毛细管电泳单细胞分析方法及应用进展1.pdf

fj IJ l!分 析 毛细管电泳单细胞分析方法及应用进展1 翁前锋许国旺 中国科学院大连化学物理研究所国家色谱研究分析中心，大连 1 1 6 0 1 1 摘 要 本文对毛细管电泳用于单个细胞分析的方法及应用进行综述。较 系统地论述 了毛细管电泳分析时单个 细胞取样、溶膜、衍生和检测的方法，以及应用新进展。关键词 单细胞分析 毛细管电泳 应用 1 前言 细胞是生物体结构和生命活动的基本单元。在单个细胞水 平上进行研究，可以获得反映细胞生理状态和过程的更准确、更全面的信息，还可以使人们能更好地了解细胞群体中某些特 殊的细胞功能，更深入地认识细胞个体差异、细胞间相互作用 和信息传递以及神经递质、药物或毒物刺激的生理影响等更深 层次的信息。因此，单细胞分析技术的研究与发展具有重要意 义，已成为分析科学中的一个新兴的前沿领域。对单细胞的分析技术主要包括伏安微电极法l】1，荧光图象 技术1 2】，微型凝胶电泳 1，微型薄层色谱法【4 1，微型玻管电极 法5 1，光电显微技术6 J，开管液相色谱和毛细管电泳(C E)微柱 分离方法。开管液相色谱和 C E因仅需少量样品并具有高分离 度等优点，特别适用于多种组分测定和定量，并已成功地用于 单细胞多组分的定量检测。其中，C E 技术自身具有许多内在的 特点：(1)非常小的进样体积哺乳动物细胞大小直径典型的 约 1 0 3 0 IX m，体积约0 5 1 4 p L(按球形估算)。对于标准规格 的液相色谱(L C)，对单细胞进样操作将导致至少1 0 6 倍的稀释 因子。这种浓度稀释任何灵敏的检测器也弥补不了。(2)高分 离效率 这对于细胞内组分复杂、种类众多的单细胞分析是非常 重要的。(3)高分离速度 快速分离意味着高通量、高效率。4)生物适应性环境 C E 中常用的以水溶液为主的缓冲体系对生物 细胞及生物分子非常友好。因此毛细管电泳很适合分析单细胞，并将在单细胞的分析中发挥出越来越重要的作用。单细胞的毛细管电泳分析已有几篇综述报道l 7-】。本文对毛 细管电泳用于单细胞分析进行综述，包括单个细胞分析的取样 方法，各种高灵敏度检测方法，单细胞的衍生技术，单细胞的 溶膜方法及其应用于各种单细胞分析进展。2 取样 取样是单细胞分析的关键之一。一般是在显微镜下，借助 于三维微操作器进样。目前研究应用的取样方法主要有单个细 胞溶解取样、活体细胞质取样以及单个全细胞取样。2 1单个细胞溶解进样 微注射器压力进样。K e n n e d y e I 采用微注射器压力进样分 析单细胞。微进样器由微注射器连接一微量移液器组成，它们 之间由2 5 0 L 汞连接，微注射器带有微刻度。通过微刻度的 调节，1-1 0 0 n L 体积的试样可以导入或导出。移液器尖端可直 接插入分离毛细管的管 口。单个神经细胞经分离后置于2 0 0 n L 的微型管状瓶中，均化，再离心，将上层清液转移到另一微型 管状瓶中，加入试剂衍生化后用微进样器移取部分溶液加入分 离毛细管内，再分离检测。此法优点是溶解细胞时反应完全，内标或衍生试剂与试样混合均匀，衍生反应完全，测定误差较 小。缺点是样品稀释后，不能全部进样，使方法检出限变差，只适用于体积较大的无脊椎动物神经细胞。应用范围有限。2 2 单个全细胞进样 在毛细管电泳的单个细胞分析中，大多采用单个全细胞进 样。分离毛细管的进样端被用作微进样器。分离的单个细胞，用电迁移 1 5 1 或流体动力学 1 6-1 8 压入或吸入)，将整个细胞进样 到分离毛细管内，在毛细管内溶解细胞膜，再用高压电泳分离 及检测。由于将单个细胞全部进样保证了细胞组分的1 0 0 进 样，使细胞内低含量组分获得最佳检出限。易氧化组分不会氧 化，操作方便。O l e fi r o w i c z【1 5】等用 2 5 m内径毛细管，采用电 迁移方式将7 5 m的神经细胞移入管内。金文睿等 1 9 0 1 不需对 毛细管进样端作任何腐蚀，也不需要微操纵器，在有一定细胞 数 目条件下，利用细胞在溶液中漂浮移动，当细胞靠近管口时，电迁移引入细胞，费时一般不超过2 分钟。S i m s 等【2】设计的细 胞取样方法与上述均不相同，他们设计的细胞进样装置需脉冲 激光辅助，脉冲激光通过显微镜的物镜聚焦在单细胞所在的缓 冲液与载波片的界面处。光束聚焦点不直接在单细胞上而是距 单细胞约2 0-3 0 m的侧面。分离毛细管的进样端垂直放置在 单细胞之上，距单细胞约 1 5 2 5 m。