KIR基因的基础与应用.pdf

综 述 KIR基因的基础与应用李长缨 胡彬 刘晓华 纪玉强 焦淑贤 赵林(青岛市中心血站,山东 青岛266071)关键词:KI R;基因;遗传;NK细胞;疾病相关性 中图分类号:R45711 文献标识码:A文章编号:10042549X(2008)092722203 人类杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immuno2globulin like receptors,KI R)是主要表达于NK细胞和部分T细胞表面的一组免疫球蛋白样超家族成员。近年来随着对其分子生物学基础方面研究的深入,人们对其在移植免疫、抗感染免疫、肿瘤免疫等方面的作用十分关注并进行了大量研究。我们现就其分子生物学基础及某些应用方面的研究进行综述。1KIR结构、种类及命名人KIR为 型跨膜糖蛋白(integvalmembrance protein),由胞外区、跨膜区和胞浆区3部分组成,属于免疫球蛋白样超家族成员(Ig2SF),按胞外区有2个或3个Ig样功能区,分属KI R 2D或3D亚家族。按其胞浆区长短分为L型或S型。1997年,Uhrberg首次采用PCR2SSP方法对KIR进行了基因分型。目前共发现有18个KIR基因,它们是KIR1D、KIR2DL125、KIR2DS125、KIR3DL123、KIR3DS1、假基因XV、X和KIR2DP1。按照目前KIR基因的命名方法,KIR基因中的D代表其胞外结构中的Ig样结构。2D和3D分别表示有2个或3个Ig样胞外结构,L或S表示胞质内尾段的长短,置于命名的末尾,后面的数字则表示各个不同的成员。2KIR的遗传及表达KIR基因为常染色体共显性遗传。人KIR基因定位于19q13142,为白细胞受体复合体(leukocyte receptor complex,LRC)中的一部分1。在长约160kb的范围内,若干个KIR基因呈蔟状分布,基因间距 3kb。每个KIR基因有9个外显子,其中1、2外显子编码前导肽,3、4、5外显子分别编码Ig样结构的D0、D1和D2,外显子6编码茎区,外显子7编码跨膜区,外显子8、9编码胞浆区。KIR在遗传中存在明显的连锁不平衡,表现在不同KIR基因间有明显的连锁不平衡以及同一基因的不同等位基因亦表现出明显的连锁不平衡。不同的KIR基因组合有一定的规律性,从而形成KIR基因特定的单体型。Shilling等2对这些单体型进行了归纳,将它们分为A组和B组。A组较稳定,包括有2DL1,2DL3,2DL4,2DS4,3DL1,3DL2,B组包括有2DL2,2DL4,2DS1,2DS2,2DS3,3DL2,3DS3。Kathaline等3将这些单倍型归纳为23条KIR单倍型图谱,便于比较和分析。3DL3、2DL4和3DL2为KIR的框架基因,存在于任何单体型中,它们依次分布于KIR基因的着丝侧、中间和端粒侧。框架基因间形成可变区,其间的KIR基因数量和种类随单体型的不同而有变化。KIR基因遗传有明显的多态性,表现在KIR的基因数目在不同的NK细胞克隆和不同的个体存有差异;同时,不同的个体可表现不同的单倍型,而同一KIR基因座位又有多种不同的等位基因。因而有人计算,无关个体间KIR基因相同的可能性不超过0124%。研究表明KIR基因的多态性与其mRNA的变位剪切、KIR的多基因性及群体等位基因的多态性相关。人KIR主要表达于NK细胞表面。部分T细胞表面亦有表达,主要为CD8+细胞,少见于CD4+细胞。这些T细胞均缺少CD28抗原,并表达记忆性T细胞的典型标志。除框架基因外,NK细胞表达的KIR呈克隆性。虽然个体的NK细胞群表达了其基因组除伪基因外的所有KIR基因,但个体内不同NK细胞克隆表达的KIR并不相同,每个NK细胞克隆表达KIR基因组的1种或多种。这使得NK细胞的自身免疫监督作用十分有效。