规范血液及骨髓标本细菌学标准操作规程.doc

湖南省肿瘤医院
检验科
Clin Lab.HNZL

标题：血液及骨髓标本细菌学检验标准操作规程
文件编号：HNZLYY/LAB-SOP-WSW-601
版本号：2
修改号：0
生效日期：2013-07-01
发行部门：质量管理小组
编制人：陈建国
审核人：肖平
批准人：吴白平
页码：第 8 页 共 61 页

1. 目的
规范血液及骨髓标本细菌学标准操作规程，确保检验结果准确可靠。
2. 适用范围
血液及骨髓。
3. 标本
3.1 标本类型　血液及骨髓。
3.2 标本采集　
3.2.1 采血时间　抗菌药物治疗前，发热初期或高峰时抽血。
3.2.2 采血频率　对怀疑菌血症的成人患者，推荐同时在不同部位采集2~3套（每套包括一瓶需氧瓶，一瓶厌氧瓶或者两套需氧瓶）对感染性心内膜炎和真菌血症则应多次采集；婴幼儿患者，推荐同时在不同部位采集2套，可不做厌氧培养。
3.2.3 采血量　以无菌方法从患者肘静脉或股动脉采血。采血量以培养基的1/10为宜，成人一次采血10-20ml，儿童为3-5ml。血液抽出后，立即以无菌操作注入血培养瓶，充分混合后送检。
3.2.4 骨髓标本　用骨髓穿刺针从髂骨采集1-2ml,立即以无菌操作注入血培养瓶，由于骨髓标本量少可选择小儿需氧瓶及厌氧瓶。
3.3 标本拒收标准
3.3.1 血培养瓶破裂或有明显污染。
3.3.2 培养瓶标识与化验申请单不符。
3.3.3 用过期的培养瓶采集标本，采血量不足等。
3.3.4 对于不合格标本，应及时通知采集人员重新留取标本。
3.4 标本保存
采集标本后立即送到实验室，不能及时送检可置室温，切勿放冰箱。冬季血培养瓶在送检过程应采取一定的保暖措施。
4. 试剂、仪器
4.1 革兰染液、氧化酶试剂、3%触酶、血琼脂平板、巧克力平板、中国蓝平板、沙保罗平板相关生化试剂等。
4.2 BACT 9050全自动血培养系统、ATB Expression鉴定及药敏分析仪。成人需氧血培养瓶，厌氧血培养瓶、儿童血培养瓶、TDR系统鉴定卡及药敏板。
4.3 接种针、接种环、电热灼烧器、显微镜、孵育箱、CO2 培养、生物安全柜等。
4.4 试剂的有效期和使用参照试剂说明书。
5. 细菌鉴定和药敏质控
参见《微生物组室内质量的控制程序》。
6. 检验步骤
接收标本后，立即用Lis系统签收对标本进行编号、登记。门诊病人要同时登记联系电话等病人信息。
6.1 自动化培养
6.1.1 置全自动血培养仪中。当标本有菌生长时，仪器发出阳性报警，应立即用无菌注射器抽取瓶内培养液作直接涂片革兰染色，镜检，将结果向临床医生报告，同时转种血琼脂平板，中国蓝平板或加做巧克力平板，并进行直接药敏试验，置35℃、5% CO2 培养箱培养18~24h。若涂片为酵母样真菌时，转种到念珠菌培养基上。从琼脂平板上挑取菌落进行涂片染色及触酶和氧化酶试验。革兰阳性菌和革兰阴性菌分别选用相应卡片上机进行细菌鉴定和药敏试验或者做K-B法药敏试验（具体操作见《药物敏感性试验标准操作规程》）。
6.1.2仪器培养为阴性，报阴性后卸下血培养瓶，可报阴性结果。
6.2 手工培养
6.2.1 将血培养瓶置35℃孵育箱，经18~20 h孵育在血琼脂平板或巧克力平板上盲目转种一次。
6.2.2 盲目传种后，培养瓶继续孵育至第5日，每日观察一次有无菌生长，并摇匀继续培养，下列几种情况提示有细菌生长。见下表1。
表1 培养瓶中有细菌生长时的不同反应
反应
菌种
浑浊并有凝块
金黄色葡萄球菌
均匀浑浊，发酵葡萄糖产气
大多为革兰阴性菌
微浑浊，有绿色变化
肺炎链球菌
表面有菌膜，培养液清晰，底层溶血
枯草杆菌
表面有菌膜，膜下呈绿色浑浊
铜绿假单胞菌
血细胞层上面出现颗粒状生长，有自上而下的溶血
溶血性链球菌
厌氧培养瓶有变化，而需氧培养瓶无细菌生长
可能为厌氧菌
根据肉眼观察，对有细菌生长迹象，取菌悬液涂片作革兰染色，同时分离培养，接种需氧血琼脂平板，中国蓝平板或加做巧克力平板，并进行直接药敏试验，置35℃、5%CO2 培养箱培养18～24h。次日纯培养再进行鉴定及药敏试验。
7. 操作流程

