单克隆抗体药物中重组人透明质酸酶活性测定方法的建立.pdf

基金项目：国家质量基础设施体系专项 蛋白类生物产制品质量检测和计量溯源技术项目（）作者简介：崔春博，女，生，硕士，助理研究员，：刘春雨，女，生，硕士，研究员，：收稿日期：单克隆抗体药物中重组人透明质酸酶活性测定方法的建立崔春博，刘春雨，于传飞，付志浩，杜加亮，王文波，王兰（中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室，卫生部生物技术产品检定及标准化重点实验室，国家药品监督管理局生物制品质量研究与评价重点实验室，北京 ；共同第一作者；通讯作者，：）摘要：目的建立并验证一种检测单克隆抗体药物中重组人透明质酸酶（，）活性的方法。方法利用浊度法建立单克隆抗体药物中 活性的检测方法，并对该方法的专属性、线性、中间精密度、准确度、重复性进行验证。结果该方法专属性良好，空白和不添加 的单克隆抗体药物的 活性均 。在 范围内，供试品 理论活性和实测活性线性相关，决定系数 ；中间精密度试验结果的变异系数（，）均 ；各 活性的平均值回收率在 之间，符合线性、中间精密度和准确度的验证要求。次独立测定 批供试品 活性的变异系数分别为 ，和 ，符合重复性的可接受标准（）。结论该方法各项指标均符合要求，可对单克隆抗体药物中 活性进行质量控制。关键词：单克隆抗体药物；皮下注射；重组人透明质酸酶活性；浊度法；质量控制中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：，（，；，：）：（），（），（）：；自 年全球第一个鼠源性单克隆抗体（单抗）药物 问世，至今单抗药物已经发展了近 年。单抗药物和其生物类似药都呈现井喷式发展，这些药物的给药方式主要为静脉注射，目前皮下注射的单抗药物越来越多。与静脉注射相比，皮下注射给药时间短、给药方式便利，但皮下注射的挑战是需要高剂量、高浓度的药物进行注射，在添加 的罗氏抗 单克隆抗体 的研究中 ，高剂量、高浓度的 皮下注射被证明是一种可行的给药途径，且添加 不会对健康受试者药物耐受性和安全性产生不利影响。在一项皮下注射与静脉注射的对比研究中 ，添加 的皮下注射单克隆抗体药物在药代动力学、疗效和安全性方面与静脉注射高度相似，但免疫原性较低于静脉注射。皮下注射作为单抗药物新的给药方式，提高和完善其质量控制方法，是单抗山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期药物放行和监管的重要环节。透明质酸（，）是一种黏性的糖胺多糖，会形成凝胶状物质，对皮下孔间的大量液体流动构成障碍，限制了皮下的药物输送量和给药速度。透明质酸酶是广泛存在于微生物和动物组织中特异性降解透明质酸的酶家族，而重组人透明质酸酶作为一种具有瞬时活性和局部作用的渗透增强剂 ，可以暂时消除透明质酸构成的障碍，促进大剂量的连续或共同给药的治疗药物在皮下的快速输送，以利于吸收。与静脉注射的药物合用时可改为皮下或肌肉注射，加快吸收 ，。目前，（作为？重组物）已被 批准用于皮下注射 ，它与西妥昔单抗同时给药能加快药物的吸收 ，与抗癌药物曲妥珠单抗共同配制的皮下注射药物也已上市 。活性检测是此类单抗药物质量控制的重要放行指标。目前，实验研究中常使用的 活性检测方法是浊度法 和紫外分光光度法 。紫外分光光度法仅用于测定透明质酸裂解酶的活性，其测定原理是依据降解产物中的双键在 紫外光下有最大吸收值。浊度法是比较经典和常用的方法，也是中国药典和美国药典收录的方法，适用于各种透明质酸酶活性的测定。本研究首次采用浊度法建立单抗药物中 活性的检测方法，其原理是透明质酸可与酸化血清结合形成沉淀，在透明质酸与 反应后，添加酸化血清沉淀未被消化的透明质酸。在 测定浊度，即得透明质酸酶活性。这一方法的建立为提高单抗药物的质量控制提供参考，并对开发皮下制剂的单抗药物以及其他生物药的企业具有借鉴意义。材料与方法 单抗药物单抗药物 （不含有 ）和含有 的单抗药物（标示 活性约为 ）由中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室留样。主要试剂、材料及仪器 标准品和透明质酸钠购自美国 公司（货号：）、人血清白蛋白（）购自瑞士 公司（货号：）；马血清购自美国 公司（货号：）；冰醋酸购自德国 公司（货号：）；无酸 购自德国 公司（货号：）；氯化钠购自美国 公司（货号：）；醋酸钾购自美国 公司（货号：）；透明底黑色 孔板购自美国 公司（货号：）；型酶标仪、软件均购自美国 公司。样品制备用稀释缓冲液（含 马血清、氯化钠、，）将 标准品分别稀释为 ，作为 个不同活性的 标准溶液，用于待测样品中 活性的计算。专属性样品为超纯水（空白样品）、单抗药物 （不含有 ）和单抗药物 （添加了约 活性的单抗药物 ）的稀释液（将单抗药物 用稀释缓冲液稀释 倍）。将单抗药物 用稀释缓冲液稀释至理论 活性分别为 ，用于线性、中间精密度、准确度的验证。将 批次单抗药物 用稀释缓冲液分别稀释 倍、倍和 倍，得到的理论活性约为 ，用于重复性验证。样品检验和数据分析取 的透明质酸钠（孔）加入透明底黑色 孔板中，再将空白样品、已稀释的标准品溶液和单抗药物（孔）加入到透明质酸钠反应孔中，孵育，孵育时间为 ，加入 酸化马血清溶液 乙酸钾溶液（：）中加入 含 马血清的乙酸钾溶液（：）沉淀未被消化的透明质酸，反应时间为 ，再用 型酶标仪测定其在 的浊度。