创伤弧菌VV106的分离鉴定及其生物学特性分析.pdf

为研究斜带石斑鱼致病菌VV106的生物学特性，对其进行菌株鉴定、理化因素对生长的影响和药敏性分析.结果表明：VV106为创伤弧菌，具有典型的海洋细菌特征，最适生长温度为30、氯化钠浓度为3%、pH值为8.创伤弧菌VV106对硫酸新霉素、氨苄青霉素、磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶和多西环素耐药，对甲砜霉素、氟苯尼考、硫酸卡那霉素、恩诺沙星、盐酸土霉素、磺胺二甲氧嘧啶和交沙霉素敏感.在1/2 MIC氟苯尼考、恩诺沙星和交沙霉素条件下分别诱导获得了Flo20、Enr20和Jos20，它们不仅具有稳定可遗传的耐药性，而且交叉耐药比率分别为75%、50%和62.5%.本研究可为防治创伤弧菌引起的疾病、指导精准用药、提高水产养殖经济效益奠定基础.关键词：创伤弧菌；菌种鉴定；药敏性；生物学特性中图分类号：S917.1 文献标志码：A 文章编号：2095-7122（2023）02-0101-09Identification and biological characteristics of Vibrio vulnificus VV106ZHANG Danfeng,ZHU Qiuqiang,HU Yuanqing,ZHU Dining,WU Cai(School of Biological Science and Biotechnology,Zhangzhou,Fujian 363000,China)Abstract:In order to study the biological characteristics of the pathogenic bacteria VV106 from Epinephelus coioides,identification of strain,the influence of physical and chemical factors on the growth and analysis of drug susceptibility were carried out.The results showed that VV106 was identified as Vibrio vulnificus and had typical characteristics of marine bacteria.The optimum growth temperature was 30,the optimum growth sodium chloride concentration was 3%,and the optimum growth pH was 8.Vibro vulnificus VV106 was resistant to neomycin sulfate,ampicillin,sulfadiazine,sulfamonomethoxine and doxycycline,but sensitive to thiamphenicol,florfenicol,kanamycin sulfate,enrofloxacin,oxytetracycline hydrochloride,sulfadimethoxine and josamycin.Flo20,Enr20 and Jos20 were induced under the conditions of 1/2 MIC of florfenicol,enrofloxacin and josamycin,respectively.They not only had stable and heritable drug resistance,but also had cross-resistance rates of 75%,50%and 62.5%,respectively.This study can lay a foundation for preventing and treating diseases caused by Vibrio vulnificus,guiding precise medication,and improving the economic benefits of aquaculture.Key words:Vibrio vulnificus;identification of strain;drug susceptibility;biological characteristics创伤弧菌(Vibrio vulnificus)属于弧菌科弧菌属，革兰氏阴性细菌，有极端单鞭毛，在选择性硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基（thiosulfate citrate bile salts sucrose agar,TCBS）上呈绿色菌落.它是一种致命的人类条件致病菌，临床症状主要表现为坏死性筋膜炎、败血病、脓毒症和严重的创口感染等1-2，这是一种重要的水生环境和水产品污染病原菌，可使许多种经济动物患病，包括石斑鱼3.