进行对照。（3）利用同源重组，将目的片段和载体片段按表 6 连接反应体系制样，然后置于 50 50 min进行连接。取已在冰上解冻的大肠感受态细胞 50 L，在超净工作台中加入 10 L 重组产物，缓慢吸打混匀后于冰上放置 30 min，随后 42 热激 4560 s，冰浴 5 min；接着在超净工作台内加入600 L LB 培养基，37，200 rpm/min 振荡培养 1 h 30 min；培养好的大肠杆菌 4 000 rpm 离心 4min，然后于超净工作台内弃去上清液，将剩余的菌液用移液枪吸打混匀，涂板（含抗生素），37 倒置培养过夜；然后挑取平板上长出的单菌落在抗性板上划线，同时进行 PCR 鉴定，PCR 反应程序同上，PCR 反应体系按表 7 制样。筛菌测序正确后转化农杆菌。表表 4 PCR 反应体系反应体系Table 4 PCR reaction system试剂Reagent使用量Usage amountddH2O3.0 L2Phanta Max Buffer5.0 LDNTP Mix（10 mM each）0.2 L上游引物（10 mM）0.4 L下游引物（10 mM）0.4 LPhanta Max Super-Tidelily DNAPolymeras0.2 L模板 DNA0.8 LTotal10.0 L表表 5 HpaI 单酶切反应体系单酶切反应体系Table 5 HpaI single enzyme digestion reaction system试剂Reagent使用量Usage amountddH2O8.0 LHpaI 单切酶1.0 LHpaI 单切酶 Buffer1.0 LDNA8.0 LTotal18.0 L表表 6 连接反应体系连接反应体系Table 6 Linkage reaction system试剂Reagent使用量Usage amount同源重组酶5.0 L目的片段 DNA1.0 L载体 DNA5.0 LTotal11.0 L表表 7 PCR 反应体系反应体系Table 7 PCR reaction system 试剂Reagent使用量Usage amountddH2O4.0 L2Rapid Taq Master Mix5.0 L正向引物0.4 L反向引物0.4 L模板 DNA0.2 LTotal10.0 L324山东农业大学学报(自然科学版)第 54卷1.2.10 CRISPR-Cas9 载体转农杆菌（1）取农杆菌感受态细胞（GV3101、LBA4404 和 EHA105）10L，在超净工作台中加入 3 L 带有目的片段的质粒 DNA，冰冻 30 min。（2）置于液氮中冷冻 1 min，取出后再 37 水浴 5 min。（3）在超净工作台中，向已处理的农杆菌中加入 700 L 无抗生素、无 Rif 的 LB 培养基。28，200 rpm/min 振荡培养 4 h 至浑浊。（4）7 0008 000 rpm离心 1 min，然后转移至超净工作台内弃去上清液，将剩余的菌液用移液枪吸打混匀，涂板（LB+Rif+抗性），28 培养至少 36 h。（5）挑取平板上长出的单菌落在抗性平板上划线，同时进行 PCR 鉴定。PCR 反应程序同上，PCR 反应体系按表 7 制样。1.2.11 农杆菌侵染愈伤组织（1）农杆菌的活化：挑取阳性的菌落于 5 L LB 液体培养基（含抗性）中，28 200 rpm/min 振荡过夜培养；然后将上述 5 L 菌液加在 10 mL LB 液体培养基（含抗性）中，置于同样的环境中培养至看起来磨砂状；再将 10 mL 菌液加在 50 mL LB 液体培养基（含抗性）中，置于同样的环境中培养至菌液 OD600值在 12 之间。（2）农杆菌侵染愈伤组织：将活化得到的菌液进行离心，转速为 5 000 rpm 5 min。离心结束后，倒掉上清，然后向离心管中加入侵染液，用移液枪吸打至菌体重新悬浮至菌液 OD 值在 0.40.6之间。将已切开的愈伤组织加到混匀后的菌液中，振荡摇晃侵染 15 min、30 min 和 45 min；随后用滤纸吸取多余的菌液，将愈伤组织重新依次排列在有滤纸的共培养基中，置于 25 的恒温暗培养箱中培养 3 d。