1、?基础研究?芸豆植物凝集素对小鼠体外受精的影响张丽芬?王昌梅?杨明洁?张?田?王敏康*云南师范大学生命科学学院(昆明,650092)摘?要?目的:观察芸豆植物凝集素(PHA)对小鼠体外受精的影响及途径。方法:在含不同浓度芸豆 P HA 的 HTF培养液中进行体外受精或用该培养液预处理小鼠卵母细胞再授精,观察其对小鼠体外受精的影响。结果:在含 500、1000和 5000?g/ml P HA培养液中,精子被完全凝集,受精率为 0;用含 500、1000和 5000?g/m lPHA 预处理卵母细胞后,加入获能精子,受精率为 0;在含 50和 200?g/m lP HA预处理实验中,受精率为 11
2、.2%和 5.9%。而在未经 PHA处理空白对照实验中的卵母细胞体外受精率为 81.3%,卵母细胞受精发育成囊胚的比率为 48.4%,并且对照实验中产生的部分胚囊经胚胎移植产出正常的仔鼠。结论:芸豆 PHA 既可作用于精子,也可作用于卵子,最终可有效抑制小鼠受精。关键词?芸豆 PHA?体外受精?抑制受精?小鼠do:i 10.3969/.j issn.1004-8189.2011.2Effect of phytohe m agglutinin on in vitro fertilization in m iceZhang L ifen,W ang Changme,i YangM ingjie,Z
3、hang T ian,W ang M inkang*M inistry of Education,School of LifeSciences,YunnanNormal University,Kunming 650092Abstract?Objective:To explore the influence ofphytohe magglutinin(PHA)extracted fromPhaseolus vulgaris(white kidneybean)on in vitro fertilization inm ice.M ethods:Oocytes isolated from m ice
4、 were treatedw ith different concentrations ofPHA.The fertilization rates in vitro were evaluated.Results:In PHA-containedmedia at concentration fro m 500 to 5000?g/m,lall sper mswere aggregated and their fertilization rateswere 0;in 50?g/m land 200?g/mlPHA containing media,fertilizationrateswere 11
5、.2%and 5.9%,respectively.By contrast,the fertilization rate of the control was 81.3%.Among them,48?4%of fertilized oocytes developed into blastocysts and so me offsprings were produced after embryo transfer.Conclusion:PHA fro m Phaseolus vulgaris is effective for the inhibition of in vitro fertiliza
6、tion inm ice.K ey words?Phytohe magglutinin;in vitro fertilization;Inhibition of fertilization;Mouse?已有的研究表明,凝集素不仅具有凝集血细胞、淋巴细胞、精子细胞等作用,而且参与了生物体内的一些重要生理和药理过程 1。1973年,Oikawa等 2报道了麦胚凝集素(WGA)可以阻止哺乳动物的受精。1974年 Oikawa等 3又报道了植物凝集素可抑制仓鼠的受精。Macedo等 4也发现凝集素可抑制海兔的受精。涂喜庆等 5,6观察到了植物凝集素对动物及人精子凝集的作用。本实验室曾观察从云南白芸豆中
7、提取的芸豆植物凝集素(PHA)对不同种类哺乳动物精子的作用和阴道给药对小鼠避孕基金项目:国家自然科学基金项目(30560056;30860128);云南省中青年学术技术带头人后备人才培养计划(2005PY01);云南省教育厅科研基金资助(06Y1168;07Z11378)收稿日期:2010-10-12?修回日期:2010-12-31*通讯作者:wangmk1998 效果。结果表明,低浓度 PHA(100 800?g/m l)作用下 30m in可使人、小鼠、牛、羊和兔的精子完全发生凝集;而 1 250?g/m l PHA可使精子完全制动并发生致死 7。为研究 PHA 的抑制受精过程和相关机理,