当一定功率的脉冲激光 照射时，所产生的热量能在3 3 ms 内将细胞溶膜，并同时用电 迁移或压力进样的方法将破膜的细胞及其内含物吸入毛细管进 样端。K r y l o v 等 1设计了一个多功能细胞进样器，进样装置透 明，毛细管不用蚀刻处理，分离毛细管竖直安放在选定细胞上，在显微镜监控下，通过电迁移或压力引入细胞。该装置还包括 3 0 S 内用S D S 使细胞破膜，以及每次进一单细胞后，自动清洗 毛细管的功能。C h e n 和L i l l a r d 1 2 3 1q 计了一种单细胞连续进样电 泳分析装置。装置包括两根毛细管A和B，毛细管A为细胞进 样毛细管，B 为电泳分离毛细管。毛细管A与B 之间用一个5 m m 长的特弗隆管连接，毛细管A与 B之间间距为5 m，特弗隆 t本项 目获得 了国家高技术研究发展计划(8 6 3 计划)(2 0 0 3 AA 2 2 3 0 6 1)和 中国科学院知识创新基金的资助。通信联 系人。电话 传真：0 4 1 1 3 6 9 3 4 0 3。E ma i l：d i c p 4 0 2 ma i l d l p t t I n c n 生命科学仪器2 0 0 4 年2月第 1 期 维普资讯 http:/ 行业 分 析 管连接处浸在缓冲液中。当高压施加在两支毛细管的两端时，细胞被连续“泵”进毛细管中，细胞在接 口处受到挤压等力的 作用破膜进入电泳分离毛细管，然后 L I F 检测。目前该法仅适 用于红细胞。分析一个单细胞平均时间不超过4分钟，而且不 需要使用显微镜 和微操纵器。此外，K r y l o v 2 4 等还对毛细管电泳单个全细胞取样分析时，单细胞的载体进行了研究。如普通载玻片会对细胞强吸附，影 响单细胞分析的取样和重现。以人结肠癌细胞为例，比较了各 种涂层载波片对细胞的生物相容性和吸附能力。认为聚乙烯醇(P V A)、2-羟甲基丙烯酸脂(P H E MA)涂层较好。2 3 细胞质取样 美国宾州大学E w i n g 研究小组设计的细胞质取样方法则无 需将细胞分离，可直接进行活体单细胞的分析。具体分为三种 形式：第一种，把玻璃毛细管尖端的直径拉制成约几微米后灌 入缓冲液作为微进样器，用微操纵器控制其尖端准确插入神经 细胞内，再把电泳管的阳极端插入微进样器中，启动高压电迁 移进样2 5 第二种，采用外径约几十微米的双微管进样器。一 微管的管尖用碳纤维密封，其内插入铂丝用于导电，插入细胞 后，用电迁移方法从另一管移入细胞质样品2 6，”第三种，将分 离用5 n l 内径毛细管入口端用H F 蚀刻到外径仅8 1 0 m，然 后在显微镜下用微型操作器将其直接插入多巴胺或 5 一羟色胺 神经细胞体内2 8，：，采用电迁移方式将一部分细胞质移入毛细 管内进行电泳分离 依靠电渗流进样的体积为5 0 8 3 p L，最小 可达到2 7 0 f L 的进样量。这种直接进样方式避免了用微型注射 器带来的进样区带扩张的弊病。但是大多数细胞，特别是哺乳 动物细胞直径很小，微型进样器尖端不易准确插入细胞内，因 此该进样法目前主要用于蜗牛巨大神经细胞(直径约 2 0 0 m)的分析，对于哺乳动物细胞(直径一般在7 3 0 m)的活体分 析 尚无报道。3检测技术 检测器是建立单细胞C E 分析方法的关键。C E 检测器种类 很多，但用于单细胞多组分分离和定量检测的主要有电化学检 测器和激光诱导荧光检测器(L I F)，其次，紫外检测3 0】，放射 化学检测 1 11，质谱检测 3 l】，在柱微型免疫分析3 2 1 也已有报道。3 1 电化学法 E w i n g 研究小组I2 5 1 最早将毛细管电泳安培检测用于单细胞 分析，并进行过系统的研究工作。他们3 3 1 采用全细胞进样C E 安 培检测分析单个 P、C o r n e u s 多巴胺神经细胞时，发现溶解细胞 的时间变短会造成迁移时间不同的两个多巴胺峰，当细胞培养 液中加入利血平(一种泡囊破坏剂)培育一段时间后再单细胞 进样，则只有一个多巴胺峰。据此推断他们是来自不同的贮存 多巴胺的泡囊。为证实上述推测，E w i n g “1 将毛细管电泳与 扫描伏安法检测相结合用于上述多巴胺神经细胞的分析。通过 比较两个峰的伏安曲线可以判断两峰都是多巴胺的峰。J i n 等 报 道了毛细管电泳 双微工作电极安培法同时检测 单个鼠肝细胞中的色氨酸和谷胱甘肽。双微工作电极由碳纤维 微电极 和A u Hg 微 电极组成。