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普鲁兰多糖的分离纯化及结构鉴定
作者：曹海石 添加日期：2011-08-20 23:21:02 浏览：270次
普鲁兰多糖是由茁芽短梗霉(A u reobasid ium p u llu lans) 分泌的胞外多糖[ 1 ] , 它具有无毒害、粘结性强和成膜性好等优良特性, 可作为食品、医药方面的粘合剂和包装材料. 此外, 也广泛应用于水果蔬菜保鲜、种子保护、化妆品和卷烟生产等方面, 是一种新型的多功能生物产品, 有较好的应用前景[ 2, 3 ]. 目前, 普鲁兰多糖的应用国外已申请了多项专利, 我们实验室经紫外诱变筛选出一株高产普鲁兰多糖的菌株(A u reobasid ium p u llu lans JB518) [ 4 ] , 对其产生的多糖进行了分离纯化, 该纯化方法简便、回收率高. 同时通过薄层层析、红外光谱及核磁共振等方法对其结构进行了鉴定, 证实了它的基本结构单位为麦芽三糖, 每个麦芽三糖之间由A(1→6) 糖苷键相连, 这为该变异菌株的应用提供了理论依据.
DEA E2纤维素为W hatm an 产品,
Sephadex G2100 为Pharm acia 产品,
普鲁兰多糖 (Pu llu lan) 标准品、 麦芽三糖和普鲁兰酶(EC. 3. 2. 1. 41) 为Sigm a 产品,
其它化学试剂均为国德国B ruker
1FS66V 真空型红外光谱仪. 美国V arian 公司U n ity 400 NMR 仪.
将本实验室经紫外诱变获得的茁芽短梗霉(JB518) , 在含2% 蔗糖, 012% 的酵母浸膏, 012% KH2PO 4, 0. 1%MgSO 4•7H2O , 0. 1%NaOH 和0. 04% (NH4)2 SO4 的液体培养基中培养, 在250 mL 锥形瓶中加入50 mL 培养基, 用接种环移菌3 次, 于28 ℃发酵96 h, 发酵液in 的转速下离心30 m in, 去沉淀, 上清液加入2 倍无水乙醇, 搅拌、放置过夜,使普鲁兰多糖充分沉淀. 沉淀液以4 500 r/min 离心30 min, 得普鲁兰多糖沉淀, 沉淀依次用丙酮、乙醚洗涤, P1O5干燥, 即得普鲁兰多糖粗品, 从50 mL 发酵液中可得其粗品115 g.
1. 3　多糖及蛋白质含量的测定
采用改良的苯酚2硫酸法[ 5 ]. 取待测溶液012 mL , 加入浓度为50 gˆL 的苯酚溶液014mL , 混合均匀后迅速加入2 mL 浓H2SO 4, 振荡摇匀, 于室温放置30 m in, 用721 分光光度计在490 nm 处测定光吸收值.
采用Low ry 法[ 6 ] , 以牛血清白蛋白为标准蛋白测定蛋白质含量.
1. 4　核磁共振光谱测定及薄层层析
1H NMR 频率399195MHz, 90 ℃脉冲25 Ls, 脉冲延迟时间316 s, 累加128 次, 溶剂
DM SO 2d6, 参考标准: D
DM SO = 2150, 样品浓度5% (质量体积分数) , 控温误差±0. 1 ℃.
13C NMR 频率100157MHz, 90 ℃脉冲14 Ls, 脉冲间隔115 Ls, 宽带噪音去偶, 累加3 000
次, 溶剂DM SO 2d6, 参考标准: D
DM SO = 39160, 样品质量体积分数12% , 控温误差±0. 1 ℃.
薄层层析(TLC) 采用硅胶板法[ 7 ]. 在10 g 硅胶G260 干粉中加入0102mo lˆL 的乙酸钠溶
液25 mL , 搅拌均匀, 平铺在玻璃板上, 自然晾干后, 于120 ℃加热活化30 m in, 制成硅胶
板.
1. 5　刚果红实验
Fig. 1　Curve eluted on DEAE-cellulose
column by water
Fig. 2　Curve eluted on DEAE-cellulose
column by Na2B4O7 solution
参照文献[ 8 ]方法. 刚果红溶液浓度为215×10- 5 mo lˆL , 普鲁兰多糖溶液质量浓度为
10 m gˆmL. 将N aOH 依次配成不同浓度(012～ 110 mo lˆL ) , 将普鲁兰多糖溶液和刚果红溶
液混合(体积比1∶1) , 然后加入与混合液等体积的不同浓度的N aOH, 静置15 m in 后, 用
721 分光光度计依次测定混合液在不同浓度的N aOH 溶液中最大吸收波长的变化(以刚果红
溶液为对照).
2　结果与讨论
2. 1　普鲁兰多糖的纯化
2. 1. 1　Savage 法　参照文献[9 ]方法. 将610 g 普鲁兰多糖粗品稀释成115% 的水溶液400
mL , 加入100 mL 氯仿ˆ丁醇混合液(体积比4∶1) , 充分振荡使蛋白质析出, 以2 000 rˆm in
离心30 m in, 除去沉淀, 将上清液再用此方法处理, 重复7 次. 最后得到脱去蛋白的上清液.
将该上清液逆向流水透析3 d, 将其减压浓缩至200 mL 左右, 加入2 倍体积无水乙醇, 充分
搅拌, 放置过夜, 使普鲁兰多糖沉淀, 沉淀液以4 500 rˆm in 离心30 m in, 将沉淀用丙酮、乙
醚依次洗涤, P2O 5 干燥, 得普鲁兰多糖粉末518 g.