1.2.12 已侵染愈伤组织的筛选 用无菌水制成含有 500 mg/L Cef 的抑菌液，在超净工作台内用抑菌液将共培养后的愈伤组织震荡冲洗 35 次至抑菌液完全澄清为止，再用无菌水冲洗 23 遍。然后将愈伤组织倒出到灭菌滤纸上吸干水分，再将愈伤组织转移到筛选培养基上，25 暗培养，每两周继代 1 次，并统计抗性愈伤率=（抗性愈伤/愈伤总数）100%。所使用的共培养基组成为 MS+2.0mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA+100 M As，筛选培养基组成为 MS+2.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA+100 M As+400 mg/L Cef+250 mg/L Basta。1.2.13 筛选后的愈伤组织再生形成转基因植株 把经两次筛选之后仍存活的愈伤组织转移到 MS+3.0mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+400 mg/L Cef+250 mg/L Basta 上进行诱导分化培养。待出芽后转移到生根培养基上进行生根培养，生根培养操作及所用培养基组成同 2.2.3 一样，待生根后的试管苗长至 3 片真叶，生根 34 条时进行移栽，移栽成活后即可对植株进行鉴定。1.2.14 转基因植株 PCR 分别取转基因植株的叶片，用 CTAB 法提取基因组。（1）将 2%CTAB 放置于水浴锅中 65 预热，取大蒜材料于离心管中。（2）液氮研磨破碎大蒜材料后，加入 600 L 2%CTAB 混匀，65 水浴 30 min，每 58 min颠倒 1 次。（3）于通风橱中加入 500 L 氯仿：异戊醇（24:1）混合液，混匀。（4）13 000 rpm离心 10 min，转移上清液至新的 1.5 mL 离心管中。（5）重复步骤（3）、（4）。（6）加入 400 L 异丙醇，颠倒混匀，-20 放置 20 min。（7）13 000 rpm离心 10 min，弃上清。（7）加入 1 mL 75%乙醇颠倒混匀洗涤沉淀，吸出乙醇，7 500 rpm离心 5 min，吸弃剩余乙醇。（9）重复步骤（8），吹干沉淀。（10）根据沉淀的量加入 50100 L ddH2O，4 过夜溶解并保存。以 提 取 的 基 因 组 为 模 板，以 载 体 上 的 抗 性 Basta 基 因 设 计 引 物，上 游 引 物ATGAGCCCAGAACGACGCC，下游引物 AATCTCGGTGACGGGCAGGA 进行 PCR 检测。按表 7制样，PCR 的反应程序为：预变性 95 3 min，变性 95 15 s，退火 58 1 5s，延伸 72 30 s，彻底延伸 72 5 min，30 个循环。PCR 产物于 1.0%琼脂糖凝胶电泳分析。第 3期牛忠露等:大蒜遗传转化体系建立与 CRISPR-Cas9敲除蒜氨酸酶基因研究325接下来对转基因植株进行突变位点检测。以转基因植株的基因组为模板，在突变位点前后设计引物进行 PCR 扩增。按表 7 制样，PCR 的反应程序为：预变性 95 3 min，变性 95 15 s，退火58 15 s，延伸 72 30 s，彻底延伸 72 5 min，35 个循环。PCR 产物于 1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，条带正确的 PCR 产物进行测序。1.2.15 转基因植株荧光定量 PCR 分别取转基因植株和非转基因植株的叶片，用 Trizol 法提取总RNA。（1）将清洗干净并擦干的研钵、研磨棒、药匙用锡纸包裹，放入烘箱 180，4 h。RNA 提取过程中使用的 1.5 mL 离心管、枪头均用报纸包裹后，121 高压蒸汽灭菌 50 min，灭菌后烘干备用。操作过程中，戴口罩手套避免 RNA 被污染降解。（2）先用液氮预冷研钵及研磨棒，加入大蒜组织样品后迅速液氮研磨 57 次，至研磨成粉末状，将研样迅速用预冷的药匙转移至预冷的离心管中。立即加入 1 mL 预冷过的 Trizol 和 10 L-巯基乙醇，涡旋震荡 12 min 混匀，静置 15 min，每隔 1 min 颠倒几下离心管，使样品与 Trizol 充分混匀。