漳州是“中国石斑鱼之都”，主要的养殖品种有斜带石斑、云龙石斑、虎龙杂交斑、青石斑、老虎斑等近20种，收稿日期：2023-02-01基金项目：福建省自然科学基金项目(2020J01809,2021J01995)；福建省教育厅中青年教师教育科研项目(JAT190358)作者简介：张丹凤(1979)，女，福建泉州人，博士，教授.2023年闽南师范大学学报（自然科学版）已经形成从种苗繁育、养殖到销售完整的产业链4.2021年，漳州石斑鱼养殖面积 2333.3公顷，养殖产量 17 900 t，产值 22.1亿元，位列全国第一.虽然斜带石斑鱼是漳州主要的石斑鱼养殖品种之一，但是目前还没有关于斜带石斑鱼源创伤弧菌及其生物学特性的相关报道.本论文重点对斜带石斑鱼源创伤弧菌VV106进行菌株鉴定、理化因素对其生长的影响和药敏性分析，旨在为水产健康养殖提供理论依据.1 材料和方法1.1 实验材料1.1.1 菌株从行动迟缓、体表局部出血、鳍基部发炎的斜带石斑鱼肾脏中分离纯化得到的优势菌株VV106.1.1.2 培养基TCBS培养基：5 g酵母浸粉、10 g蛋白胨、10 g硫代硫酸钠、10 g枸橼酸钠、5 g牛胆粉、3 g牛胆酸钠、20 g蔗糖、10 g氯化钠、1 g柠檬酸铁、0.04 g溴麝香草酚兰、15 g琼脂，1 L蒸馏水，pH值为8.6 0.1.LB培养基（Luria-Bertani,LB）：10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g氯化钠，1 L蒸馏水，pH值为7.0.LB琼脂培养基在上述配方中加入15 g 琼脂.MH肉汤培养基（mueller-hinton broth,MB）：2 g牛肉粉、1.5 g可溶性淀粉、17.5 g酸水解酪蛋白，1 L蒸馏水，pH值为7.4 0.2.1.1.3 主要试剂Premix Taq、DL2,000 DNA Marker等采购自宝日医生物技术（北京）有限公司.盐酸、氢氧化钠、氯化钠等购自国药集团化学试剂有限公司.引物和12种常用渔业抗菌药物：甲砜霉素、氟苯尼考、硫酸新霉素、硫酸卡那霉素、恩诺沙星、氨苄青霉素、盐酸土霉素、磺胺嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、交沙霉素和多西环素，购自生工生物工程(上海)股份有限公司.1.2 实验方法1.2.1 斜带石斑鱼致病菌的分离对采集的斜带石斑鱼低温保存运送至实验室，用酒精棉擦拭石斑鱼体表，接种环蘸取石斑鱼肾脏组织，于TCBS培养基上平板划线，30 培养18 h后，挑取绿色优势单菌落VV106进行进一步的分离纯化.1.2.2 16S rRNA基因鉴定采用煮沸裂解法提取 VV106基因组 DNA，并利用正向引物 27F:5-AGA GTT TGA TC(C/A)TGG CTC AG-3，和反向引物1492R:5-GG TTA CCT TGT TAC GAC TT-3，进行16S rRNA基因扩增.根据电泳结果，将目的条带大小约1.5 kbp的PCR产物送往苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，并将测序结果进行BLAST分析.1.2.3 理化因素对VV106生长的影响为了了解不同理化因素对VV106生长特性的影响，将VV106接种于氯化钠浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%的LB琼脂培养基上、pH值分别为4、5、6、7、8、9、10、11、12的LB琼脂培养基上，每个浓度重复3次，30 培养24 h后观察VV106的生长情况，以此来确定VV106的生长氯化钠浓度范围和pH值范围.根据 VV106 生长的氯化钠浓度范围和 pH 值范围，配置相应的 LB 培养基，接种对数生长期VV106至波长 600 nm 处吸光值（absorbance,A）为 0.02，30、220 r/min 振荡培养 4 h 后测定 A600，每个102张丹凤，等：创伤弧菌VV106的分离鉴定及其生物学特性分析第2期浓度重复 3次.以不同盐浓度或pH值为横坐标、A600为纵坐标绘制生长曲线，判断VV106生长的最佳氯化钠浓度或pH值.为了进一步了解VV106的生长温度范围，接种VV106至LB琼脂培养基，分别置于20、25、30、35、40、45、50、55 下培养 24 h.在此基础上，对其进行 LB 液体培养，使其起始 A600为 0.02，在不同温度下、220 r/min振荡培养4 h，每个温度重复3次.以不同温度为横坐标、A600为纵坐标绘制温度生长曲线，分析VV106在不同温度下的生长情况.1.2.4 VV106药敏性的检测采用二倍稀释法测定药敏性，以创伤弧菌 ATCC27562 作为对照.首先在 96 孔板的第 1 列中加入200 L 含 200 g/mL 抗菌药物的 MHB，紧接着在第 210 列内加入 100 L MHB，第 11 列孔内加入200 L MHB 作为空白对照.从第 1 列中吸取 100 L 抗菌药物到第 2 列中，反复吹吸均匀，再移取100 L至第3列中，依次稀释到第10列.