2. 1. 2　DEA E2纤维素柱层析　将经Savage 法除蛋白的普鲁兰多糖粉末溶于10 mL 蒸馏水
中, 进行DEA E2纤维素(硼酸型) 柱层析(313 cm ×40 cm ) , 洗脱速度为1 mLˆm in. 首先用蒸
馏水洗脱, 分部收集(每管5mL ) , 用改良的苯酚2硫酸法比色鉴定多糖部分, 洗脱曲线如图1
所示. 收集多糖峰, 减压浓缩、透析、冷冻干燥得412 g 样品1. 该层析柱用0112mo lˆL 硼砂
洗脱, 洗脱曲线如图2 所示. 同样收集多糖峰, 浓缩、透析、冷冻干燥得115 g 样品2.
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2. 1. 3　Sephadex G2100 柱层析　分别取样品1 和样品2 溶液进行Sephadex G2100 柱层析
(1 cm ×100 cm ) , 进样量为015 mL , 样品质量分数为017% , 用蒸馏水进行洗脱, 洗脱速度
为4 mLˆh , 用改良的苯酚2硫酸法比色鉴定多糖部分, 洗脱曲线如图3 和图4 所示. 样品1
和样品2 各有一个洗脱峰, 收集洗脱峰后分别冷冻干燥得白色粉末410 g P1和112 g P2.
Fig. 3　Gel f iltration of sample 1 on Sephadex
G-100 column
Fig. 4　Gel f iltration of sample 2 on Sephadex
G-100 column
经过Savage 法、DEA E2纤维素柱层析及Sephadex G2100 柱层析将发酵得到的普鲁兰多
糖进行纯化, 获得了纯品普鲁兰多糖, 总收率6617%.
2. 2　结构研究
2. 2. 1　薄层层析　取普鲁兰酶1 m g (含4 个酶活力单位) 溶于115 mL 柠檬酸2磷酸二氢钠缓冲液中(pH 510, 0103 mo lˆL ) , 将酶液均匀分为3 份, 分别加入10 m g 普鲁兰多糖标准品、
P1 及P2, 然后在37 ℃培养箱中保温酶解2 h, 将酶解液以标准麦芽三糖为对照在G260 硅胶
薄板展层, 展层体系为乙腈ˆ水(体积比85∶1) , 以硫酸ˆ甲醇(体积比1∶3) 为显色剂, 展层
完毕后将显色剂喷于硅胶板上, 在105 ℃加热显色. 由于普鲁兰酶可特异地水解多糖分子中
的A(1→6) 糖苷键, 而对其它糖苷键并没有作用, 所以普鲁兰多糖在普鲁兰酶的作用下, 水解
为麦芽三糖, 而其它多糖却无此结果. 从薄层层析图谱中可见, 普鲁兰多糖标准品和P1 被普
鲁兰酶水解后都形成了麦芽三糖. 说明P1 是由A(1→6) 糖苷键结合的麦芽三糖所组成, 即是
普鲁兰多糖. P2 在酶的作用下没有发生降解, 依然是多糖大分子, 停留在原点位置, 从而证
明P2 不是普鲁兰多糖而是其它多糖.
2. 2. 2　红外光谱　P1, P2 及标准普鲁兰多糖的红外光谱分析表明, 多糖分子的特征峰为
1 200～ 1 030 cm - 1处的MC
= O 峰和930～ 900 cm - 1处的D 2吡喃葡萄糖环振动峰[ 10, 11 ]. 普鲁兰多
糖标准品与P1 谱中出现多糖的特征峰, 其两条谱线几乎完全相同, 但与P2 谱线相差较大,
说明P1 为普鲁兰多糖, P2 为其它糖分子.
2. 2. 3　核磁共振　将纯品普鲁兰多糖P1 经核磁共振光谱分析, 其质子峰位移出现在
D 3. 1～ 5. 4 之间, 由于—OH 效应致使谱峰略增宽. 环侧基—CH2OH 的特征峰出现在
D 60. 34, 60. 58处, 表明结构单元中含2 个—CH2OH 基团. 由于多糖相连, 其糖苷键相连的
C1 峰移向低场, 出现在D 98174, 100156 和101129 处, 证明结构单元含有不等同的C1, 其它
各峰出现在D67. 03～ 80. 61处. 由1H 和13C NMR 特征峰可知, 该样品与普鲁兰多糖的结构
一致.
2. 2. 4　刚果红实验　刚果红(Congo red) 是一种染料, 分子式为C32H22N 6O 6S2N a2, 它可与具
有多股螺旋构象的多糖形成配合物, 配合物的最大吸收波长同刚果红相比发生红移. 在一定
的N aOH 浓度范围内, 配合物出现亚稳区[ 12 ]. 普鲁兰多糖在刚果红实验中, 与刚果红配合物
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的最大吸收波长虽然也发生红移, 但未出现亚稳区, 表明普鲁兰多糖分子并不存在多股螺旋构象. 这是由于普鲁兰多糖分子是由重复单位麦芽三糖经A(1→6) 糖苷键连接而形成的线性分子, 在该多糖的糖链中存在大量的(33% )A(1→6) 糖苷键, 由于A(1→6) 糖苷键存在一定的旋转自由度, 所以缺乏刚性, 在水溶液中有很大的柔曲性, 不易形成螺旋构象. 此外, 虽然普鲁兰多糖分子也含有66% 的A(1→4) 糖苷键, 但在一个重复单位中(3 个葡萄糖分子) 由于空间位阻也很难形成螺旋结构. 因而普鲁兰多糖分子不可能具有单股螺旋、带状等规则结构[ 13 ]. 其在水溶液中的构象只能为无规卷曲.
综上所述, 我们诱变得到的高产菌株(A u reobasidium pu llu lan s JB518) 经发酵得到的多糖确为普鲁兰多糖, 其构象为无规卷曲.