血液、骨髓

置血培养仪瓶中

厌氧培养

需氧培养

血培养仪报警，挑取培养物

涂片、染色

细菌种类

转种平板35℃
培养18～24 h

直接药敏

二级报告

一级报告

观察菌落特征
及涂片、染色

仪器或手工细菌
鉴定及药敏试验

三级报告（最终报告）

8. 结果报告
8.1 阳性结果报告　报告通常分为三级：
8.1.1一级报告　阳性报警血培养瓶应进行涂片革兰染色，将涂片结果电话（或其他方式）通知临床，同时记录报告的日期、时间、内容以及接收报告人的姓名和工号。血培养阳性应列为危急值。
8.1.2 二级报告　报告直接药敏试验结果。
直接药敏试验，将血培养阳性标本进行革兰染色，如涂片找到细菌，根据革兰染色结果选择药敏所用培养基（Muller-Hinton或含5%羊血Muller-Hinton琼脂平板），取阳性血培养标本约0.2ml，用无菌棉签均匀涂布于琼脂表面，根据革兰染色结果选择所用抗菌药物的纸片，如镜检见革兰阴性杆菌，选择肠杆菌科常用的抗菌药物纸片；若为革兰阳性球菌，成对排列，选择葡萄球菌用的抗菌药物纸片。然后置35℃，孵育18~24h读取初步药敏结果。纯培养再进行菌株鉴定和药敏试验，发最终报告。
注：最终结果如与初步报告不符，应及时与临床沟通，并在书面最终报告注明变更内容。
8.1.3 三级报告　报告细菌种属、药敏试验、结果评价和建议。
8.2 阴性结果报告　血培养72h未见细菌生长，应通知临床医师，以便作相应处理，但培养瓶要继续培养至第5日，方可发出阴性报告。如果发现有菌生长，可补发报告。
8.3 对发出报告进行销号，并作好菌名或无菌及报告日期登记。
8.4 传染病（伤害沙门菌）报医务部\或防保科。
8.5 传染病菌种保存(伤寒沙门菌)交疾病控制中心复核。
9. 注意事项
9.1 抽血后无需更换针头即可注入血瓶中。
9.2 抽血前即应贴好标签，标签不能贴到条形码。
9.3 若不能立即送至实验室，应置于35℃温箱或室温，绝不可放置冰箱。
9.4 有自动血培养仪的实验室，应及时处理阳性报警标本。
9.5 如不同部位采集的两瓶血培养瓶出现一瓶阳性一瓶阴性，或者出现两瓶均为阳性，检测结果均为凝固酶阴性葡萄球菌， 这两种情况都应该向临床报告和沟通。
10. 临床意义
引起败血症的多为耐药性金黄色葡萄球菌、某些革兰阴性杆菌及部分球菌。疖、痈、脓肿和化脓性骨髓炎继发的败血症主要由金黄色葡萄球菌和β溶血链球菌引起，尿道、胆道、胃肠道炎症和黏膜损伤引起的败血症以大肠埃希菌最常见，烧伤后铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌多见。伤寒和副伤寒于病程第1～2w做血液细菌培养，伤寒和副伤寒沙门菌的检出率可达80%～90%。
11. 危急值报告
仪器报警阳性标本直接涂片、革兰染色，确定细菌种类，应立即向临床报告细菌涂片结果。
参考文献
1 CNAS-GL23《医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用指南》, 2013
2周庭银编著. 临床微生物学诊断与图解. 第二版. 上海: 上海科学技术出版社, 2007
3 叶应妩, 王毓三, 申子瑜主编.全国临床检验操作规程. 第3版 .南京: 东南大学出版社。
4 Murray PR. Manual of Clinical Microbilogy. 9th ed. Washington: ASM Press, 2007
5 徐英春, 倪语星, 王金良, 等主编. 血培养操作规范. 上海: 上海科学技术出版社, 2002