吸取对数生长期VV106稀释至A600为0.02的菌液100 L，分别加入到第 1 列至 10 列的孔中，第 12 列孔中加入 200 L 的稀释菌液作阳性对照.每种抗菌药物重复 3次.30 培养24 h，利用全波长酶标仪进行测定，确定不同抗菌药物的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）.1.2.5 VV106传代诱导选取3种VV106敏感的抗菌药物：氟苯尼考、恩诺沙星和交沙霉素，分别在它们1/2 MIC条件下对VV106进行传代培养，每代培养12 h，连续传代20代，将获得的第20代菌株分别命名为Flo20、Enr20、Jos20.同时将VV106在未添加任何抗菌药物的LB培养基中同步传代20代，第20代菌株命名为VV106-20.按照1.2.4的方法，对每代传代菌株进行相应抗菌药物MIC测定，观察它们MIC是否发生变化.如果VV106-20 MIC未发生变化、且诱导后菌株MIC与原始出发菌株VV106 MIC比值大于等于4倍的话，则诱导菌株产生了耐药性.为了验证Flo20、Enr20和Jos20耐药性的稳定性，在未添加抗菌药物的LB琼脂培养基上进行平板划线，连续划线10次，分别将它们的第10代菌株进行相应抗菌药物的MIC测定，并与原始Flo20、Enr20、Jos20的MIC进行比较，以此判断耐药性的遗传稳定性.1.2.6 传代菌株交叉耐药性的测定培养 Flo20、Enr20和 Jos20至对数生长期，按照 1.2.4的方法对除了磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、多西环素外的 9种抗菌药物进行 MIC测定和交叉耐药的判定.交叉耐药的标准为药物诱导后菌株对非诱导药物的 MIC比诱导前升高至少 4倍.参照张凯等5的方法分析交叉耐药比率，比较它们的交叉耐药程度.2 实验结果与分析2.1 VV106病原菌株鉴定将斜带石斑鱼肾脏样品接种于TCBS上，由图1可见，在TCBS培养基上的菌落颜色为有黄色和绿色.因为创伤弧菌在TCBS培养基上为绿色，所以挑取绿色的优势单菌落，进行平板划线获得纯化的单菌落VV106.利用27F引物和1492R引物对VV106进行16S rRNA基因PCR扩增，如图2所示，在1.5 kbp处出现了目的条带.目的条带测序结果在NCBI上进行BLAST比对，与其同源性最高的为创伤弧菌，相似性高达99.96%.因此，判断VV106为创伤弧菌.1032023年闽南师范大学学报（自然科学版）2.2 理化因素对VV106生长的影响2.2.1 氯化钠浓度创伤弧菌VV106在氯化钠质量分数为1%8%的LB琼脂培养基上培养24 h后，发现它生长的氯化钠浓度范围为1%6%，但在6%条件下，只有少数几个小菌落生长.在含1%6%氯化钠LB液体培养基中培养4 h（见图3），氯化钠质量分数为3%，VV106生长情况最好；VV106在6%氯化钠的LB中培养4 h还未见生长，可能是因为培养时间较短和6%氯化钠质量分数太高引起的，当培养时间延长至8 h，其吸光值为0.112，说明VV106在6%氯化钠浓度条件下生长相对缓慢，与LB琼脂结果相一致.根据最佳生长氯化钠质量分数可以看出，VV106为弱嗜盐菌.图1 斜带石斑鱼肾脏分离的菌落Fig.1 Colonies isolated from kidney of Epinephelus coioides注：M为DNA marker DL2 000；1为16S rRNA基因PCR扩增产物.图2 16S rRNA基因PCR扩增产物Fig.2 PCR product of 16S rRNA gene图3 氯化钠质量分数对创伤弧菌VV106生长的影响Fig.3 The effect of sodium chloride concentration on the growth of Vibrio vulnificus VV106A600氯化钠质量分数/%104张丹凤，等：创伤弧菌VV106的分离鉴定及其生物学特性分析第2期图4 pH值对创伤弧菌VV106生长的影响Fig.4 The effect of pH value on the growth of Vibrio vulnificus VV1062.2.2 pH值在LB琼脂培养基上培养24 h，创伤弧菌VV106在pH值为4、5、11和12都未见生长，在pH值为6 10都可以生长，相较而言pH值为6和10时，生长情况不佳，只形成几个直径约为1 mm左右的单菌落.在LB液体培养基中，pH值为8时，VV106长势最好（图4）.但在pH值为6和10时，生长速度极其缓慢.因此，VV106最适生长pH值为8.2.2.3 生长温度在LB琼脂培养基上培养24 h，创伤弧菌VV106在2045 均可生长，但是在50、55 条件下未长出菌落.在LB中，当温度在2030 之间，创伤弧菌VV106的生长情况随着温度的升高，长势逐渐变好，但是当温度在3045 之间，情况与之相反（图5）.相比较之下，VV106最适生长温度为30.根据不同细菌对温度的要求和VV106最适生长温度可以判断，VV106是1株嗜温菌.