枯草芽孢杆菌渗透压调节基因proB的克隆和表达.pdf

!卷 期#年!月微生物学报!#$%&()&(*(+&$,&-&$%&!()*+&,%!#通讯联系人作者简介：张小青（-./0 1），男，在读硕士生，目前从事分子微生物学方面的研究。收稿日期：#-2#32#!，修回日期：#-2#.23枯草芽孢杆菌渗透压调节基因.(!的克隆和表达张小青曹军卫翟超陈建军（武汉大学生命科学学院武汉!0#/）摘要：用 456 扩增的方法从耐盐的枯草杆菌中克隆出一个-7089 长的:,(片段，经功能检测，证明正向插入片段与大肠杆菌的脯氨酸营养缺陷特性（!#$1）能够营养互补。含有该重组质粒的大肠杆菌:;+软件进行序列分析发现，该片段第-?-09)核苷酸编码一个由 0/#个氨基酸组成的蛋白质分子，其上游存在非典型的 1-#区，典型的 10 区和核糖体结合位点，起始密码子处有最佳翻译起始效率的侧翼核苷酸序列。将其与ABA9CB8 中的已知基因的序列和编码的氨基酸序列进行同源性比较，结果表明该片段与枯草杆菌-3D 的核苷酸序列、氨基酸序列的同源性分别为 D-=和.#=。证明该基因确实是一个!#E 基因。通过与三十个不同种属微芽生物!#E 基因的氨基酸序列比较，发现该蛋白存在有可能与形成酶的活性中心和三维结构有密切关系的几个绝对保守的区域。关键词：耐盐枯草芽孢杆菌，!#E 基因，克隆，序列分析中图分类号：F/D文献标识码：(文章编号：#-23#.（#）#2#-302#3微生物在高渗环境的胁迫下，大多都可以合成或从环境中吸收一些低分子量物质来调节自身的渗透压以平衡外界渗透压的增高，这些低分子量物质，包括 GH、糖类（海藻糖、蔗糖）、醇类、氨基酸及其衍生物（脯氨酸、甜菜碱）-，。微生物中累积这些低分子量物质主要是通过运输途径和合成途径。目前已发现枯草芽孢杆菌与脯氨酸运输有关的蛋白有 I)JK、4*%$、4*%L、4*%M、4*%N 等0，!。而脯氨酸的合成在微生物中是由谷氨酸经过2谷氨酰胺激酶（G）、2谷氨酰胺磷酸还原酶（46）和#2二氢吡咯22羧酸还原酶（456）三个酶催化而成，其中催化第一步的 G 酶是脯氨酸合成代谢的限速酶。它是受终产物脯氨酸的反馈调节。因此 G 酶活性的高低对脯氨酸的积累及与枯草芽孢杆菌耐渗透压能力的高低有关键影响。本课题组对枯草芽孢杆菌不同菌株的耐盐能力进行了测定，发现它们的耐盐能力差别很大，其中枯草芽孢杆菌.0-的耐盐能力最高。对其胞内相溶溶质的研究发现，该菌株在不含,C5&和含-7!O%&PQ 的,C5&的基本培养基中生长时，其自由氨基酸库中脯氨酸含量从几乎测不到增至 0070ORPR，表明脯氨酸是枯草芽孢杆菌.0-的主要相容溶质物质3。本研究报道了枯草芽孢杆菌.0-的 G 酶基因!#E 的克隆，对其进行了核苷酸序列分析，并在大肠杆菌中进行了功能测定。希望研究该基因与细胞渗透压调节的关系，为阐明耐盐微生物的耐盐机理奠定了基础。!材料和方法!材料!#!#!菌株和质粒：枯草芽孢杆菌（!#$%&()$%$）!#$#，由中国典型菌种保藏中心（%&%）提供；大肠杆菌#($(*!)#+,#*+!（%#*+-!）+,#.，购于中国微生物菌种保藏管理委员会的普通微生物中心（%+,%）；大肠杆菌（/*#-%$）-.$!&*/!%#0#0!（1)%#1!2#$）345#2+,#.%,64.%78+.!0)3$3#+,%#，由本实验室保存。4,-3&载体，由45%#1 载体改造而成。!#!#$试剂和培养基：4,-3&载体克隆试剂盒，6%7 扩增试剂盒，均购于&89878 公司。低熔点琼脂糖购自:;?培养基按照文献 2 的方法配制。?,培养基成分为：（.）(:A/#，9(.6A/2，9.(6A/，,:A/2.(A)#，葡萄糖#)。B,培养基是在?,培养基中加入柠檬酸三钠)$。!#$方法!#$#!染色体-D 的制备：枯草芽孢杆菌!