粪便细菌学规范.doc

粪便细菌学检验操作规范实验室常规检查是细菌培养，沙门氏菌、志贺氏菌、邻单胞菌和气单胞菌、副溶血性弧菌、致泻性大肠杆菌作为实验室常规培养的主要腹泻病原菌。一 、标本采集与运送：1标本采集 （1）标本采集尽可能在发病早期和应用抗菌药物治疗之前。在不同的时间采集23份标本可以提高致病菌的分离率。（2）自然排便采集粪便标本时，取有脓血、粘液、组织碎片部分的粪便13g。液体粪便则取絮状物，一般取13ml，直接装入粪便容器或保存液或运送培养基中送检。（3）直肠拭子采集粪便标本，检查带菌者时可以采取肛拭（棉拭先用保存液或增菌培养基湿润），深入肛门内710cm除采样，不能及时接种时，应将标本放入保存液内。 (4)容器应清洁、带盖、广口的（不宜使用纸盒）、送检的标本中不能加入防腐剂。 2 标本运送（1）粪便标本应尽快送检，室温条件下不能超过2h。如不能及时送检可加入pH7.0的磷酸盐甘油或转运培养基，但不宜超过24h。使用改良Cary-Blair培养基时，不能运送培养志贺氏菌的标本。（2）直肠拭子采集的标本必须置入运送培养基或GN肉汤中送检，转运时间不宜超过2h。（3）高度怀疑霍乱弧菌感染的标本运送必须符合特殊标本的安全要求。（4）直肠活检标本用粪便容器送检，内盛少量无菌蒸馏水以防止沉淀。3标本保存 不能及时检验的标本通常4-6保存，用磷酸缓冲盐甘油溶液保存培养沙门氏菌和志贺氏菌的标本，保存培养弯曲杆菌和弧菌的标本，需加CaCl2(100mg/L)。二、标本镜检粪便标本直接镜检找到大量多核白细胞，提示侵袭性致病菌感染。如果是由肠道菌群紊乱引起的腹泻，革兰氏染色结果可以提示是酵母菌还是葡萄球菌感染。2.革兰氏染色制备一张薄的粪便涂片，采用常规革兰氏染色方法。镜下观察是否有大量WBCs，成丛的革兰氏阳性球菌，酵母菌。 3.水样粪便的标本，采用悬滴法暗视野（或相差显微镜）镜检，如发现细菌呈穿梭状极活泼的运动，则考虑为弧菌感染。加入O1群霍乱弧菌诊断多价血清或O139血清，显微镜下观察若运动停止则为抑动试验阳性。采用悬滴法镜检发现投镖式或螺旋式运动的细菌，革兰阴性弧形、S形或螺旋形的小杆菌，提示弯曲杆菌感染。三、细菌培养及培养基的选择1腹泻病原菌常规培养对患者粪便标本进行腹泻病原菌常规培养，包括沙门氏菌、志贺氏菌、致泻性大肠杆菌、邻单胞菌、气单胞菌，致病性弧菌。此外，也包括可引起菌群失调的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和酵母菌。粪便标本至少应接种血平皿、HE（XLD或SS）、EMB（或MAC或中国兰）等培养基。沿海地区还需增加TCBS琼脂培养基。补充说明：（1）SS培养基对部分志贺氏菌有抑制作用。（2）常用的肠道选择性培养基（如SS等）对气单胞菌、邻单胞菌有抑制作用，初次分离时应接种血平皿和MAC。（3）若用EMB（伊红美兰）、MAC（麦康凯）等培养基培养后，未检出常见致病菌，但感染性腹泻症状明显，可重新采集粪便标本接种GN 肉汤，35培养 4-6h，再转种HE（肠道琼脂）等培养基，进一步分离培养。（4）如怀疑沙门氏菌感染，可先用SF肉汤（亚硒酸盐增军液），以提高检出率。（5）正常人体肠道内可以存在金黄色葡萄球菌，因此只有每克粪便细菌数达到105CFU时才有临床意义。（6）气单胞菌能够在常规的鉴别培养基如MAC和EMB上生长，但选择性培养基更有助于检出气单胞菌。选择性培养基：每10ml的BAP（血琼脂平板）培养基加入10mg氨苄西林（BAP-AMP）。（7）邻单胞菌可以在一些常规鉴别培养基如MAC或HE生长，但选择性培养基更有助于检出邻单胞菌。选择性培养基：IBB琼脂（肌醇-亮绿-胆盐琼脂）。