（3）12 000 g、4 离心 15 min，转移上清液至新的离心管，管内加入 300 L 氯仿，剧烈震荡15 s（禁止涡旋），静置 15 min。（4）12 000 g、4 离心 15 min，转移上清液至新的离心管，管内加入 450 L 异丙醇沉淀核酸，混匀后-20 静置 20 min。（5）12 000 g、4 离心 15 min，弃上清，加入 1 mL DEPC 水配制的 75%乙醇，反复颠倒洗涤沉淀，吸出乙醇。（6）重复 1 次洗涤沉淀，吸出乙醇后 7 500 g、4 离心 5 min，小心吸出剩余乙醇，超净工作台中 5 min 吹干沉淀。（7）根据沉淀的量加入 20-100 L DEPC 水回溶，溶解后分装出 10 L 进行后续 RNA 质量和浓度的检测，剩余 RNA 样品保存于-80。将提取的 RNA 进行反转录。按下表 8 配置混合液，用移液枪吸打混匀，置于 42 2 min，然后向离心管中直接加入 4 L 5HiScriptqRT SuperMix，吸打混匀后进行反转录反应：50 15 min；85 15 s。以大蒜的 actin 基因序列作为内参设计引物，扩增 actin 基因序列的正向引物和反向引物分别为ACTIN-F：ATCCAGACACTGTACTTGCGTTC 和 ACTIC-R：TGGAGGATCAACTATGTTTCCTG。扩增叶片蒜氨酸酶基因的正向引物和反向引物分别为 Real-F：GCAGCCTATGCATATACCTT 和Real-R：GATTCCCATCAATTGCAAAA。按下表 9 配置荧光定量 PCR 的混合液，按表 10 的反应程序进行荧光定量 PCR。表表 8 反转录反应体系反转录反应体系Table 8 Retrotranscriptional response system试剂Reagent使用量Usage amountRNase-free ddH2OTo 16 L4gDNA wiper Mix4 L模板 RNATotal RNA:1PG-1 gTotal16 L表表 9 荧光定量荧光定量 PCR 反应体系反应体系Table 9 Fluorescence quantitative PCR reaction system试剂Reagent使用量Usage amountddH2O5.2 LSYBR Green Mix10.0 L正向引物0.4 L反向引物0.4 LcDNA4.0 LTotal20.0 L326山东农业大学学报(自然科学版)第 54卷表表 10 荧光定量荧光定量 PCR 反应程序反应程序Table 10 Fluorescent quantitative PCR reaction program试剂Reagent时间Time95 30 s95 10 s60 30 s65 5 s3 GOTO 2循环 40次1.2.16 转基因植株蒜氨酸酶活检测 转基因植株蒜氨酸酶活的检测采用丙酮酸法，原理是：在蒜氨酸酶的作用下，1 分子的蒜氨酸发生反应会生成 2 分子丙酮酸，酮酸可与 2,4-二硝基苯肼反应得到丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，在碱性条件下丙酮酸-2,4-二硝基苯腙呈现红棕色，并在 520 nm 处有特定的吸收峰，因此可以通过丙酮酸的生成量来判断蒜氨酸酶活力。在 30 下蒜氨酸酶活性最强，所以将 30 下催化蒜氨酸酶和蒜氨酸发生反应，每分钟产生的 1 mol 丙酮酸定义为 1 个活力单位（U）。标准曲线的绘制：取 1 mL 不同浓度的丙酮酸溶液，分别向其中加入同体积的 0.1%的 2,4-二硝基苯肼，充分混合摇匀使其发生反应，然后加入 2 mL 的 1.5 mol/L NaOH 混合均匀，静置 10-15 min 后用紫外分光光度计在 520 nm 处测吸光值，收集数据绘制成标准曲线。粗酶液的制备：取转基因大蒜和非转基因大蒜的叶片各 3 g，分别加入 5%EDTA、10%甘油、提前在 4 下保存的pH=7.0 的磷酸缓冲溶液，用最大的速度研磨 1 min 成浆，然后 3 000 g 冷冻离心 20 min，保留上清液，接着用 45%的硫酸铵溶液盐析，缓慢搅拌 20 min，于 4 下静置 1 h，10 000 g 冷冻离心 30min，将滤饼用 3 mL 磷酸缓冲溶液重悬，即得到蒜氨酸酶的粗酶液。