当表达MHC2类分子的自身细胞由于衰老、突变或受到细胞内寄生物的作用而使得MHC2 类分子的表达下调时,便可被机体携有不同KI R配体的NK细胞监测到并及时发挥其免疫清除作用,从而保持机体内环境的稳定。KIR基因的表达调控主要存在于转录水平,与转录启动区的CPG甲基化有关,另外HLA抗原对KIR表达也有精细调节作用。3KIR的功能3.1KI R与NK细胞 NK细胞在人体中约占外周血淋巴细胞的10%,它通过细胞因子和细胞毒作用,抵御感染和杀灭恶变细胞,在天然免疫和获得性免疫中发挥重要作用。近年来,人们对NK细胞受体及其功能产生了极大兴趣,进行了大量研究并取得了可喜的成就。目前认为NK细胞的功能由其表面多种受体的综合作用来实现。按照受体的结构可将NK细胞受体分为KIR受体和C型凝集素样受体及自然杀伤细胞毒受体。每一家族成员在胞外决定簇数目、类型、序列、跨膜区电荷、胞内区长度及与与结合蛋白连接情况均有各自特点,功能上具有抑制和活化作用的分工4,一般认为NK细胞可同时表达活化和抑制受体,其杀伤功能取决于表面抑制性受体与活化性受体传递信号的综合。KIR通过识别表达于靶细胞表面的HLA21类分子和部分非典型的MHC分子,来调节NK细胞的杀伤活性,从而在自身免疫性疾病、妊娠、移植排斥等生理病理过程中起重要作用。3.2KIR基因抑制型与活化型 KI R对靶细胞的抑制或激活作用,是通过胞浆内的IG样分子结构来决定的。无类Ig区或仅有1个类Ig区的KIR不能和MHC2类分子结合。227中国输血杂志2008年9月第21卷第9期Chin J Blood Transfusion September,2008,Vol.21,No.9具有长尾段的L型结构的KIR分子(其胞浆内结构可有76、84和95个不同长度的氨基酸残基),如KIR2DL1、KI R2DL2、KIR3DL1等,它们在胞浆内的结构中具有ITI M,传递抑制性信号,而具有短尾段的S型结构的KIR分子(其胞浆内结构为39个氨基酸残基)不具有ITI M样结构,而在跨膜区含有带正电荷的天门冬氨酸残基,可以结合DAP蛋白,传导活化信号5。因而有人主张将KIR中具有激活功能的受体称为KAR。这些KAR和KIR虽然在胞浆区、膜区结构不同,功能迥异,但在膜外区结构几乎完全相同,并且有相同的MHC2I类分子做配体。KIR对NK细胞的抑制作用,需要有NK细胞的激活性受体(FCR I受体复合物或CD25/CD3嵌合分子)共聚集,才能发生。其中酪氨酸磷酸酯酶(PTPase)起重要作用。如SHP21和SHP22,它们属于胞浆内PTPase家族。在NK细胞表面,当KI R与配体结合后,一种蛋白质酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTK)被激活,引起ITI M分子中酪氨酸的磷酸化,磷酸化的ITI M引起SHP21和SHP22的募集和激活,最终导致ITAM中的结合器/效应器的去磷酸化,使激活信号终止。KIR在NK细胞上的表达具有高度多态性并呈克隆性分布,其功能亦分为抑制性和活化性,一般认为当NK细胞同时表达抑制性KIR和活化性KIR时,抑制性KIR的作用占优势。有研究表明,KI R的激活并不导致NK细胞功能的广泛抑制,而是抑制某些特异的激活性受体的效应6。因此,抑制是特异性的。因而,根据NK细胞的激活或抑制通路的不同环节来筛选或设计NK细胞的抑制剂或激活剂可望是一条新的思路。3.3KIR与配体 KIR的配体为表达于靶细胞上的某些MHC2 类分子或某些非经典的MHC类分子,两者形成配体/受体复合物。表达特定抑制型KIR的NK细胞不能溶解某一特定HLA单倍体的靶细胞,而不表达该KIR的NK细胞则能发挥溶解作用,说明抑制型KIR配体具有特异性。现有的研究已明确不同的KI R分子识别并结合不同的HLA分子。KI R2D分子胞外的第1及第2 Ig样结构域分别识别HLA配体分子的1和2结构域,对其 结构域7780位含有不同氨基酸残基的HLA2C的同种异体分子进行识别。