2腹泻病原菌的增菌培养早期培养物传代培养后使用增菌肉汤培养，能提高低数量菌的检出率。常用增菌液有：GN肉汤：用于沙门氏菌和志贺氏菌的增菌培养，严格保证培养4-6h后即进行传代。SF肉汤：主要用于沙门氏菌的增菌培养，经36培养 24h后，接种鉴别培养基进行分离培养。TT肉汤：主要用于沙门氏菌的增菌培养，但不包括伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌，培养12h后尽快传代。碱性蛋白胨水：主要用于弧菌增菌， 35-37培养5-8h后，传代到TCBS平板上培养。 四、培养物鉴定1、志贺氏菌的鉴定 志贺氏菌属包括4个种即痢疾志贺氏菌（S.dysenteriae）、福氏志贺氏菌（S.flexneri）、鲍氏志贺氏菌（S.boydii）、宋内氏志贺氏菌（S.sonnei）。志贺氏菌血清学分群分为A、B、C、D四群。目前，A群含有15个血清型，B群含有8个血清型（前5个血清型又进一步分为11个亚型），C群含有19个血清型，D群只含有1个血清型。 对于肠道培养基上可疑为志贺氏菌的菌落，首选鉴定试验：赖氨酸脱羧酶试验、动力试验、葡萄糖产气试验、粘液酸盐试验、克氏柠檬酸盐试验、乙酸盐实验。志贺氏菌上述这7个试验均为阴性。志贺氏菌还必须进行血清学鉴定，可使用玻片凝集方法。但对于生化试验符合志贺氏菌而血清凝集试验弱阳性或不凝集时，应制备生理盐水菌悬液，100水溶1530min，冷却后观察自凝现象，如果自凝试验阴性，再进一步使用抗血清做凝集试验。 2、沙门氏菌的鉴定沙门氏菌种及其亚种鉴定沙门氏菌属在含有乳糖的鉴别培养基经36培养 18-24h后，其菌落一般为无色透明或半透明，中等大或叫较小，边缘整齐、光滑，稍呈隆起。多数沙门氏菌因产生硫化氢，在SS、HE培养基上可形成中心带黑色或墨绿色的菌落。生化反应鉴定为沙门氏菌或志贺氏菌的菌株还要进行血清学鉴定确定菌体抗原（O抗原）。沙门氏菌和志贺氏菌都应进一步进行血清学和全面生化鉴定。 3、 弯曲杆菌的鉴定 培养24-48h后检查弯曲杆菌的特征性菌落：有扁平的、能扩散的、可以弥漫整个平板表面的菌落；有很小的、凸起的、半透明的菌落。颜色可为灰色、黄色或粉红色。氧化酶试验阳性。 取可疑形态菌落进行革兰氏染色。由于常规革兰氏染色时弯曲杆菌不易着色，可用蕃红或石炭酸复红染液染片3min。最适于弯曲杆菌的染色方法是用0.1% 的碱性复红染液染片3min。显微镜下观察弯曲杆菌是小的、轻度弯曲的G杆菌，呈“S”型或海鸥型。动力试验：弯曲杆菌悬于肉汤培养液如营养肉汤或Mueller-Hinton(M-H)肉汤中，用相差显微镜或光学显微镜观察动力，盐水和蒸馏水可能抑制其动力。 血清学试验：用玻片乳胶凝集试验商品试剂盒能鉴定到属的水平即空肠弯曲杆菌、海鸥弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌。此试验是检测以上3种细菌的细胞壁抗原。当抗原与用弯曲杆菌抗体包被的乳胶颗粒悬液发生反应时即产生凝集现象。 DNA探针：DNA探针商品试剂盒能鉴定出空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌和海鸥弯曲杆菌，但不能进行种间鉴别。该试剂盒利用非放射性检测系统4h内即获得快速检测结果。 快速马尿酸盐水解试验：马尿酸盐试验阳性鉴定为空肠弯曲杆菌，马尿酸盐试验阴性需进一步鉴定。 萘丁酸和头孢噻吩敏感试验：制备2-3mlBHI或Mueller-Hinton(M-H)肉汤微菌悬液。将菌悬液均匀涂布于血平板使菌落融合生长。再将30ug萘丁酸和30ug头孢噻吩纸片贴在平板上。