#$#基因组-D 制备参照林万明的方法，用酚、氯仿进行纯化1。!#$#$引物设计及 6%7 扩增：登录+EF?8FG 查找相关的*+-!基因序列，主要参考枯草芽孢杆菌#01 的*+-!基因序列，运用 6%CEFE 软件分别在*+-?基因上游和下游设计引物。上 游 引 物$3%D%DD+%+%+&%DD&%DD+&+3H；下 游 引 物$H3%D+&%&+%+3+D+&%+&+%3H。6%7 扩增参照&89878 的 BI3&8J 6%7 试剂盒。实际的反应条件如下：!/K，$=;F；#/K，(=;F；$!/K，#=;F；%$/K，2)L；&2(K，(=;F；从第$步至第&步进行共)个循环；!/K，#=;F；($K，(=;F；)2(K，#)=;F；*/K，#)=;F。!#$#%重组质粒的构建和阳性克隆的筛选：用 4,-3&载体克隆试剂盒进行扩增产物的克隆。扩增产物用#)M低熔点琼脂糖凝胶电泳并回收，然后与 4,-3&载体按$N#的摩尔量混和，加入连接酶，在#0K下连接反应)=;F 后，转化大肠杆菌-.$!，并涂布在补充有I38O、P6&+和 D=4（#)+）的?平板。用蓝白斑法筛选阳性克隆。!#$#&重组质粒的鉴定：根据克隆载体上的多克隆酶切位点和扩增产物上预期的酶切位点的位置，选择合适的限制性内切酶，进行酶切后，用琼脂糖凝胶电泳鉴定。!#$#插入片段的功能鉴定和受体菌的耐盐能力：提取外源片段为正向插入的转化子 4,3-431 的质粒，参照文献 2 方法将该质粒转入 6QR?S大肠杆菌#($(中，涂布在含有 D=4 的B,平板上，2K培养(/T 后，筛选转化子。将含有重组质粒的大肠杆菌-.$!和不含质粒的该菌分别同时接入不同盐浓度并加入维生素?#的基本培养基中，2K培养/1T。!#$#(序列测定：提取鉴定好的重组质粒，送武汉金贝公司进行序列测定。首先用,#正反向引物从插入片段的两端对测，然后用引物步行的方法将全序列测通。$结果和讨论$#!6%7 扩增和重组质粒的构建采用&8G878 的 BU3&8 6%7 试剂盒，按照使用说明所述，进行 6%7 扩增。扩增产物进/0#微生物学报/(卷究!#证明，能累积脯氨酸的大肠杆菌突变株和转入外源!#$基因后的大肠杆菌，提高了耐渗透压的能力。这两者的结果是完全的相反。我们的结果与后者的结论相似。外源!#$基因的导入使大肠杆菌耐盐能力提高的原因，可能是枯草芽孢杆菌的!#$基因编码的%&酶对终产物脯氨酸的反馈抑制敏感性差，或可能是外源基因的导入增加了%&酶的表达量。!#$基因影响大肠杆菌耐盐能力的真实原因还有待于进一步研究。!#序列测定及分析通过引物步行法测定该插入片段的核苷酸序列，一共!#()*（图#）。用+,-./.软件进行序列分析发现，第!00 1!0#)*核苷酸编码一个完整的开放阅读框架（234），在 5!#的反向引物下游有起始密码子-6%，终止密码子为 6%-，其间编码一个由#(个氨基酸组成的蛋白质分子。在起始密码子的上游 7()*处有一个富含嘌呤碱基的%-%核糖体的结合位点（3$8），一个非典型的 7!区 66%-66 和一个典型的 7#区 66%-6%。这说明该片段具有完整的启动子结构和编码区。起始密码子-6%与核糖体结合位点处之间的距离为()*，在翻译起始的最佳范围()*9 0)*之内。另外，起始密码子处还有最佳翻译起始效率的侧翼核苷酸序列-6%-，其转录产物的翻译效率是所有起始密码子侧翼核苷酸序列中最高的，能在翻译水平上提高酶的产量!:，!。这种结构能使枯草芽孢杆菌受到外界高渗透压刺激时，在!#$基因转录水平提高的基础上，同时翻译起始效率高，而使枯草芽孢杆菌为适应外界高渗环境而积累脯氨酸时更为有效。!$同源性分析将所获得的$#$基因，与%;$=中的已知基因的序列和编码的氨基酸序列进行同源性比较，结果表明在给出的 0#(个序列中，同源性最高的是%&()*+*,-()(+!?