碳纤维微电极可 以测定细胞 中的 色氨酸，A u H g 微电极可以催化氧化测定谷胱甘肽。他们用这 种电极结合 C E分离技术运用于单细胞分析，一次进细胞可以 获得更多的信息。3 2 激光诱导荧光法 激光诱导荧光(L I F)具有很高的灵敏度，检出限已达到 分子水平y mo l(1 0 to o 1)，并已用于检测单个乳酸脱氢酶分子 I 3 6】和单个藻红素分子 3 7】。但通常其检出限在 a m o l z mo l 范围 内。C E与激光诱导荧光检测相结合，兼有高分辨和高灵敏度 的特点。波长分辨激光诱导荧光法可以同时检测分析物区带 的荧光发射光谱，因而可以对迁移时间相近的谱带具有定性 的能力 _ 3 8】。激光诱导荧光法又可分为天然荧光法，化学标记荧光法，间接荧光法和催化荧光法。X u e 等I】最早将毛细管电泳催化荧 光检测法应用于单个人血红细胞中乳酸脱氢酶(L D H)活性分 析。乳酸与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(N A D )在单细胞胞内L D H 催化下，生成N A D H，检测N A D H的荧光强度，可以测得单个 人血红细胞中乳酸脱氢酶同工酶的活性。检测限达 1 31 0 to o l f 约8 0 0 个分子1。他们的研究说明单个人红血球细胞L DH 平 均活性为1 3 60 7 n I U。单个细胞之间L D H的活性差异大，衰 老红细胞的酶活性较低。3 3 在柱微型免疫检测 R o s e n z w e i g 等 3 2】提出一种c E的在柱微型免疫检测方法，电 泳毛细管内填充与抗体共价键合的胶体颗粒，在高压电场的作 用下胶体颗粒发生迁移，利用抗原分子与抗体专一性结合作用 和激光光散射检测反应颗粒的个数，检测限达l z mo l(约6 2 0 个 分子)。测得人单个红血球细胞 中G6 P DH的平均含量为 3 4 z m o l。T a n 和Y e u n g I4 O 还设计组装了经毛细管电泳分离后，用粒 子计数免疫检测法测 G 6 P D H的含量，激光荧光法测G 6 P DH活 性的装置，可同时测定人单个红细胞中G 6 P D H的量和活性。红 血球细胞分析结果，每个细胞中 G 6 P D H平均含量为 1 59 z m o l；活性 2 71 4 p I U。3 4 放射法 S w e e d l e r 研究组1 4 1 报道了一种柱后放射性检测装置，用 s s，：P或 H标记蛋氨酸，经毛细管电泳分离，柱后将毛细管 流出液收集在可键合肽的膜上，用C C D检测器阵列检测斑点，获得电泳谱图。该方法灵敏度高，已用于了海软体动物(加州 A p l y s i a)单个脑神经细胞B 中神经肽的检测1。3 5 质谱法 P a g e 14 2 1 等提出用毛细管电泳分离MA D L I Ms 或放射离线检 测细胞中的肽。将适量3 5 S 一 蛋氨酸放入细胞培养液中，培养 2 4 小时后，将海洋软体动物加州A p l y s i a 袋神经细胞转移入一个特 制 1 5 0 n L的微量瓶中，分离毛细管直接插入微量瓶中重力进 样，分离4 分钟后，直接将馏分收集在MA D L I 载样孔中，样品 馏分用MA D L I MS 或放射检测，在单个细胞中检测到含”S 一 蛋 氨酸 的肽。4 细胞衍生 4，l柱前衍生 柱前衍生指单细胞溶膜，组分衍生后才进入电泳分离毛细 管的分析方法。将单个细胞放入 n L 级的容器中，溶膜，加入 衍生试剂，衍生反应完成后移取部分溶液进样。K e n n e d y 等7 1 将 单个神经细胞放入2 0 0 n L 微型管状瓶中，加入N D A衍生后，用 微量移液器移取1 n L 溶液进样，高效、快速地分离检测了十几 种氨基酸。生命科学仪器2 0 0 4 年2 月第 1 期 维普资讯 http:/ 行 业 分 析 4 2 桂上衍 生 单细胞柱上衍生电泳分析，包括二种操作模式，第一种模 式是将单个细胞移入毛细管内，然后采用电迁移或压力进样移 入细胞溶膜剂及衍生化试剂(需要时也可引入内标)，直接把 分离毛细管进样端作为衍生化反应池，静止溶膜及反应一段时 间后再将进样端移回操作缓冲液中进行电泳分离检测。G i l ma n 等 4 3 1 最早应用这种方法分析单个鼠嗜铬细胞瘤细胞(P C 1 2)，定 量了5 种氨基酸和多巴胺的含量。另一种操作模式是将细胞溶 膜剂、衍生剂加入操作缓冲液中，作为操作缓冲液的一部分。