其中KIR2D的44位与HLA2C分子的第80位氨基酸残基决定了结合的特异性。由此将KI R与CW的识别分为1组和2组,由2DS2/2DS3识别的HLA2Cw1、Cw3、Cw7、Cw8称为1组,其共同特点为第80位氨基酸残基为门冬氨酸,由2DL1/2DS1识别的HLA2Cw2、Cw4、Cw5、Cw6和Cw15称2组,其共同特点是第80位氨基酸残基为赖氨酸。KI R2DL4是HLA2G分子的特异性受体,与其它KI R分子不同,KI R2DL4分子具有独特的胞内结构,即只含有1个ITI M结构,但在跨膜区含有1个带电荷的精氨酸残基,使其同时具有抑制性和激活性受体的结构特点,其对NK细胞的功能调节也显得特别而精细,取决于NK细胞所处的阶段。对于未活化、静息的NK细胞,KIR2DL4发挥激活性受体的作用,诱导NK细胞产生大量的IFN2;而对于已激活NK细胞,KI R2DL4则发挥抑制性受 体 的 功 能,抑 制NK细 胞 对 靶 细 胞 的 杀 伤7。KIR3DL1,能识别HLA2B1结构域上Bw4血清型表位及HLA2A3。位于HLA2Bw41结构域的7983位残基形成KIR3DL1结合的表位。对于其它的KIR配体,目前尚不明确。KI R与HLA配体识别及特异性的研究,目前已发展多种检测方法,其中克隆表达含有配体结合区KIR胞外段的融合蛋白为常用方法。另外KIR及其配体复合物晶体空间构象分析的研究,目前研究也有很大进展。该领域的研究,从分子水平提供了KIR与其特异性配体识别及结合的具体机制。4KIR的应用研究4.1KIR多态性及其相关研究 目前,有关KIR频率及其多态性方面的研究多集中于不同人种KIR基因及其单体型的分布和分析。W illians等8实验室首先报道了北爱尔兰人群KIR2DL4、KIR2DS4、KIR2DL3、KIR3DL1/S1和KIR3DL2等位基因的分布情况,Shilling等2的研究认为白种人的A、B型约各占50%。Frassati等9对法国Mareilles地区的Comor2ian人群和法国东南部地区人群的KIR基因频率、单倍体频率及连锁不平衡情况进行了研究,并将结果与世界多个地区不同人种资料进行了比较,认为不同人群KIR基因频率及单倍体的比较研究对民族演绎、种族溯源具有重要意义。目前国内亦开始有人进行同类研究,但资料甚少且有一定的地区局限性或限于家系调查。张磊等10用PCR2SSP的方法研究了14个家系的KIR基因情况,其中13个家系的单倍体符合Kathaline等的23个单倍体图谱,1个家系中存在1条无法用Kathaline等的23个单倍体图谱进行分型的KIR单倍体,怀疑可能为1条新的单倍体。尹晓林等11报道了广东汉族人群KIR基因的表达频率,并将其与白种人、日本人及北印度人进行了比较,发现除框架基因和伪基因及3DL1无显著差异外,其余KIR基因表现频率均存在不同差异,该作者的另一项研究发现广东汉族人群中抑制性HLA2WC2KI R配对表达高于刺激性HLA2WC2KIR配对,并且存在KIR表型与HLA表型分离的情况,约1/5个体单独表达刺激性HLA2WC2KIR配对。4.2KI R与异基因造血干细胞移植 异基因造血干细胞移植(allo2HSCT)是治疗多种恶性病及一些非恶性病的有效方法,近年来,随着人们对KIR及NK细胞功能的了解,其在allo2HSCT中的作用倍受人们关注。目前,根据供受者的HLA21类分子配型,可将供受对分为3种情况:1)受者不表达供者的KIR表型的配体,即GVHD方向的KI R配体不匹配;2)供者不表达受者的KI R表型配体;3)供、受者表达相同的KIR表型配体。一般将第1种情况称为KIR配体不匹配,后2种情况称为KIR配体匹配。目前已有许多动物实验和临床观察均提示,异基因基因干细胞移植后,供者NK细胞的异源反应活性可以阻止T细胞介导的GVHD,可以促进植入并攻击宿主白血病细胞,发挥GVL效应,现认为其作用机制是由于受体不表达供体的KI R特异性配体,因而供体的NK细胞解除抑制,可有效地杀灭受者体内的抗原递呈细胞,使受者的抗原不能被递呈给移植物中的T细胞,从而阻止了GVHD的启动,而同时引发的供者NK细胞的异源反应活性,可通过识别受者残留淋巴细胞和造血细胞而发挥强有力的促植入作用12。