达格列净通过mTOR自噬信号通路改善糖尿病心肌炎症反应.pdf

微循环学杂 志():./.微循环学杂 志 年第 卷第 期基础与实验 达格列净通过 自噬信号通路改善糖尿病心肌炎症反应 林红满 陈庆贤 陈雪丽 中图分类号.文献标识码 文章编号 ()【摘要】目的:探究达格列净通过 自噬信号通路改善糖尿病心肌炎症反应 方法:分别在/小鼠和 细胞中建立糖尿病模型分为动物或细胞对照组、糖尿病组和达格列净组 超声心动图用于评估小鼠的心脏功能苏木精和曙红()染色评估心脏病理变化 染色检测间质纤维化免疫组织化学染色检测 和 蛋白印迹检测、和 蛋白的表达 结果:动物实验中与对照组比较糖尿病组/值、和 均下降 增高心肌细胞肥厚和细胞外基质增加间质纤维化区域增加 蛋白降低 水平升高 降低与糖尿病组相比达格列净组/值、和 增加 降低心脏纤维化减轻免疫组织化学染色和蛋白印迹检测结果显示 蛋白升高 水平降低 升高 细胞实验显示与对照组比较糖尿病组、水平升高 降低与糖尿病组比较达格列净组 、水平降低 升高差异均有统计学意义(.)结论:达格列净通过下调 自噬信号通路改善糖尿病小鼠心脏病理变化及心脏功能【关键词】达格列净自噬糖尿病心肌炎症 【】:.:/.().:/./.基金项目 海南省卫生健康科研基金项目()作者单位 海南西部中心医院儋州 药学部内分泌科本文 收到 修回 .(.).:.【】.微循环学杂 志 年第 卷第 期基础与实验 糖尿病是全球最常见和增长最快的疾病之一估计到 年将影响.亿成年人据报道 型糖尿病()和 患者心功能不全的患病率分别高达.和.心血管疾病是糖尿病患者死亡的主要原因约 的死亡率是由于冠状动脉疾病 发生心力衰竭的糖尿病患者其临床特征为糖尿病性心肌病()研究显示糖尿病是充血性心力衰竭的部分原因心肌病与糖尿病有关自噬为一种程序性细胞死亡包括错误折叠的蛋白质和受损物质(如线粒体和过氧化物酶体)的溶酶体依赖性降解在维持细胞稳态方面具有深远的意义 的发病机制很复杂相关研究显示高血糖引起的糖尿病心肌损伤与细胞内自噬的下调有关 达格列净是一种钠葡萄糖共转运蛋白()抑制剂是一种新型抗糖尿病药物被批准用于治疗 除了能有效控制血糖外达格列净还有助于减轻体重降低心血管死亡率 研究显示达格列净可以治疗高危糖尿病后心血管死亡改善心力衰竭同时降低收缩功能并且这些作用是独立于血糖控制来实现的 然而目前对达格列净心脏保护作用的机制了解较少因此本研究主要从细胞自噬方面探究达格列净改善糖尿病患者心肌炎症反应的作用机制 材料与方法.动物及分组本实验方案通过伦理委员会批准 所有雄性/小鼠(周龄和 体重)均从 实验动物中心购买在特定的无病原体条件下维持 的光暗循环 将/小鼠随机分配到三组:()动物对照组()喂食标准饮食()动物糖尿病组()采用高脂肪饮食(高脂肪饮食)饲养 周后连续 日腹腔注射链脲佐菌素(/天采用./柠檬酸钠缓冲液进行配制.美国)所有小鼠全部建模成功()动物达格列净组()在建立糖尿病模型后灌胃达格列净./天(中国)持续 周 对照组小鼠注射等体积柠檬酸盐缓冲液.心脏功能采用高分辨率超声心动图系统(加拿大)测量以下参数:收缩期和舒张期左心室射血分数()左心室分数缩短()左心室内径()和左心室后壁厚度()通过超声心动图和二尖瓣水平的脉冲多普勒测量早期()与晚期()心室充盈速度的比值(/比).细胞培养大鼠心脏成肌细胞 细胞(购自中国北京 )采用 的改良 培养基含有./正常葡萄糖()和 胎牛血清(比奥因德)培养 细胞待生长至 融合时进行如下分组和处理:()细胞对照组:采用低葡萄糖(.)培养()细胞糖尿病组:采用含 葡萄糖和.甘露醇()的 培养()细胞达格列净组:采用含 葡萄糖和 的达格列净的 培养 以上各组细胞均培养 后进行下列指标观察.