当单个细胞进入分离毛细管后，即开始电泳分离检测。细胞在 柱内迁移的过程中溶膜衍生。O g u r i 等【4 4】用这种衍生方法毛细管 电泳荧光检测了肥大细胞中内源性组胺。此法有操作更方便的 优点，但是要求衍生反应的速度要更快。单细胞柱上衍生方法 减少了样品的处理和转移，操作简单，反应器体积小，比前述 微型反应管式衍生方法的体积降低一个数量级，稀释作用减 小，效果较好。但要求过量的衍生试剂不干扰检测。4 3 柱后衍生 柱前及柱后衍生存在的主要问题是分析物的多重标记，会 使电泳峰的鉴定及定量产生困难。柱后衍生可以克服此弊病，但衍生反应必须快速，在数秒内完成。E w i n g 组 设计了一种 适用于小内径毛细管(1 0 m内径)的流体间隙式柱后反应器，这一装置用于O P A柱后衍生氨基酸和蛋白质，柱拖尾及峰增宽 均小。甘氨酸及铁传递蛋白检出限分别为1 3 0 a mo l 和5 2 a n ml。此装置以N D A 柱后衍生，已用于检测蜗牛神经细胞及单个红细 胞 中的组分。4 4 细胞内衍生 将单个细胞放置于含衍生试剂的培养液中，衍生试剂可透 过细胞膜进入细胞内，衍生胞内待分析物。衍生产物不能渗出 细胞外而且细胞完整。H o g a n 等l l 7】用上述方法分析人单个红血 球细胞中谷胱甘肽。用mB B r 荧光试剂柱前衍生红血球细胞，在 3 7 培育6 0 mi n，使m B B r 通过细胞膜与G S H完成衍生反应，然 后单个全细胞进样。董谦 l 4 7】则采用电穿孔方法将衍生试剂强制 导入血红细胞中，使氨基酸的衍生反应在细胞内进行。在细胞 内的衍生过程中，由于细胞电穿孔引入衍生试剂后，细胞仅略 有增大，因此细胞内样品的稀释小于2 倍。衍生的血红细胞电 迁移进入毛细管进行电泳分析。5 细胞溶膜 单个全细胞取样要求在细胞进入毛细管进样端后，有合适 的溶膜方法。5 1 电泳缓冲液溶膜法 不同的细胞对于外界环境变化(如p H值，离子强度等)的 忍受程度不一样。有些细胞只需环境 p H值或离子强度有少许 变化，细胞就会溶膜。如对于红血球细胞、鼠的交感神经细胞、蜗牛神经细胞等，常用的缓冲液即可溶膜。5 2 化学试剂溶膜法 有些细胞，如巨噬细胞、肥大细胞、淋巴细胞等在常用的 电泳缓冲液中难以溶膜，可以采取加入一些化学试剂使膜溶解 的方法，这类化学试剂主要有十二烷基磺酸钠(S D S)、毛地黄 皂苷、强碱如N a O H等。5 3 T e s l a 线圈溶膜法 X u e 等】在对单个淋巴细胞中乳酸脱氢酶分析时，发现淋 巴细胞在通常条件下，不易使淋巴细胞破膜。他们设计了一个 特斯拉线圈，利用线圈诱导一外部电场加在淋巴细胞的细胞膜 上，当细胞膜的电位超过约 2 0 0mV以上时，细胞就会破裂。当 单个细胞进入分离毛细管后，用特斯拉线圈顶端轻触毛细管外 壁，细胞就会溶膜。在分离毛细管进样端套上一特弗隆管(T e f l o n t u b e)是为了避免引入气泡。细胞溶膜所需时间一般为 1 5 2 0 S o 而且他们还实验证明了这种细胞溶膜方式对被测组分 乳酸脱氢酶的活性没有产生影响。5 4 脉冲激光细胞溶膜法 S i ms 等【2 l】使用脉冲激光细胞溶膜法。脉冲激光通过显微镜 的物镜聚焦在单细胞所在的缓冲液与载波片的界面处。光束聚 焦点距单细胞约2 0 3 0 m的侧面。当一定功率的脉冲激光照 射时，所产生的热量能在3 3 ms 内将细胞溶膜。这种方法的优 点在于单细胞溶膜时间短(3 3 ms)，从而避免了细胞在外界 环境下，可能引起的细胞内组分发生的化学变化。特别是一些 酶相关的化学反应，其浓度可在一秒内发生 1-1 0 4 个数量级的 变化。5 5 脉冲电压细胞溶膜法 H a n 等 建立了脉冲电压快速细胞溶膜法。细胞载波片以 及分离毛细管进样端均镀上金属膜，通过它们施加脉冲电压。单细胞分析时，将分离毛细管进样端垂直置于细胞上端，并靠 的很近，施加脉冲电压，细胞溶膜的同时加上电泳分离高电压 将细胞吸入分离毛细管。这种方法单细胞溶膜时间短(3 3 ms)可与脉冲激光法相比。5 6 超声溶膜法 Z h a n g 等 5 0 1 在分析单个结肠癌细胞株(H T 2 9)细胞时，采 用超声溶膜法。当单个细胞引入毛细管进样端后，继之电迁移 引入衍生试剂。然后把进样端放入一个含操作缓冲液的小管 中。将小管置于超声容器中6 5 C 3 0 s 溶解细胞。