图5 温度对创伤弧菌VV106生长的影响Fig.5 Effect of temperature on the growth of Vibrio vulnificus VV1062.3 VV106药物敏感性采用二倍稀释法，分析12种抗菌药物对创伤弧菌VV106的MIC，同时用创伤弧菌ATCC27562作为对照，结果如表1所示.磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、多西环素这3种抗菌药物对2株创伤弧菌的MIC都超过A600A600温度/值1052023年闽南师范大学学报（自然科学版）表1 创伤弧菌VV106药敏性Tab.1 Drug susceptibility of Vibrio vulnificus抗菌药物甲砜霉素氟苯尼考硫酸新霉素硫酸卡那霉素恩诺沙星氨苄青霉素盐酸土霉素磺胺嘧啶磺胺二甲氧嘧啶磺胺间甲氧嘧啶交沙霉素多西环素MIC/(g/mL)创伤弧菌ATCC275626.251.5625250.10500.101000.031000.39100创伤弧菌VV1061.560.78251.560.10500.391000.031000.781002.4 创伤弧菌VV106药敏性变化为了进一步探讨在低浓度抗菌药物培养条件下，创伤弧菌VV106对不同抗菌药物的药敏性是否会发生变化，选择VV106敏感的氟苯尼考、恩诺沙星、交沙霉素3种抗菌药物进行传代.相应抗菌药物对传代菌株Flo20、Enr20、Jos20 MIC分别比原始出发菌株VV106的MIC提高了8倍、32倍、4倍（图6至图8），分别为6.25、1.56、3.12 g/mL，而且VV106-20药敏性没有因为传代发生改变.因此，这3株传代菌株均为耐药菌株.创伤弧菌VV106在1/2 MIC氟苯尼考条件下传代至第10代时，MIC增加至6.25 g/mL，为原始出发菌株MIC的8倍.但是第11代和第12代MIC值下降至3.12 g/mL，这可能是其药敏性还未稳定所引起的，但是第13代又上升至6.25 g/mL.创伤弧菌VV106在1/2 MIC恩诺沙星条件下，传代至第3代、第6代、第10代和第19代时，MIC不断增加，分别是原来的2倍、4倍、8倍和16倍.创伤弧菌VV106在1/2 MIC交沙霉素条件下，传代到第5代和第15代时MIC分别增加了2倍和4倍.这些结果表明长期低剂量使用抗菌药物，容易引起创伤弧菌耐药性的产生，不利于相关疾病的防控.因此，用药过程中要特别注意药物用量和使用次数.为了验证Flo20、Enr20、Jos20耐药性是否稳定，在无添加抗菌药物的LB琼脂培养基上连续传代10代100 g/mL.硫酸新霉素、恩诺沙星、氨苄青霉素、磺胺二甲氧嘧啶4种抗菌药物对2株创伤弧菌的MIC一样，分别为25、0.10、50、0.03 g/mL.甲砜霉素、盐酸土霉素对创伤弧菌ATCC27562的MIC皆大于其对创伤弧菌VV106的MIC，是它们的4倍.氟苯尼考对创伤弧菌ATCC27562 MIC是其对创伤弧菌VV106 MIC的2倍，而交沙霉素对创伤弧菌ATCC27562 MIC是其对创伤弧菌VV106 MIC的1/2.硫酸卡那霉素对创伤弧菌ATCC27562和VV106 MIC分别为25、1.56 g/mL.根据美国临床实验室标准委员会（CLSI）标准判定，这2株创伤弧菌均对盐酸土霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、交沙霉素和磺胺二甲氧嘧啶敏感，对硫酸新霉素、氨苄青霉素、多西环素、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺嘧啶耐药；ATCC27562对硫酸卡那霉素中度敏感，VV106对硫酸卡那霉素敏感.因此，在水产养殖上建议采用甲砜霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、盐酸土霉素、磺胺二甲氧嘧啶、交沙霉素控制创伤弧菌引起的感染.106张丹凤，等：创伤弧菌VV106的分离鉴定及其生物学特性分析第2期后，第10代菌株都与起始Flo20、Enr20、Jos20一样，相应抗菌药物MIC没有发生变化.说明它们都获得了稳定的耐药性，进一步表明在水产养殖时应科学规范地使用抗菌药物.01234567890123456780 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920MICMIC增加倍数MIC/(g/mL)传代代数图6 在1/2 MIC氟苯尼考条件下创伤弧菌VV106药敏性的变化Fig.6 The alteration of drug susceptibility of Vibrio vulnificus VV106 under the 1/2 MIC of florfenicol图7 在1/2 MIC恩诺沙星条件下创伤弧菌VV106药敏性的变化Fig.7 The alteration of drug susceptibility of Vibrio vulnificus VV106 under the 1/2 MIC of enrofloxacin 01234012340 