血液操作规程
1．概述
血液是临床微生物室所接收培养的重要标本，在大多数病人血液中出现细菌为菌血症。原发性菌血症来自机体部位污染细菌，如粘膜的细菌入血，可能经历亚临床结果，继而出现临床的菌血症。败血症包含菌血症，意指带有临床迹象和症状，如发热、寒战和心动过速。败血症休克提示败血症伴有血压过低，严重败血症是以败血症休克伴有器官或全身衰竭特点，20%-40%死亡率。继发性菌血症，如肺炎原始部位的感染播散菌血症。
2．标本采集
2.1 一般情况下，在病人发热高峰时，采集血液标本。对持续性菌血症可不考虑采血时间，而某些间歇性菌血症，应在病人体温上升期采血。采血时间原则上应选择在抗菌药物应用前，对已用药而不能中止用药的病人，应在下次用药前采集。用药前24小时内采集3－4次血液标本，可使细菌检出率高达90％。
2.2一般在肘静脉采集血液，其次是股动脉。采血部位的局部皮肤应彻底消毒，通常用碘酒涂布消毒，干后用75％酒精擦拭，消毒时应以穿刺部位为中心逐渐向外延伸消毒。
2.3系上止血带，抽取5-10ml血液，若为婴儿或小孩则只抽取2-5ml血液。
2.4将液注入BD血培养瓶，婴儿或小孩则用小儿专用BD血培养瓶。
2.5疑似分枝杆菌感染或霉菌感染之病人则抽取血液10ml，注入血液于专用结核培养瓶或真菌培养瓶。
3．标本处理及注意事项
3.1 每一发烧病人抽血次数以每次抽二瓶为原则，同时左右肘臂各抽一瓶。如果病患情况危急，同时亦可采集身体不同部位血液做两套培养。但是不可由血管导管抽取血液样本。
3.2 抽取血液后，不需要更换针头即可注入血瓶中，以避免针扎后污染率提高。
3.3 抽血前，血瓶应先将病患标签贴好，病患标签不可贴在血液培养瓶的条码上及玻璃上。
3.4 注入标本的血培养瓶务必立即送至微生物室。如因某种原因不能立即送检时，应放置室温，切勿存放冰箱。微生物室收到血培养瓶后应立即登记后放入培养箱。
3.5 两种以上细菌或细菌和真菌同时或交替感染引起的败血症，虽其中有一种主要致病菌，但必须同时报告。对检出的细菌肯定是血中的病原菌的标准是：
3.5.1两次血培养结果为同一细菌。
3.5.2患者2－3周后血中抗体滴度明显升高，应作败血症的病原菌处理。
3.6 对于血培养中出现的细菌，如果暂时鉴定不了或罕见细菌，可作药物敏感试验，将结果报告临床医生。同时将菌种报上一级单位继续鉴定。
4．检验步骤.(血液培养仪BACTEC 9050操作规程)
4.1 放入培养瓶
4.2 开门前按复位键，打开机箱门。
4.3 按放瓶键
4.4 拿瓶子上的条形码在机器右下角发红光处扫描，听到叫声后扫描完毕。
4.5 根据屏幕显示的位置放入培养瓶。
4.6 按OK键
4.7 按关门键退出，关门。
4.8 取出阴/阳性瓶
4.9 开机前按复位键，开门。
4.10 按阴性瓶键/阳性瓶键指定位置选择取出阴/阳性瓶
4.11 将阴/阳性瓶上的条形码扫描。
4.12 按关门键退出，关门。
4.13 若有阳性瓶，仪器将会自动报警，按以上方法取出阳性瓶，直接涂片镜检，并转种相关培养基。
5．分级报告
5.1 紧急口头（电话）报告：血培养仪在血液出现阳性时会自动报警，接到报警，将仪器上培育瓶取出，立即进行转种血平板；涂片革兰染色；镜检。并在最短时间内将结果向临床主管医生进行紧急口头（电话）报告。报告内容应包含以下内容：
5.1.1 报告者全名（或工号）；
5.1.2 报告的时间（无论成功或不成功）；
5.1.3 所联系医生的全名（或工号）；
5.1.4 报告镜检结果,并强调其紧急价值；
5.1.5 确认临床医生收到报告并复述结果。
5.2 做直接药敏试验，第二天报告结果。
5.3 按涂片、染色、纯分血平板菌落形态，选择相应的方法作进一步鉴定及药敏试验。
阳性培养报告最终鉴定结果、最终药敏结果。
6．其他报告和记录
如血液培养仪没有报警，每天必须观察一次，作好记录。五天阴性者，可报告：血液培养五天无细菌生长。
6.1 标本被拒收时，应立即通知临床医生，立即重新采血，并记录在案。
6.2 最终结果与紧急报告结果不符，需变更时，应立即与临床医生沟通，做紧急口头报告。同时必须在书面报告上提供正确的结果，同时注明变更的内容。
6.3 其他需要临床医生注意的事项如：本次采血量不足；标本转运时间过长；标本采集份数不够等信息。
7．检验结果的判断与分析
7.1 急性败血症、脑膜炎、骨髓炎、关节炎、急性未处理的细菌性肺炎和肾盂肾炎，应该在治疗前从不同部位采集血液标本，分别接种于需氧、厌氧血培养瓶内。
7.2 可疑为心内膜炎，体温不太高的持续菌血症，应增加采血次数。
7.3 急性病例：治疗前在1-3h内在3个不同部位取3份标本。
7.4 亚急性病例：第1天取3个标本，24h后，若全阴性再取3个标本。
7.5 若已用了抗生素的心内膜炎患者，连续3天每天取2个标本。
7.6 已用抗生素治疗的其他患者，在48h内取6个血标本，每次在使用抗生素前采标本。
8．血液培养中常见的病原菌
革兰阳性菌: 革兰阴性菌:
葡萄球菌属 脑膜炎奈瑟菌
链球菌属 卡他莫拉菌
肠球菌属 伤寒及副伤寒沙门菌
厌氧链球菌 肠杆菌科细菌
李斯特菌属（产单核） 假单胞菌属
产气荚膜梭菌 不动杆菌属
丙酸杆菌 流感嗜血杆菌
念珠菌 弯曲菌属
拟杆菌属
梭杆菌属
9．操作流程