蛋白印迹分析达格列净干预 周后麻醉(戊巴比妥/)各组小鼠快速取下心脏各组细胞培养 后收集细胞采用总蛋白提取试剂盒提取细胞或心脏组织总蛋白采用 试剂盒()检测蛋白浓度 使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳()分离蛋白质提取物并转移到聚偏氟乙烯膜(美国)于 下与针对/的一抗()()()和()共孵育过夜再与辣根过氧化酶标记的二抗室温孵育 化学发光信号被 试剂识别(美国)用 软件量化 以 为内参以目标蛋白与内参蛋白的灰度值比值作为目标条带的相对表达量.免疫组织化学染色达格列净通过 自噬信号通路改善糖尿病心肌炎症反应将福尔马林固定的心脏样品石蜡包埋制作石蜡切片()与针对 /()()和 ()的一抗孵育过夜 载玻片与适当的二抗孵育后用二氨基联苯胺()试剂盒检测、和 的点位/细胞数由两名独立检查员采用盲法计算 染色强度分为四个等级:无弱适中强.形态测量苏木精和曙红()染色:用于心脏形态的一般评估心肌组织石蜡切片脱蜡水化后用苏木精溶液染色 用 酸性乙醇(/乙醇)浸泡 次蒸馏水冲洗用伊红溶液染色 用分级酒精脱水二甲苯清洗使用显微镜(日本)检查并拍照 染色(美国):用于检测间质纤维化心肌组织切片苏木精染色蒸馏水洗涤 盐酸浸泡回蓝品红酸浸泡磷钼酸分化苯胺蓝再染最后酒精脱水密封使用光学显微镜和数字成像系统可视化图像.统计学处理采用 .统计软件进行分析所有计量资料以均值 标准差()表示多组间均数比较采用单因素方差分析两两比较采用 检验 .为具有统计学意义 结 果.各组小鼠心脏功能比较各组小鼠/值、和 水平差异有统计学意义(.)见图、表 图 各组大鼠 型超声心动图(上)和脉波多普勒超声心动图(下)检查心功能微循环学杂 志 年第 卷第 期基础与实验 表 各组糖尿病小鼠心脏功能变化()组 别/值()()()()动物对照组.动物糖尿病组.).).).).动物达格列净组.).).).).值.注:与动物对照组比较).与动物糖尿病组比较).林红满陈庆贤陈雪丽.各组糖尿病小鼠心脏病理变化 染色图像显示与动物对照组比较动物糖尿病组心肌细胞肥厚和细胞外基质增加 的三色染色显示与动物对照组相比动物糖尿病组的间质纤维化区域增加而动物达格列净组小鼠心脏纤维化程度较动物糖尿病组较轻 见图 免疫组化和蛋白质印记分析结果均显示各组 蛋白表达水平差异有统计学意义(.)见图、表 微循环学杂 志 年第 卷第 期基础与实验 图 各组小鼠心肌组织、染色和 的免疫组织化学染色(右下角比例尺代表)图 各组小鼠心肌组织 蛋白表达(蛋白质印迹)表 达格列净对糖尿病小鼠心脏病理变化的影响()组 别/(蛋白质印迹)蛋白(免疫组化)动物对照组.动物糖尿病组.).)动物达格列净组.).)值.注:与动物对照组比较).与动物糖尿病组比较).各组小鼠心肌组织、和 蛋白表达水平比较(蛋白质印迹)蛋白质印记分析结果显示各组小鼠心肌组织、和 蛋白表达水平差异均有统计学意义(.)见图、表 图 各组小鼠心肌组织、和 蛋白表达水平(蛋白质印迹)达格列净通过 自噬信号通路改善糖尿病心肌炎症反应表 各组小鼠心肌组织相关蛋白水平()组 别动物对照组.动物糖尿病组.).).)动物达格列净组.).).)值.注:与动物对照组比较).与动物糖尿病组比较).各组小鼠心肌组织 和 蛋白表达水平比较(免疫组化)免疫组化分析显示各组小鼠心肌组织 和 蛋白表达水平差异有统计学意义(.)见图、表 图 各组小鼠心肌组织 和 的免疫组织化学染色(右下角比例尺表示)微循环学杂 志 年第 卷第 期基础与实验 表 各组小鼠心肌组织相关蛋白水平(免疫组化)()组 别动物对照组.动物糖尿病组.).)动物达格列净组.).)值.注:与动物对照组比较).与动物糖尿病组比较).各组心肌细胞、和 蛋白表达水平比较(蛋白质印迹)蛋白质印迹分析显示各组心肌细胞、和 蛋白表达水平差异均有统计学意义(.)见图、表 图 各组心肌细胞、和 蛋白表达水平(蛋白质印迹)表 各组心肌细胞相关蛋白水平(蛋白质印迹)()组 别细胞对照组.细胞糖尿病组.).).)细胞达格列净组.).).)值.注:与细胞对照组比较).与细胞糖尿病组比较).