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920MICMIC增加倍数MIC/(g/mL)传代代数图8 在1/2 MIC交沙霉素条件下创伤弧菌VV106药敏性的变化Fig.8 The alteration of drug susceptibility of Vibrio vulnificus VV106 under the 1/2 MIC of josamycin1072023年闽南师范大学学报（自然科学版）创伤弧菌VV106传代后的耐药菌株交叉耐药现象明显：Flo20对供试其他类抗生素耐药性提高最明显，平均交叉耐药比率为75%；Jos20交叉耐药性同样较为明显，平均交叉耐药率为62.5%；Enr20交叉耐药性相对较低，平均交叉耐药率为50%.3 结语创伤弧菌是水产养殖重要的病原菌之一，从漳州某养殖场斜带石斑鱼中分离和鉴定得到1株病原菌创伤弧菌VV106，其最适生长温度为30、最适生长氯化钠浓度为3%、最适生长pH值为8，是1株典型的海洋细菌.伴随着抗菌药物的广泛使用，创伤弧菌耐药性甚至多重耐药性不断暴发，给人类健康和水产养殖均带来了巨大的威胁.比如对多个水生环境的调查显示，来自受污染河流的创伤弧菌表现出较高的耐药性，而且具有五重耐药性6.对中国北方6个水族馆进行创伤弧菌流行病学调查，所有被调查的水族馆都分离到创伤弧菌，阳性率从20%到100%不等，分离出的12株创伤弧菌表现出不同程度的耐药性7.来自马来西亚血蛤和卡塔尔硬壳蛤的60株创伤弧菌，至少对2种抗生素具有耐药性，13%菌株具有8种抗菌药物耐药性，对盘尼西林、氨苄青霉素和头孢菌素的耐药率分别为93%、70%和65%8.分离的创伤弧菌VV106同样表现出较强的多重耐药性，对硫酸新霉素、氨苄青霉素、磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、多西环素耐药，特别是磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、多西环素，这与Baker-Austin等9研究的151株创伤弧菌部分药敏结果一致.这说明不应使用这5种抗菌药物防治创伤弧菌引起的疾病，而应选用甲砜霉素、氟苯尼考、硫酸卡那霉素、恩诺沙星、盐酸土霉素、磺胺二甲氧嘧啶和交沙霉素.建议水产养殖企业在条件允许的情况下应先开展药敏实验，再进行精准用药.如果MIC一样的情况下，不同种类抗菌表2 Flo20、Enr20和Jos20交叉耐药性Tab.2 Cross-drig resistance of Flo20,Enr20 and Jos20药物名称甲砜霉素氟苯尼考硫酸新霉素硫酸卡那霉素恩诺沙星氨苄青霉素盐酸土霉素磺胺二甲氧嘧啶交沙霉素MIC/(g/mL)VV1061.560.78251.560.10500.390.030.78Flo2012.56.251003.120.7820012.500.033.12Enr206.251.561001.561.5640012.500.051.56Jos206.251.561001.560.39400250.053.122.5 传代菌株交叉耐药性因为磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、多西环素对创伤弧菌 VV106 MIC 均大于 100 g/mL，所以只对Flo20、Enr20、Jos20测定除这3种抗菌药物之外其他9种药物的MIC，具体结果见表2.虽然Flo20、Enr20、Jos20产生了不同程度的交叉耐药，但是它们对硫酸卡那霉素、磺胺二甲氧嘧啶都未产生交叉耐药.在这9种抗菌药物中，这3株耐药菌株MIC都提高4倍及以上的抗菌药物有甲砜霉素、硫酸新霉素、恩诺沙星、氨苄青霉素、盐酸土霉素，其中盐酸土霉素的MIC提高幅度最大，分别为32倍、32倍和64倍.这也进一步说明了这3株传代菌株为多重耐药菌，而且耐药性比VV106更强.108张丹凤，等：创伤弧菌VV106的分离鉴定及其生物学特性分析第2期药物轮换使用，减少细菌耐药性的产生.在对创伤弧菌VV106进行传代诱导过程中发现，连续低剂量地使用敏感抗菌药物，创伤弧菌对它们也产生了耐药性，而且传代次数越多耐药性增强越显著.不仅如此，传代菌株Flo20、Enr20、Jos20还都产生了不同程度的交叉耐药，Flo20的交叉耐药程度最高，Enr20的交叉耐药程度最低.这些都说明，在使用抗菌药物时要一次性足量使用，避免连续低剂量地使用某一种抗菌药物.因此，水产养殖产业应该严格执行国家规定的用药制度，建立无公害的防治体系，践行“绿水青山就是金山银山”的理念.参考文献：1 黄春兰,余洪立,马丽梅.创伤弧菌感染1例J.中国感染与化疗杂志,2022,22(1):95-97.2 YUN N R,KIM D M.Vibrio vulnifcus infection:A persistent threat to public healthJ.Korean Journal of Internal 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