血液、骨髓

（需氧及厌氧）

涂片、染色、镜检 分离培养 直接药敏试验

需氧培养 真菌培养 厌氧培养 35℃
及CO环境培养 （血琼脂平板 4—6h
（血琼脂平板和 等分离培养基）
巧克力琼脂平板） 初步报告

菌落观察

涂片、革兰染色、镜检 纯培养
血清学检查 确定报告 生化反应试验、药敏试验
最终报告
参考文献
《全国临床检验操作规程》（第3版）
《BACT9050血培养仪使用说书》

湖南省肿瘤医院
检验科
Clin Lab.HNZL

标题：脑脊液标本细菌学检验标准操作规程
文件编号：HNZLYY/LAB-SOP-WSW-602
版本号：2
修改号：0
生效日期：2013-07-01
发行部门：质量管理小组
编制人：陈建国
审核人：肖平
批准人：吴白平
页码：第 11 页 共 61 页

1. 目的
规范脑脊液标本细菌学标准操作规程，确保检验结果准确可靠。
2. 适用范围
脑脊液培养。
3. 标本
3.1 标本类型　脑脊液。
3.2 标本采集
由临床医师以无菌要求做腰椎穿刺，抽取脑脊液2ml～3ml，盛于无菌容器中送检。脑膜炎奈瑟菌离体后能产生自溶酶，迅速自溶，肺炎链球菌及流感嗜血杆菌离体后也易死亡。因此，脑脊液无论涂片或培养，必须于采集后立即送检。
3.3 标本拒收标准
3.3.1 标本标识与化验申请单不符。
3.3.2 标本未用无菌试管留取。
3.4 标本保存
采集标本后立即送到实验室，不能及时送检可置室温，放置时间不应超过2h，切勿放冰箱，否则影响检出率。
4. 试剂、仪器
4.1 革兰染液、氧化酶试剂、3%触酶、血琼脂平板、巧克力平板、中国蓝平板、相关生化试剂等。
4.2药敏纸片、ATB板条/TDR系统鉴定卡及药敏板等，有效期及储存条件参见试剂说明书。
4.3 接种针、接种环、电热灼烧器、显微镜、孵育箱、CO2 培养箱等。
5. 细菌鉴定和药敏质控
参见质量管理。
6. 检验步骤
接收标本后，立即对标本进行编号、登记。
6.1 涂片检查
6.1.1 一般细菌涂片检查　外观混浊或脓样脑脊液可直接涂片，无色、透明的脑脊液，应3000r/min 10min～15min离心后取沉淀物涂片、革兰染色、镜检。根据染色及形态特征，常可初步提示细菌的种类。
6.1.2 新生隐球菌涂片检查　取脑脊液的离心沉淀物作墨汁负染色，或取脑脊液的离心沉淀物接种于沙氏培养基上，置于35℃培养2日～5日，根据菌落特性，涂片染色镜检作出报告。必要时可作生化反应进一步鉴定。
6.2 分离培养
6.2.1 用接种环挑取混浊脑脊液或经离心沉淀的沉淀物，分别接种于血琼脂平板、巧克力琼脂平板和中国蓝平板，置于5%~10%CO2 环境中35℃培养18～24 h，观察细菌生长情况，根据菌落特点、形态与染色及生化反应鉴定细菌，并作药敏试验。
7. 操作流程
脑脊液