6 应用 毛细管电泳在单细胞分析中的应用报道将近有1 0 0 篇文章，我们用表格的形式将主要信息进行概括，列于表 1。参考文献 1 L a u，Y Y，C h i e n，J B ，e t a l，E l e c t r 0 a n a l y s i s 1 9 9 1，3，8 1 9 6 2 T a n k，D W，S u g i mo r i，M，S c i e n c e 1 9 8 8，2 4 2，7 7 3 7 7 7 3 1 Ma t i o l i，G T ，N i e w i s c h，H B，S c i e n c e 1 9 6 5，1 5 0，1 8 2 4 1 8 2 6 4 Os b o r n e，N N，Na t u r e 1 9 7 7，2 7 0，6 2 2 6 2 3 f 5 P u r v e s，RD著，刘 克球译 微 电极方 法 北 京，北京 大学 出 版社，1 9 8 5，2 6 B e t z i n g，E，T r a u t ma n，J K，S c i e n c e 1 9 9 1，2 5 1，1 4 6 8 1 4 7 0 7 Ke n n e d y，R T，Oa t e s，M D，C o o p e r，B R，Ni c k e r s o n，B ，J o r g e n s o n，J W ，S c i e n c e 1 98 9，2 4 6，5 7 63 8 E wi n g，A G，J Ne u r o s c i Me t h o d s 1 9 9 3，4 8，2 1 5 2 2 4 f 9 罗 国安，王义 明，生物 医药 色谱新 进 展 1 9 9 4，2，21 2 5 1 O H i e t p a s，P B ，E wi n g，A G，J L i q C h r o ma t o g r 1 9 9 5，1 8，3 5 5 7 3 5 7 6 1 1 J a n k o ws k i，J A，T r a c h t，S ，S we e d l e r，J V，T r An a 1 C h e m 1 9 9 5，1 4，1 7 0 1 7 6 1 2 程介 克，王宗 礼，高等学 校化学 学报 1 9 9 7，1 8，1 0 4 6 1 0 5 3 1 3 Y e u n g，E S ，J C h r o ma t o g r A 1 9 9 9，8 3 0，2 4 3 2 6 2 1 4 S h a n e r，L M，B r o w n，P R，J L i q C h r o m R e 1 T e c h n o 1 2 0 0 0，生命科学仪器2 0 0 4 年 2 月第 l 期 5 维普资讯 http:/ 行业 分 圻 表 1 毛细 管 电泳 单细 胞 分 析 概 况 生命科学仪器2 0 0 4 年2 月第 1 期 维普资讯 http:/ 行 业 分 析 生命科学仪器2 0 0 4 年 2 月第1 期 维普资讯 http:/ 行业 分 圻 生命科学仪器2 0 0 4 年2月第 1 期 维普资讯 http:/ 行 业 分 析 蛋 白质 HT2 9 全 细 胞 S DS F Q LI F FQ 3 0多个 蛋 白组 分8 7 低聚精 结肠癌细胞 全细胞 含冲S D液S绥 蛋 白质 结 肠癌 细 胞 全细 胞 LI F Tl V I记R标 检 测 低 聚糖 合 成 8 8 抗坏 血 酸 人 中性 粒 细 胞 全细 胞 S DS 安培 法 蛋 白质 1,4，5 三磷 酸 肌 醇 阿霉 素 及 其代 谢 物 S DS PAOE获 得 的蛋 白用 于 单 细胞 蛋 白定8 9 性 0 5 6 -0 24矗no l 9 0 线 虫胚 胎 细 胞 全细 胞 S DS LI F FQ 2 0多个 蛋 白组 分 8 6 卵母 细 胞 细 胞 质 l q s 1 全 细 胞 含冲SD液S缓 OS H 人肝 癌 细 胞 全 细 胞l q a OH 安培 法 生 物 胞 素 海 胆 卵母 细胞 全 细 胞 电场 力工 抗 过 敏 药(S ODl s)人 宫颈 癌 传 代细 胞 全 细 胞 含冲SD液S绥 抗 生 蛋 白 链 菌 素 H TC 40 1 0 I 江 91 代 谢 物 0 1 1 1 fi n o l 9 2 2 2 3 5 8矗no l 93 24-2 lt ml o l L 94 监 测 器 蒙 蓑 药 物9 5 的 刺 激 释 放 2 3，9 7 