Peters等13的临床研究发现,5名高危急性白血病患者经单倍体相合异基因造血干细胞移植后,327中国输血杂志2008年9月第21卷第9期Chin J Blood Transfusion September,2008,Vol.21,No.9输入纯化的供者NK细胞,可以增加稳定嵌合体的形成。进一步说明了供者NK细胞有助于移植物的植入。另外当异源性NK细胞遇到KIR不相容的白血病细胞时,便会产生强大的细胞毒作用,从而发挥其GVL作用。上述现象最早发现于单倍体不相和的移植中,以后的研究发现,这种现象其它种类的异基因干细胞移植中也可见。但近期也有研究资料提示,KI R配体不和的allo2HSCT,总存活率没有改变或有下降,认为这可能主要由于异源反应性NK细胞的存在,潜在的阻碍了机体对移植后早期感染的有效免疫14。最近国内马红军等15研究结果KIR2HLA遗传背景与HBCT术后真菌感染相关BW4相关患者真菌感染的发生率明显低于BW4非相关者。分析原因,考虑可能供者NK细胞的同种异体反应可影响移植早期的抗感染免疫力,导致移植相关死亡率升高OS率降低。Schaffer等16分析165名无关供者HSCT预后亦发现,KI R2HLA不相容患者真菌感染率上升。因而目前看来,NK细胞在allo2HSCT中的作用尚需进一步研究,同时KIR配体不相和在移植中的意义也有待进一步研究和评价。4.3KIR与疾病相关性研究 王沂芹等17研究表明,慢乙肝患者的KIR在特异性CD8+T细胞上的表达明显较健康对照组上升,以此解释慢乙肝患者特异性CTL功能下降并导致病毒清除受到抑制。Salim等18研究KIR2DL3及其配体HLA2C1对HCV的清除作用有关,其统计数据显示抑制性NK细胞的作用影响到抗病毒免疫,降低抑制性NK细胞反应性,有助于抗HCV感染。有研究报道银屑病患者的KIR2DS2频率显著高于正常人。类风湿关节炎患者活化性KIR频率与正常人相似,但并发血管炎患者的KIR2DS2频率显著高于正常人。Cohen等19发现:某些病毒如HI V、HSV和HCNV可以选择性下调感染细胞上某些MHC2 类分子,从而逃避CD8+T淋巴细胞和NK细胞的杀伤,这种“双重逃避”就是通过KI R家族的活化和抑制性受体作用而实现的。5 结语KI R是NK细胞受体中极为重要的一类受体。认识其结构、遗传特点、调节机制及配体识别特异性,可以从分子水平上了解NK细胞的生物学功能的作用机制并为重新认识NK细胞和T细胞的某些功能及其调节机制开辟新的天地。应用受体特异性的配体,调节NK细胞的活性、利用NK细胞激活或抑制通路的不同环节,筛选和设计NK细胞的激活剂或拮抗剂、转移KIR分子基因,建立个体特异性免疫耐受,这些新的思路,可能为疾病的免疫防治提供新的途径。进一步研究KIR在肿瘤、妊娠、移植、自身免疫性疾病及病毒感染等方面的作用,可能为NK细胞在临床上的应用奠定理论基础并提供新的策略和方式。参考文献1Martin AM,Freitas EM,W itt CS,et al.J I mmungenetics,2000,51(45):2682802Shilling HG,Guethlein LA,Cheng NW,et al.Allelic polymor2phism synergizes with variable gene content to individualize hu2man KI R genotypeJ.J I mmunol,2002,169(9):511851293 Hsu KC,Liu XR,Selvakumar 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