离心
观察菌落特征
及涂片、染色

血琼脂平板、巧克力平板、中国蓝平板5% CO2 35℃培养18-24h
发出报告

仪器或手工细菌
鉴定及药敏试验

沉淀物涂片、染色

8. 结果报告
无论是涂片还是培养，一旦检测到阳性细菌应立即电话或书面通知临床医师。查见细菌，报告菌名和药敏结果。经培养48h，仍无细菌生长者，报告“培养2日无细菌生长”。
9. 注意事项
9.1 抽取的脑脊液分置于无菌试管中，迅速送至实验室，病毒、霉菌、分支杆菌培养样本置4 ℃保存待送。
9.2 流感嗜血杆菌容易在外界环境中死亡，脑膜炎奈瑟菌对寒冷和干燥均很敏感，在体外容易自溶，故不论是涂片镜检还是进行培养均应及时送检。
10. 临床意义
正常人的脑脊液是无菌的，检出细菌提示细菌性（急性化脓性或结核性等）脑膜炎。化脓性脑膜炎最多见脑膜炎奈瑟菌，肺炎链球菌居第二位。5岁以下儿童细菌性脑膜炎的主要致病菌是流感嗜血杆菌，结核分枝杆菌引起结核性脑膜炎。85%脑脓肿患者脑脊液培养可检出厌氧菌，有时可为厌氧菌和需氧菌混合感染。
11. 危急值报告
直接涂片找到细菌或培养阳性均作危急值报告。若检测出脑膜炎奈瑟菌则应做传染病报告。
参考文献
1 CNAS-GL23《医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用指南》, 2013
2周庭银编著. 临床微生物学诊断与图解. 第二版. 上海: 上海科学技术出版社, 2007
3 叶应妩, 王毓三, 申子瑜主编.全国临床检验操作规程. 第3版 .南京: 东南大学出版社, 2006
4 Murray PR. Manual of Clinical Microbilogy. 9th ed. Washington: ASM Press, 2007
5 ISO15189:2007《医学实验室-质量和能力认可准则》, 2007

湖南省肿瘤医院
检验科
Clin Lab.HNZL

标题：呼吸系统标本细菌学检验标准操作规程
文件编号：HNZLYY/LAB-SOP-WSW-603
版本号：2
修改号：0
生效日期：2013-07-01
发行部门：质量管理小组
编制人：陈建国
审核人：肖平
批准人：吴白平
页码：第 21 页 共 61 页