5-9 9 7 1 5】Ol e f i r o w i c z，T M，E w i n g，A G，C h i mi a 1 9 9l，4 5，1 0 6 1 0 8 1 6】L e e，T T ，Ye u n g，E S ，A n a 1 C h e m 1 9 9 2，6 4，3 0 4 5-3 0 51 1 7】Ho g a n，B L ，Ye u n g，E S ，A n a 1 Ch e m 1 9 9 2，6 4，2 8 4 1 2 8 4 5 1 8】Xu e，Q ，Ye u n g，E S ，J C h r o ma t o g r A 1 9 9 4，6 6 1，2 8 7 2 9 5 1 9】J i n，W，L i W，X u Q，E l e c t r o p h o r e s i s 2 0 0 0，2 l，7 7 4-7 7 9 2 0】J i n，W，D o n g，Q ，Y e，x，Y u，D，An a 1 B i o c h e m 2 0 0 0，2 8 5 2 5 5 2 5 9 2 l】S i ms，C E，Me r e d i h，G D，Kr a s i e v a，T B ，B e ms，M W，Tr o mb e r g，B J Al l b r i t t o n，NL，An a 1 Ch e m1 9 98，7 0，45 7 0 4 5 7 7 2 2】K r y l o v，S N ，S t a r k e，D A，A r r i a g a，E A，Z h a n g，Z ，C h a n，N W C，Pa l i c a，MM，Do v i c hi，NJ ，An a 1 Ch e m2 0 0 0，7 2 8 72 8 7 7 2 3】C h e n，S ，L i l l a r d，S J ，An a 1 Ch e m 2 0 0 l，7 3，l l l l l 8 2 4】K r y l o v，S N，D o v i c h i，N J ，E l e c t r o p h o r e s i s 2 0 0 0，2 l，7 6 7 7 7 3 2 5】Wa l l i n g f o r d，R A E w i n g，A G ，A n a 1 C h e m 1 9 8 8，6 0，1 9 7 2 1 9 7 5 2 6】E w i n g，A G，Wa l l i n g f o r d，R A，O l e f i r o w i c z，T M，An a 1 C h e m 1 9 8 9，61。2 9 2 A一2 9 8 A 2 7】Wa l l i n g f o r d，R A ，E w i n g，A G，An a 1 C h e m 1 9 8 7，5 9，6 7 8 6 8 1 2 8】Ol e f i r o wi c z，T ME w i n g，A G，An a 1 Ch e m1 9 9 0，6 2，l 8 7 2 一 l 8 7 6 2 9】O l e f i r o w i c z，T M，E w i n g，A G，J Ne u r o s c i Me t h o d s 1 9 9 0，3 4，l l l 5 3 0】C r u z，L ，Mo r o z，L L ，Gi l l e t t e，R，S w e e d l e r，J V ，J Ne u r o c h e m 1 9 9 7，6 9，l 1 0-l l 5 3 l】Ho f s t a d l e r，S A，S e v e r s，J C ，S mi t h，R D，S w a n e k，F D，Ewi n g，A G，Ra p i d Co mmu n Ma s s S pe c t r o m1 9 9 6，1 0，91 9-9 22 3 2】R o s e n z w e i g，Z ，Y e u n g，E S ，A n a 1 C h e m 1 9 9 4，6 6，1 7 71 1 7 7 6 3 3】Kr i s t e n s e n，H K L a u，Y Y，E w i n g，A G，J N e u r o s c i Me t h o d s 1 9 9 4，51，1 8 3 1 8 8 3 4】S w a n e k，F D，Ch e n，G Y，E wi n g，A G，A n a 1 C h e