在弯曲杆菌的微需氧环境下培养24h，如纸片周围出现抑菌环为敏感。4、弧菌的鉴定观察培养后的TCBS平板，挑选符合弧菌菌落颜色和生长特征的菌落进行鉴定，生化筛选结果阳性的菌落应进行全面生化鉴定。TCBS平板上培养48h后方能报告阴性结果。一些大肠杆菌、弯曲杆菌和肠球菌也可以在TCBS培养基中生长，但通常情况下其菌落小且为半透明。变形杆菌发酵蔗糖产生的黄色菌落一定要仔细与弧菌的黄色菌落相区别。邻单胞菌和气单胞菌都可以在TCBS平板上生长，它们通常形成蓝色菌落。选血平板上非假单胞菌落进行氧化酶试验，氧化酶阳性可能为弧菌或气单胞菌。常规肠道培养基上生长的弧菌不发酵乳糖。与腹泻性疾病相关的弧菌要鉴定到“种”的水平。嗜水气单胞菌易被错误鉴定为河弧菌。河弧菌可通过以下1个或2个试验鉴别：O/129敏感试验（备0.5 McFarland标准菌悬液，涂布M-H琼脂平板，贴上50ugO/129的纸片，35-37培养24h，观察抑菌环，河弧菌/129敏感，气单胞菌/129耐药）；NaCl刺激生长试验（分别接种不含NaCl和含1% NaCl的营养肉汤，35-37培养18-24h，观察生长状况。气单胞菌在不含 NaCl和含1%NaCl的营养肉汤中均不生长，河弧菌是一种嗜盐弧菌，没有NaCl不生长，在含1%的NaCL营养肉汤中生长。血清学鉴定霍乱弧菌：用霍乱弧菌O1抗血清鉴定霍乱弧菌。O1群霍乱弧菌和非O1群霍乱弧菌都能引起霍乱样疫病，但O1群菌株最易引起流行。将可疑菌落尽早用非选择性培养基进行密集划线传代，35-37培养5-8h后制成奶样菌悬液，在玻片上将1滴此菌悬液与1滴抗血清混合，晃动玻片1min，观察是否凝集，凝集反应阳性提示为霍乱弧菌O1群，然后再通过生化反应验证血清学鉴定。实验室如果无O1群抗血清储备，一定要将霍乱弧菌分离物送至当地卫生防疫机构实验室。5、致病性大肠埃希氏菌的鉴定 目前尚无稳定特异的生化试验能鉴别粪便标本中致病性大肠埃希氏菌和非致病性大肠埃希氏菌。EPEC、ETEC、EIEC和STEC的血清型只作为鉴定致病性大肠埃希氏菌的一个方面。确证大肠埃希氏菌致病性的方法有：细胞毒素测定、侵袭试验、DNA探针检测致病基因、组织培养测定细胞毒素等。（1）STEC（以前称EHEC）:发病5天内留取粪便标本，大肠埃希氏菌O157：H7是最常见的能引起出血性结肠炎的血清型，但EPEC O26：H11和O111也能产生细胞毒素而引起此综合征。在山梨醇麦康凯培养基上为无色菌落。 鉴定：选择5-10个乳糖阳性菌落接种于山梨醇麦康凯平板培养基上进行山梨醇发酵试验，选择5-10个山梨醇发酵试验阴性菌落进行O157抗血清和H抗血清试验，用O157抗血清凝集阳性的菌落进行生化鉴定。赫氏埃希氏菌（E.hermannii）也能凝集O157抗血清。致病性研究：检测粪便中的细胞毒素和分离物产生细胞毒素的能力。大肠埃希氏菌O157及其它STEC可以在粪便标本中产生细胞毒素。将经过鉴定的大肠埃希氏菌O157：H7提交有关实验室进行细胞毒素检测。注意：不是所有的O157：H7血清型都可产生细胞毒素。（2）ETEC ：在初次分离培养基上ETEC不能与其它非致病性大肠埃希氏菌相区别。从初次分离平板上取10个菌落分别进行埃希氏菌纯化培养、鉴定为大肠埃希氏菌。对可疑菌株进行毒素研究，将上述10个菌落的分离物进行热稳定或热不稳定肠毒素试验，方法有ELISA法、胶乳凝集试验或DNA探针技术。如高度可疑应将分离物和粪便标本送到有关实验室检测。 (3)EIEC、EPEC： EIEC和EPEC均不能与非致病性大肠埃希氏菌相区别，对5-10个可疑大肠埃希氏菌落进行生化鉴定。将分离物和粪便标本送到有关实验室进行血清学和致病性研究。