1. 目的
规范呼吸道标本细菌学标准操作规程，确保检验结果准确可靠。
2. 适用范围
呼吸道标本培养和涂片检查。
3. 标本
3.1 标本类型　痰、咽拭、支气管肺泡灌洗吸出液、支气管冲洗液或刷子、肺穿刺等。
3.2 标本采集
　 3.2.1 采集时间　以晨痰为好；支气管扩张症患者，清晨起床后进行体位引流，可采集大量痰标本。
　 3.2.2 自然咳痰法　在留取痰之前，用清水反复漱口，应从气管深部咳出痰，吐入无菌容器内。
　 3.2.3 气管镜下采集法　在病灶附近用导管吸或用支气管刷直接取得标本。
　 3.2.4 气管穿刺法　在环甲膜下穿刺抽取痰液，收集标本，适用于厌氧菌培养。
3.2.5 棉拭采集法　用无菌棉拭子轻轻擦拭患者鼻咽部黏膜，留取标本，置无菌试管内送检。
3.3 标本拒收标准
3.3.1 申请单姓名、科别、床号与标本的标签不符。
3.3.2 痰标本呈水样或唾液样。
3.3.2 痰涂片白细胞<10／低倍视野，上皮细胞>25／低倍视野。
3.3.4 标本容器溢漏，无瓶盖。
3.3.5 痰标本留取放置时间太长，超过2h。
3.3.6 未用指定的无菌容器留痰作细菌培养。
3.4 标本保存
采集标本后立即送到实验室，放置时间不应超过2h。
4. 试剂、仪器
4.1 革兰染液、氧化酶试剂、3%触酶、血琼脂平板、巧克力平板、中国蓝平板、相关生化试剂等。
4.2药敏纸片、ATB板条TDR系统鉴定卡及药敏板等，有效期及储存条件参见试剂说明书。
4.3 接种针、接种环、电热灼烧器、显微镜、孵育箱、CO2 培养箱等。
5. 细菌鉴定和药敏质控：参见质量管理。
6. 检验步骤
接收标本后，立即对标本进行编号、登记。
6.1 肉眼观察　包括颜色、黏度、有无血丝或脓。
6.2 涂片检查　可以确定标本是否适合做细菌培养，直接涂片镜检，依据低倍镜下观察白细胞和上皮细胞数目多少来评定，见下表5-30。并可初步判定是否有病原菌存在。
表5-30　痰标本镜下分类
分级
白细胞（个）
上皮细胞（个）
A
>25
<10
B
>25
<25
C
<10
>25
　　　　　　注：A、B两种情况的痰标本适合做培养，C不合格，应重新留标本。
6.2.1 一般细菌涂片　挑取脓性或血性痰液制成薄而均匀的涂片，革兰染色后镜检。
6.2.2 结核分枝杆菌涂片　参见《结核分枝杆菌检验操作规程》。
6.2.3 放线菌及诺卡菌涂片　将痰液用生理盐水洗涤数次，如含血液，则加水溶解红细胞， 然后挑取黄色颗粒或不透明的着色斑点，置载玻片上，覆以盖玻片，轻轻挤压，置高倍镜下观察其结构，如见中央为交织的菌丝，末端呈放线状排列，则揭去盖玻片，干燥后作革兰及萋-尼染色镜检。如查见中间部分的菌丝为革兰阳性，而四周放射的末端为革兰阴性，萋-尼染色为非抗酸性者，可报告为”找到革兰阳性杆菌疑似放线菌”。萋-尼染色弱阳性则报告革兰阳性杆菌疑似诺卡菌。
6.3 分离培养
6.3.1 培养标本的选择　应选择黏液脓痰作涂片，排除不合格标本。
6.3.2 痰标本培养前处理　用无菌盐水将痰洗涤或加入等量的1%胰酶溶液，使痰液均质化后备用。
6.3.3 接种　痰液接种于血琼脂平板、巧克力琼脂平板和中国蓝（或EMB、中国蓝）琼脂平板，置5％～10％CO2 环境中，35℃培养18～24 h。
6.3.4根据菌落及形态特点，作出初步判断，然后按各类细菌特征进行生化鉴定，并同时作药物敏感试验。
7操作流程