m 1 9 9 6，6 8，3 9l 2 3 9l 6 3 5】J i n，W，L i，X ，Ga o，N，A n a 1 C h e m 2 0 0 3，7 5，3 8 5 9-3 8 6 4 3 6】X u e，Q ，Ye u n g，E S ，Na t u r e 1 9 9 5，3 7 3，6 8 1 6 8 2 3 7】C h e n，D Y，D o v i c h i，N J ，A n a 1 Ch e m 1 9 9 6，6 8，6 9 0 6 9 6 3 8】F u l l e r，R R，Mo r o z，L L ，Gi l l e t t e，R，S we e d l e r，J V，Ne u r o n 1 9 98，2 0，1 7 3 1 81 3 9】X u e，Q，Ye u n g，E S ，An a 1 C h e m 1 9 9 4，6 6，1 1 7 5 1 1 7 8 4 0】T a n，W，Y e u n g，E S ，An a 1 B i o c h e m 1 9 9 5，2 2 6，7 4 7 9 41】T r a c h t，S E ，T o ma，V，S we e d l e r，J V，A n a 1 C h e m1 9 9 4，6 6，2 3 8 2 2 3 8 9 4 2】P a g e，J S ，R u b a k h i n，S S ，S w e e d l e r，J V，A n a 1 C h e m 2 0 0 2，7 4，4 9 7-5 03 4 3】G i l ma n，S D ，E w i n g，A G，A n a 1 Ch e m 1 9 9 5，6 7，5 8 6 4 4 4】O g u r i，S ，O h t a，Y，S u z u k i，C，J Ch r o ma t o g r B 1 9 9 9，7 3 6，2 6 3 2 71 4 5】Gi l ma n，S D，P i e t r o n，J J ，E wi n g，A G，J Mi c r o c o l u mn S e p 1 9 9 4，6，3 7 3 3 8 4 4 6】G i l ma n，S D，E wi n g，A G，An a 1 Me t h o d s I n s t r u m1 9 9 5，2，l 3 3 一l 41 4 7】D o n g，Q ，Wa n g，X ，Z h u，L ，J i n，W，J C h r o ma t o g r A 2 0 0 2，9 5 9，2 6 9-2 79 4 8】Xu e，Q，Y e u n g，E S ，J C h r o ma t o g r B：B i o me d Ap p 1 1 9 9 6，6 7 7，2 3 3-2 4 0 生命科学仪器2 0 0 4 年2 月第 1 期 维普资讯 http:/ 行业 分 析 4 9 H a n，F ，Wa n g，Y，S i ms C E ，B a e h ma n，M，C h a n g，R ，L i，G P，Al l br i t t o n，N L An a 1 Ch e m 2 00 3，7 5，3 68 8 3 69 6 5 0 Z h a n g，Z ，K r y l o v，S ，Ar r i a g a，E A，P o l a k o w s k i，R，D o v i c h i，N J ，An a 1 Che m 2 0 0 0，72 3 1 8-3 2 2 5 1 S h i p p y，S A，J a n k o w s k i，J A，S we e d l e r，J V，An a 1 C h i m Ac t a 1 9 9 5，3 0 7，1 6 3-1 71 5 2 S w a n e k，F D，A n d e r s o n，B B ，Ew i n g，A G，J Mi c r o c o 1 S e p 1 9 9 8，1 0，1 8 51 9 2 5 3 Qu a n，Z ，L i u，Y M，E l e c t r o p h o r e s i s 2 0 0 3，2 4，1 0 9 2 1 0 9 6 5 4 K i m，W S ，Da h l g r e n，R L ，Mo r o z，L L ，S w e e d l e r，J V，A n a 1 Ch e m 2 0 0 2，7 4，5 61 4 