对 个不同 标准溶液的活性值与相应的浊度结果使用五参数 方程拟合，生成标准曲线，采用插值法评价各单抗药物稀释液的浊度，得出各单抗药物稀释液中的 活性。在重复性验证的数据分析中，单抗药物的实测 活性为 种不同稀释液 活性的平均值。验证方案 浊度法测定 活性的专属性验证方案取空白（超纯水）、单抗药物（不含有 ）和单抗药物 （添加了约 活性的单抗药物 ）的稀释液（用稀释缓冲液稀释 倍），测定 活性。判定标准：空白和单抗药 ，物 的 活性不大于 。浊度法测定 活性的线性验证、中间精密度验证和准确度验证方案采用理论 活性分别为 ，的单抗药物进行线性、中间精密度和准确度的验证。通过两名不同的分析员在 个工作日分别进行 次检测，共进行 次独立试验。线性判定标准：决定系数 ；中间精密度判定标准：变异系数 ；准确度判定标准：各个浓度点的回收率 实测 活性（）理论 活性（）在 之间。浊度法测定 活性的重复性验证方案使用 批单抗药物 进行重复性验证。判定标准：次独立测定的 活性变异系数必须 。结果 活性标准曲线结果根据“”项中的方法进行样品检验和数据分析，个 标准品稀释液活性与其在 处测定的浊度结果通过五参数方程拟合的回归方程为 （）（）（其中 ，），为 ；活性标准曲线图谱见图。图 活性标准曲线 浊度法测定 活性的专属性验证结果取“”项下的专属性测定溶液，分析结果表明，空白溶液和不含有 的单抗药物 的检测结果超出了标准曲线的上限，即 活性小于 。说明单抗药物中其他物质对透明质酸酶活性的检测不造成干扰，方法的专属性良好。浊度法测定 活性的线性验证结果线性验证是两名分析员对 ，共 个 活性的样品各进行次检测，共进行了 次独立试验。计算样品的 活性，并对 活性实测值和理论值进行线性回归分析（见图 ）。图 活性理论值和实测值的线性关系 线性验证的结果表明，在 浓度范围内，活性实测值和理论值线性相关，均 （见表 ），线性验证符合要求。表 单抗药物中 活性的线性验证结果 样品编号回归方程决定系数 浊度法测定 活性的中间精密度验证结果中间精密度试验是两名分析员在不同日期对 ，共 个 活性的样品各进行 次检测，共进行了 次独立试验。计算样品的 活性结果。每个样品的变异系数均小于 （见表 ）。符合验收标准，表明该方法通过了中间精密度验证的要求。浊度法测定 活性的准确度验证结果对 ，共 个 活性的样品测定浊度，带入五参数曲线，采用插值法计算 活性，统计回收率，结果表明两名分析人员检测的 活性平均回收率在 之间（见表 ）。山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期表 单抗药物中 活性的中间精密度结果 样品（）活性（）实验 实验 实验 实验 实验 实验 平均值变异系数（）表 单抗药物中 活性的回收率 理论值（）实测值（）回收率（）平均回收率（）变异系数（）浊度法测定 活性的重复性验证结果重复性验证使用的 批单抗药物 的 活性标示量均约为 。批单抗药物 次测定的 活性均值分别为 ，为标示量（约 ）的 ，和 ，变异系数分别为 ，和 （见表），说明重复性符合要求。表 单抗药物中 活性的重复性 样品 活性（）批次 批次 批次 平均值 变异系数（）讨论 辅助皮下注射是一种新的给药方式，相较于静脉注射具有快速扩散吸收、高生物利用度、技术要求低等优点，单抗药物有望像胰岛素一样，实现患者自助型注射。因此，作为皮下注射药物的辅助扩散剂，其质量控制尤为重要。在研究方案设计中，为了更准确定量样品的 活性，标准曲线和样品检测的最佳方案是同步处理和检测，本研究采用酶标 孔板进行检测，检测所需样品量少且简单高效，不但实现了标准曲线和样品同步处理和检测，减少了试验误差，同时满足广大制药企业对于样品高通量的检测需求。在数据分析中，本研究选择五参数模型，相较于四参数模型，五参数模型更能充分拟合不对称的关 ，系 ，对检测的推断更为准确 ，本研究的实际检测结果中，五参数模型拟合的决定系数 较四参数模型更接近于 。值得注意的是，本研究在 范围内，活性与浊度标准曲线呈线性，因此当 活性在 范围内时，也可采用线性拟合。在方法验证中，为了排除单抗药物中蛋白本身及其制剂配方中其他成分对 活性测定的影响，专属性验证选取超纯水和不含有 的同样制剂配方的同种单抗药物进行检测。重复性验证采用 个稀释度的样品进行 活性检测，减少了实验误差。这对其他生物制品中 活性的方法开发具有借鉴意义。综上所述，本研究建立的单抗类药物中 活性的测定方法，经过专属性、线性和精密度等方法学考量，说明该方法准确度和精密度高、重现性好，操作简便，可作为单抗类药物中 活性测定的方法。该方法操作简便，具有较好的推广意义，同时该法为重组蛋白药物皮下制剂、抗体偶联药物皮下制剂等其他生物药物皮下制剂中的 活性检测提供了参考。参考文献：，（）：，（）：，：，（）：，：（），（）：，：，：，（）：，（），（）：，（）：雷曦，张蕊，黄遵锡，等 透明质酸酶的研究进展 微生物学通报，（）：，：，（）：，（）：山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期