发出报告

仪器或手工细菌
鉴定及药敏试验

观察菌落特征
及涂片、染色

消化液或
生理盐水处理

痰或咽拭

肉眼观察
涂片染色

血琼脂平板、巧克力平板、中国蓝平板5%~10% CO2 35℃培养18～24 h

7. 结果报告
8.1 报告的各细菌种可注明各自所占比例情况，可分为纯培养，大量，中等量，少量。
8.2 未检出致病菌时应报告“正常菌群”。
8. 注意事项
9.1 痰标本一般不可采用肉汤或高选择性培养基进行增菌培养。
9.2草绿色链球菌为口腔和鼻咽部的正常菌群，其毒力很低，但由拔牙等原因造成的局部损伤中侵入血流，可引起亚急性细菌性心内膜炎等感染，故从血液中分离出草绿色链球菌有临床意义。
9.3 咳痰标本不做厌氧菌培养。
9. 临床意义
上呼吸道标本培养生长的细菌是否与疾病有关，需各方面综合分析，排除常居菌后，才可作出正确的判断。下呼吸道的痰液应是无细菌的，而经口腔咳出的痰带有多种上呼吸道的正常寄生菌（如草绿色链球菌）。若从患者痰标本中查见致病菌或条件致病菌，提示可能有呼吸道细菌感染。肺炎链球菌是肺炎最常见的致病菌。儿童细菌性肺炎多为流感嗜血杆菌所致。医院获得性肺炎的常见病原菌是革兰阴性杆菌，主要有肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、沙雷菌属和肠杆菌属细菌等。肺结核由结核分枝杆菌引起的。嗜肺军团菌引起军团菌病，肺部厌氧感染大多是脆弱类杆菌及梭杆菌属的细菌等。疑典型形态细菌所致肺部感染时，常先做痰液和支气管分泌物涂片、染色镜检（如肺部结核痰液涂片、抗酸染色，镜检找抗酸染色阳性结核分枝杆菌，有助于细菌培养检查。
10. 危急值报告
如查出抗酸杆菌阳性，则应及时向临床报告并作报传染病报告。
参考文献
1 CNAS-GL23《医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用指南》, 2013
2周庭银编著. 临床微生物学诊断与图解. 第二版. 上海: 上海科学技术出版社, 2007
3 叶应妩, 王毓三, 申子瑜主编.全国临床检验操作规程. 第3版 .南京: 东南大学出版社, 2006
4 Murray PR. Manual of Clinical Microbilogy. 9th ed. Washington: ASM Press, 2007
5 ISO15189:2007《医学实验室-质量和能力认可准则》, 2007

操作规程：
1．眼、耳、鼻和咽拭子样本采集：
1.1采集眼、耳、鼻、咽拭子时易被粘膜上的正常菌群污染，应在采集时注意。
1.2采集眼分泌物时，应先用无菌生理盐水冲洗眼部，然后用棉拭子拭干，再以无菌棉拭子采取分泌物。
1.3若从鼻腔采样本作培养，可用一支无菌棉花拭子（其尖端之棉花必须紧密）直接插入鼻腔，应避免用大而疏松的棉花拭子，因其可能滑落，甚至陷于病人鼻腔中。
1.4若从咽喉采集样本作培养，须在光线充足下，压住舌根采集扁桃体两侧分泌物，以防样本干燥，采集时尽量避免接触舌头和唾液。
2．样本处理：
涂片检查：拭子直接在玻片上涂片，根据临床提示决定涂片的数量。
2.1革兰染色：所观察到的细菌染色性及形态报告结果。咽部或口腔拭子还应注意是否有革兰染色阴性的硫螺旋体和粗大梭形杆菌，确定有否奋森螺旋体和梭形杆菌感染。
2.2疑为白喉感染，除已证实为革兰阳性杆菌处，还须用异染颗粒染色法，镜检异染颗粒。2.3疑有念珠菌感染，可以湿片直接在高倍镜下检查芽生孢子和假菌丝。
2.4麻风分枝杆菌检查：可取鼻粘膜拭子涂片做抗酸染色检查。
3培养步骤：
3.1增菌培养：眼内和内耳拭子可增菌培养。应选用适于需氧和厌氧菌生长的培养基增菌。增菌的拭子应不被正常菌群污染，否则，增菌培养会使致病菌因正常菌群过度生长而抑制，产生错误的假象。
3.2分离培养：
3.2.1一般培养：根据这些部位感染细菌的特点，须用血平板和巧克力平板作分离培养,必要时加选中国蓝琼脂。在CO2环境中培养18—24h，此时长出的肺炎链球菌很大，溶血特征明显，十分容易识别，分离脑膜炎奈瑟菌时，接种血平板和专用巧克力平板，置CO2环境中孵育。其他致病菌经纯培养，ATB全自动鉴定后报告。
3.2.2白喉棒状杆菌培养：血平板，经过夜培养后，当用接种环推移开血平板上菌落后可见菌落下有溶血血环。在亚碲酸盐平板上，白喉棒状杆菌的菌落显黑色。
3.2.3流行性脑膜炎流行季节或流行区，采集凝似患者鼻咽拭子，接种于含抗生素的巧克力琼脂平板上，置CO2环境下孵育，分离培养脑膜炎奈瑟菌。
4．结果报告方式：
4.1对正常无菌的器官如眼内、内耳标本，可报告检出的细菌及敏感试验结果。
4.2鼻、喉拭子检出病原菌时，可直接报告菌名和生长菌数量(纯培养或占优势)及其药敏试验结果。
4.3鼻咽拭子标本在出报告时，必须报告正常菌群量的多少，致病菌量的多少。用1+-4+表示。例如：正常菌群在平板的二段划线均生长，为2+；致病菌在平板的三段划线均生长，为3+。一般认为，致病菌的量必须大于或等于正常菌群的量，临床上才有意义。
5病原菌：
5.1正常眼部是无菌的。
5.2正常的中耳及鼻窦内是无菌的。健康人的咽峡部有口腔的正常菌群。
5.3耳、鼻、咽部的细菌感染病原菌来源于口腔。口腔中既有需氧菌也有厌氧菌，所以，其周围组织器官的感染不仅考虑是需氧菌，也须检查厌氧菌。中耳炎、鼻窦炎及扁桃腺炎的病原菌分布情况见。
5.4百日咳、白喉患者的咽部可以分离到相应的细菌，同时还可以分离出脑膜炎奈瑟菌。