5 62 0 5 5 Wa n g，W，S u n，X ，J i n W，J C h r o ma t o g r B 2 0 0 3，7 9 8，l 7 5 一 l 7 8 f 5 6 S u n，X，J i n，W，An a 1 C h e m 2 0 0 3，7 5，6 0 5 0 6 0 5 5 5 7 L i l l a r d，S J ，Ye u n g，E S ，L a u t a mo，R M A，Ma o，D T ，J Ch r o ma t o g r A 1 9 9 5 7 l 8 3 9 7 4 0 4 5 8 Wo n g，K-S ，Y e u n g，E S ，Mi k r o c h i m Ac t a 1 9 9 5，1 2 0，3 2 1-3 2 7 5 9 Z h a n g，L ，Ye u n g，E S ，J C h r o ma t o g r A 1 9 9 6，7 3 4，3 3 l 一 3 3 7 6 0 D o n g，Q，J i n，W，E l e c t r o p h o r e s i s，2 0 01，2 2，2 7 9 7 2 8 0 3 6 1 B e r g q u i s t，J ，T a r k o ws k i A，E k ma n，R，E w i n g，A G，P r o c N a t 1 Ac a d S c i US A1 9 9 4，9l，l 29l 2 一l 2 9l 6 6 2 B e r g q u i s t，J J o s e f s s o n，E ，T a r k o ws k i，A，E k ma n，R ，E wi n g，A G，E l e c t r o p h o r e s i s 1 99 7 1 8，l 7 6 01 7 6 6 6 3 We n g，Q，J i n，W，A n a 1 C h i m Ac t a 2 0 0 3，4 7 8，1 9 9 2 0 7 6 4 C h a n g，H-T ，Y e u n g，E S，An a 1 C h e m 1 9 9 5，6 7，1 0 7 9 1 0 8 3 6 5 T o n g，W，Ye u n g，E S ，J N e u r o s c i Me t h o d s 1 9 9 7，7 6，1 9 3 2 0 1 6 6】Z h a n g，L ，Qv，s ，Wa n g，Z ，C h e n g，J J C h r o ma t o g r B 2 0 0 3，7 9 2，3 8l-3 8 5 6 7 S u l j a k，S W S w a n e k，F D，Ga v i n，P F，E w i n g，A G J S e p Sc i 2 0 03，2 6，61 6 8 6 8 T o n g，W，Y e u n g，E S J C h r o ma t o g r B：Bi o me d Ap p 1 1 9 9 6，68 5，3 5 4 0 6 9 T o n g，W，Y e u n g，E S J C h r o ma t o g r B：Bi o me d Ap p 1 1 9 9 7 68 9，3 21 3 2 5 7 0 O r w a r，0，F i s h ma n，H A，Z i v，N E ，S c h e l l e r，R H，Z a r e，R N，Ana 1 Ch e m1 9 95，6 7，4 2 61 42 6 8 7 1 Yi k，Y F ，L e e，H K，L i，S F Y，Kh o o，S B ，J C h r o ma t o g r 1 991，58 5，1 3 91 4 4 7 2 Wa n g，Z ，Ye u n g，E S J C h r o ma t o g r B：Bi o me d Ap p 1 1 9 9 7，6 9 5，5 9 6 5 7 3 胡 深，庞 代 文，王宗 礼，程 介 克，李 文 望，樊 友 珍，胡 宏 镇 分析 化学 l 9 9 8，2 6 7 5 2 7 5 6 7 4胡深，庞 代 文，王 宗礼，程介 克，李 文望，樊友 珍，胡 宏 镇 高等学 校化学学 报 l 9 9 6，l 7，l 2 0 7 一 l 2 0 9 7 5 We n 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