丙酮酸法测定酶活性：取 1mL 蒜氨酸酶的液加入 2 mL 50 mmol/L 的蒜氨酸混合均匀后置于 30 下反应 5 min，然后加入 3mL 三氯乙酸来终止反应，接着向其中加入 1.5 mL 0.1%的 2,4-二硝基苯肼，充分混合后再加入 15mL 0.5 mol/L NaOH 混匀显色，用紫外分光光度计在 520 nm 处测吸光值，根据吸光值计算丙酮酸浓度和酶活力。2结果与分析结果与分析2.1大蒜愈伤组织再生体系的建立大蒜愈伤组织再生体系的建立2.1.1 在外植体层面探讨基础培养基对愈伤组织诱导的影响 选取大蒜的茎尖、鳞芽基部、贮藏叶和根尖作为外植体，通过 30 d 的愈伤诱导培养，对 MS、B5、N6 和 SH 基础培养基的影响进行探究。4 个部位在 MS、B5、N6 和 SH 基础培养基的诱导情况如图 2A 所示。实验观察发现，贮藏叶和茎尖没有愈伤组织产生，茎尖在接种后会不断生长成芽（图 2Aa），贮藏叶会逐渐膨大至原体积的 2-3 倍大（图 2Ad），鳞芽基部可以观察到有愈伤组织在茎盘组织和贮藏叶间隙长出，产生愈伤组织的部位和根尖萌出的部位相同（图 2Ab），对于大部分根尖来说都可以诱导出愈伤组织（图 2Ac），极少数会在根尖的两端产生愈伤组织，如果在根尖中部人为的制造伤口则会在根尖中段形成愈伤组织。所以根尖和鳞芽基部是进行大蒜愈伤诱导的理想外植体。根尖和鳞芽基部在 MS、SH、B5 基础培养基上培养获得的愈伤组织的质地一致，均为黄色或淡黄色、结构致密、呈颗粒性的愈伤组织（图 2Ab 和图 2Ac）。但是 N6 基础培养基上培养获得的愈伤组织均呈现糜状，且质地软烂、结构疏松（图 2Ae 和图 2Af），是不能再生成植株的愈伤组织，可见 N6 基础培养基是最不适合进行大蒜愈伤诱导的。图 2B 统计了成熟期鳞芽基部和根尖在 MS、SH、B5 上的愈伤诱导率。根尖的愈伤诱导率高于鳞芽基部，通过对数据的分析可知，3 种基础培养基（MS、SH、B5）对根尖和鳞芽基部愈伤诱导的影响无显著性差异（P0.05），根尖在 3 种基础培养基上的愈伤诱导率在 6080%之间；鳞芽基部在 MS 和 SH 基础培养基上的愈伤诱导率在 4060%，在 B5 基础培养基上的愈伤诱导率在1830%之间。这 3 种基础培养基对鳞芽基部有较明显的影响，趋势为 MS 和 SH 的愈伤诱导效果相第 3期牛忠露等:大蒜遗传转化体系建立与 CRISPR-Cas9敲除蒜氨酸酶基因研究327近，二者的效果优于 B5。造成这种现象的原因可能是根尖的分生能力比鳞芽基部强，以至于在相同激素配比下根尖的愈伤诱导效果优于鳞芽基部。图图 2 不同外植体部位愈伤诱导状态及愈伤诱导率统计图不同外植体部位愈伤诱导状态及愈伤诱导率统计图Fig.2 Callus induction status maps of different explants and statistical plots of callus induction rate（A）不同外植体部位愈伤诱导状态图；（a）茎尖；（b）在 MS 上诱导的鳞芽基部愈伤组织；（c）在 MS 上诱导的根尖愈伤组织；（d）贮藏叶；（e）在 N6 上诱导的鳞芽基部愈伤组织；（f）在 N6 上诱导的根尖愈伤组织；（B）根尖和鳞芽基部的愈伤诱导率统计图。每列字母相同者表示差异未达显著水平（P0.05），字母不同者表示差异达显著水平（P0.05）。（比例尺：2 mm）。(A)Callus induction status maps of different explants;(a)Stem tip;(b)Callus induced at the base of garlic clove on MS;(c)Root tip callusinduced on MS;(d)Storage leaf;(c)Callus induced at the base of garlic clove on N6;(d)Root tip callus induced on N6;(B)Statistical plots of callusinduction rate at root tip and base