，其核苷酸序列、氨基酸序列的同源性分别为!A和 BA。与耐盐芽孢杆菌的同源性则分别为A和(0A。%&()*+*,-()(+!?的$#$共有#:个氨基酸。而枯草芽孢杆菌 B#!的$#$为#(个氨基酸。在它的 C 端比%&()*+*,-()(+!?的$#$多出!?个氨基酸。通过进一步与栖热菌属和芽孢杆菌属等#个不同属微生物!#$基因的氨基酸序列比较，发现该蛋白存在 DD,E,+，%+,+5，%6%5 等几个绝对保守的区域。它们可能与形成酶的活性中心和三维结构有密切关系。另外，在嗜热栖热菌（./01*+-/01#!/()*+）中，%&酶的,端#个氨基酸，在空肠弯曲杆菌空肠亚种和酿酒酵母等几个菌中，此酶 C 端约九十多个氨基酸可以缺失，而不影响其功能。推测多余的氨基酸很可能与微生物适应各自的生存环境有关。参考文献!5/FGH=I，,=J=K=8，5=K.GFLKL 6M%(#+(%(#-0/%(#/01，!BB:，$%（!）：!(#1!(:M 0 8LN;H.&3，%G.=OG.3 PM 2!)345(#4 6(#,，!BB，&（!0）：:#0 1:#M#&;F*Q$，$H;F;H EM 2/6(#,(#)，!BB，()（#）：#!B 1#M:R/S，I=.;T，4H/K.UV 4 4，5=/=K/.6M 5LO;UGO=H COL/J：-R=)LH=KLHW 5=G=OM 0：CLOX 8*H/J I=H)LHR=)LH=KLHW PH;.，!BBM(?!0 期张小青等：枯草芽孢杆菌渗透压调节基因!#$的克隆和表达!林万明细菌分子遗传分类鉴定法上海：上海科学技术出版社，#$%&(&)$*+,+-./0 1 2，34056 7*，189,/:80 7;，!#$%&!(&!，#$!)，!（&）：#%)(#%8+?，A0.9=/9 B，!#$)$#(*+,-.$，#$&，#$%（#）：#CC(#!，58,9/0 G，!#$/!(!，#$!，&（）：#$(%&#;8=80/-.H，I50-89.，*.JJ8 B，!#$012%2&3.4.$5!，%，#!（#）：#)K(#)C#K 36.4L 2 M 6 7#&!3.$，#$!&，#&（K）：#%!(#%$K#)童克中基因及其表达北京：科学出版社，#$#!C(#!$#&N868+JL.O 89&$!&:&;-!-，#$#，#(（#%）：C#&)*+,-,./,0 1234566-+,+7/869+45.:*/;+4 74+9?/*+;+*54/,;$%&()*)+,(*PL89Q R.85S.9QD85 T+9?/.!PL8.DL85DL/9Q T.89U+9（=.$!.?5?!%&!(&!，9+#(A(B!3-,，9+#()K%C，=+(#）A6;4/B;：7#K:V W08Q6/94.=J-59/,W056 L8-545-/084/,7#&$9-94$-$K#&#?.4L AD*86X-.W.YJ84.59 6/4L5,，89,.4=X5=.4.F/-ZY,.0/J4.598-Z.9=/04/,W08Q6/94 J89 J56X-/6/94/,?.4L*3.7Y1&.$VZ W+9J4.59 4/=4 8-545-/084/,8V.-.4Z 5W 1&.$1&!L8F.9Q 4L.=0/J56V.984.59 X-8=6.,0.=/=W056 45).9 6.9.68-6/,.+6 ML/9+J-/54.,/=/S+/9J/5W 4L.=W08Q6/94.=5V48.9/,VZ X0.6/0?8-:.9Q 6/4L5,E+J-/54.,/=/S+/9J/5W 4L.=W08Q6/94#C(#$VX 4089=-84/=8 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