林红满陈庆贤陈雪丽 讨 论糖尿病患者发生心血管疾病的可能性很高且发生心肌梗死、卒中或心力衰竭的风险增加一旦心血管疾病发展与非糖尿病患者相比糖尿病患者的预后更差 研究显示达格列净显著降低了心血管事件的发生这不能仅仅归因于其降低葡萄糖的作用同时还改善了心脏功能和减少心脏纤维化 本研究结果发现达格列净改善了糖尿病小鼠心脏病理变化及其心脏功能 具有多种病理生理学触发因素 高血糖是糖尿病相关心血管疾病的最重要原因之一通常导致心功能不全的发展研究表明达格列净可预防非糖尿病性/肥胖和 大鼠的左心室肥大和纤维化而不影响血浆葡萄糖水平此外达格列净治疗可降低 引起的高血压并部分通过抑制主动脉交感神经张力来逆转 猪的左心室重构从而抑制炎症反应 对肥胖胰岛素抵抗大鼠的心脏缺血再灌注损伤具有保护作用如减小梗死体积和改善心脏线粒体功能 达格列净还可降低糖毒性从而防止内皮功能障碍的发展减少氧化应激并在肥胖 大鼠中表现出抗炎作用达格列净治疗/小鼠可改善冠状动脉微血管功能和收缩功能它将心肌燃料利用从葡萄糖转向酮体、脂肪酸和支链氨基酸从而改善心肌能量增强左心室收缩功能并改善不良的左心室重塑 本研究结果显示动物糖尿病组/值和 水平降低表明糖尿病小鼠存在舒张功能障碍和心肌收缩功能受损这种现象与 后期的现象相匹配进一步验证模型已成功建立 此外与动物糖尿病组相比动物达格列净组小鼠/值和 水平升高表明达格列净可以改善糖尿病大鼠心脏功能自噬是溶酶体降解的途径可以通过调节细胞脂质代谢来改善胰岛素抵抗状态其活化由营养缺乏触发并被过量营养抑制营养传感途径包括 和雷帕霉素靶蛋白()途径的机械靶标是自噬的主要调节因子 研究显示在糖尿病肾病中 通路的激活导致肾小管自噬通量降低 此外自噬是一种维持心脏结构和功能的稳态机制自噬可能是保护性的或有害的这取决于细胞类型、细胞环境和自噬的程度 研究显示 抑制剂可能通过作用于自噬而起作用如达格列净可以升高 /比值并降低 的表达此外 抑制剂可以上调自噬相关的泛素蛋白 表达水平 本研究动物实验发现糖尿病组小鼠心肌组织 蛋白水平降低及间质纤维化区域增加达格列净恢复 表达和减轻了糖尿病小鼠的心脏纤维化表明达格列净介导糖尿病的效应与自噬有关综上所述达格列净可以改善糖尿病小鼠心脏病理变化及其心脏功能其机制可能是通过下调 自噬信号通路改善心肌炎症反应为 的治疗提供了新的思路本文第一作者简介:林红满()女汉族主管药师研究方向:糖尿病及并发症的药物研究微循环学杂 志 年第 卷第 期基础与实验 参考文献 .:.:.:.():.:.():.:.:.:.():.:.():.():.():.:.(下转第 页)达格列净通过 自噬信号通路改善糖尿病心肌炎症反应参考文献 .():.():.褚翔南 王 伟 张贺平 等.综合征患者凝血功能和血浆血管性血友病因子抗原的变化及意义.中华危重病急救医学 ():.方顺淼 葛兴利 李运田 等.脂蛋白相关磷脂酶 和心型脂肪酸结合蛋白诊断急性心肌梗死的价值及与预后的关系.中华老年心脑血管病杂志 ():.姚 刚 丁 艳 于 杰.血必净注射液联合高压氧治疗对脓毒症心肌损伤患者血管内皮损伤及微循环的影响.中华航海医学与高气压医学杂志 ():.林梓豪 黄 平.重症肺炎患者、与炎症指标、病情程度的关系及其短期预后预测价值.中国急救复苏与灾害医学杂志 ():.王志燕 陈 晨 吕 强 等.年 急慢性心力衰竭诊断与治疗指南解读.中华心血管病杂志 ():.陈闽江 柳 涛 蔡柏蔷.解读 年成人下呼吸道感染的诊治指南(概述).国际呼吸杂志 ():.():.():.:.():.:.():.王俊岩 王陵军 梁碧容 等.益气温阳活血法对慢性心力衰竭小鼠认知功能的影响及机制研究.中华中医药学刊():.曾小琴 王 怡 刘 娟.集束化护理管理在预防急性左心衰竭院内呼吸道感染中应用.中华肺部疾病杂志(电子版)():.伍灏堃 余天浩 陈森 等.慢性心衰合并肺部感染患者血清 的表达水平及意义.中华医院感染学杂志():.周 迎 任利辉 陈策 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