眼、耳、鼻、喉拭子培养常见病原菌
革兰阳性菌 革兰阴性菌
金黄色葡萄球菌 脑膜炎奈瑟菌
肺炎链球菌 淋病奈瑟菌
β溶血性链球菌 嗜血杆菌
白喉棒状杆菌 莫拉菌
念珠菌 卡他布兰汉菌
百日咳杆菌
肠杆菌科
假单胞菌属
产碱杆菌属
6．眼、耳、鼻、喉拭子操作流程：

眼、耳、鼻、喉拭子

涂片 血平板 血平板 肉汤
革兰染色 巧克力 巧克力
中国蓝 35℃过夜

血平板
初步报告结果 CO25％-10％ 中国蓝纯分
35℃过夜 35℃过夜 35℃过夜

纯分 菌种鉴定 药敏试验

报告结果

下呼吸道（痰）培养
1．样本采集：
所采取的痰样本，必须真正能代表肺部之分泌物者，通常清晨时痰液最多，且可能含较多量病原菌，采集步骤如下：
1.1以清水或牙刷清洁口腔及牙齿，不可用牙膏。
1.2指导患者从呼吸道深部咳出痰（不可含有唾液），装于无菌容器。若作结核菌培养时，应将标本置于4℃冰箱中保存待种。
1.3痰涂片检查：其一是为确定标本是否适合做细菌培养。采用的方法是直接涂片镜检，用无菌小竹签挑取痰液的脓性或带血部分，置于载玻片中，制成涂片。依据低倍镜下观察白细胞和上皮细胞数目的多少来判定。

白细胞 上皮细胞
A >25 <10
B >25 <25
C <10 >25
A、B两种情况的痰适合做培养，C不适合，应退回重留标本。其二是初步判定是否有病原菌存在。
2．样本处理与检查：
2.1 一般细菌涂片检查：挑选痰液中脓性或带血部分，涂成均匀簿片，行革兰染色，镜检。根据其细菌形态，排列和染色性，大致可以初步推定菌属（或种）。如镜见排列成葡萄状的革兰阳性球菌，可报告为：“找到革兰阳性球菌，形似葡萄球菌”；如见到瓜子仁形或矛头状的尖端相背、成双排列、具有明显荚膜的革兰阳性球菌时，可报告为：“找到革兰阳性双球菌、形似肺炎链球菌”；如查见短而粗的革兰阴性杆菌，排列多成双且有明显荚膜时，可报告为：“找到革兰阴性杆菌形似肺炎克雷白菌”；如查见不易识别的细菌，则报告为：“找到革兰×性×形细菌”。
2.2 结核分枝杆菌涂片：直接涂片:以接种环取干酪样或脓性部分的痰制成涂片，作抗酸染色。应查遍整个涂片，根据所见结果报告“找到(或未找到)抗酸性杆菌”。
2.3 厌氧菌涂片检查“涂片染色同一般细菌，镜检时注意有芽胞的革兰阳性杆菌 (可能是芽胞梭菌属)。如见芽胞位菌体不膨大，排列呈竹节状，要注意炭疽需氧芽胞菌。两端尖的革兰 阴性杆菌(可能是梭