8、我们采用含不同浓度梯度芸豆 PHA的受精液来进行体外受精,在含有 PHA的培养液预处理卵母细胞后再进行体外受精,分别观察记录受精及胚胎发育情况,以了解 PHA对小鼠体外受精的影响,为有关机理和应用研究积累资料。1?材料与方法1.1?实验材料1.1.1?实验动物?健康的昆明系雌、雄小白鼠 许可证号:SCXK(川)2004-16,平均体重 255g,购自81中国计划生育学杂志2011年 2月 第 19卷 第 2期?Chin J Fam P lann,Vo.l 19,No.2,February 2011四川省医学科学院实验动物研究所,饲养观察 1周后用于实验。实验动物的饲养条件为人工控温 22 26
9、,光周期 14L:10D,湿度为 60%80%,自由取食、饮水。饲料为苏州实验动物饲料科技有限公司生产小鼠全价颗粒料 批准文号:苏 E 饲字(2002)006。1.1.2?实验试剂及仪器?芸豆植物凝集素为本实验室从云南省丽江市出产的大白芸豆中提取,蛋白质含量采用凯氏定氮和双缩脲法测定。凝集活性测定按 Sigma公司标准采用兔醛化红细胞检测,效价为 128,即凝集活性约为 8?g/m;l 孕马血清促性腺素(PMSG),杭州动物药品厂生产;人绒毛膜促性腺素(hCG),丽珠集团丽珠制药厂生产。旋转蒸发仪(RE-52A),上海亚荣生化仪器厂生产;35mm 培养皿,美 国 Corning 公 司 生 产
10、;二 氧 化 碳 培 养 箱(HF90),H ealForce生产;倒置显微镜(TS100),N i?kon生产。1.2?实验方法1.2.1?培养液的配置?培养液的配制参照文献 8。人输卵管液(HTF)的 p H 值调至 7?4 9,其他培养液的 p H 值均调至 7.0。1.2.2?芸豆 PHA的处理?芸豆 PHA 提取液经旋转蒸发仪浓缩为 100mg/m,l 用 HTF 培养液配制为10mg/m l PHA 的培 养液,经 4 000rpm/m in 离心10m in,取上清液经 0.22?m 滤膜过滤除菌后置 4 冰箱保存备用。做培养微滴时,用 HTF 配制为含PHA 50?g/m l、
11、200?g/m l、500?g/m l、1 000?g/m l及5 000?g/m l的 HTF培养液。1.2.3?精子获能?用 HTF 在培养皿中做 4个200?l的大滴,上覆盖无菌石蜡油,放入 CO2恒温培养箱中平衡 1 2h备用。取 6 10周龄雄鼠(3d未交配)断颈处死,分离取出附睾尾部,剪碎后放入平衡好的 HTF中孵育 15 m in,使精子游出。然后将组织碎片取出,再将精子悬液置于 37,5%CO2,饱和湿度的 CO2培养箱中使精子获能(30 60m in),期间可取卵。1.2.4?卵母细胞的收集?取 6 10周龄雌鼠经皮下注射 7.5 10U的 PMSG,48h后腹腔注射同样剂量
12、的人绒毛膜促性腺激素(hCG),注射 hCG后 14 16h断颈处死小鼠,分离取输卵管置于 M2培养液中,在解剖镜下用尖镊子将输卵管膨大部位撕开,将其内部卵团置入透明质酸酶中处理约 5m in,然后用胚胎吸管将已除颗粒细胞的卵母细胞移至干净的M2中洗 1 3次,再移入预先平衡好的 HTF中洗 1 3次,并保存于 HTF中备用。1.2.5?体外受精?预先分别用 HTF、含不同浓度PHA的 HTF培养液以及 M16+ET培养液在培养皿中做成培养滴(20?l/滴),上覆盖无菌石蜡油,放入5%CO2恒温培养箱中平衡 1 2h备用。1.2.5.1?PHA培养液做受精液(实验 1)?将备用的卵母细胞分为
13、6组,1组置于正常的 HTF中做为对照组,另外 5组分别置于含 PHA 50?g/m l、200?g/m l、500?g/m l、1 000?g/m l、5 000?g/m l的 HTF培养液中,做为实验组。然后加入已获能的精子悬液10?l。立即将其置于 37 CO2培养箱中进行受精培养。5h后将卵分别移至 M16+ET 培养液中(用平衡好的 M 16+ET洗几次,尽量减少带入培养液的精子)。记录受精卵(有原核)及未受精卵母细胞的数量。然后再置于 CO2培养箱中连续培养 96 120h。每隔 24h取出观察一次,记录每组细胞的发育情况。1.2.5.2?PHA培养卵母细胞后体外受精(实验 2)?
14、将卵母细胞分为 6组,组 1置于正常的 HTF中做为对照组,另外 5组分别置于含芸豆 PHA 50?g/m l、200?g/m l、500?g/m l、1 000?g/m l、5 000?g/m l 的HTF培养液中预处理 30m in后移至正常的 HTF中做为实验组(用平衡好的 HTF 洗几次,避免带入PHA),然后加入获能的精子悬液 10?l。后面的操作方法同实验 1。实验 1和 2各重复 7次。1.2.6?胚胎移植?随机取出 2个实验未经 PHA处理的对照组中得到的 8个囊胚进行胚胎移植作为体外授精组。另外,取交配第 2天的雌鼠子宫内 2-细胞期胚胎经体外培养得到的 13个囊胚进行胚胎移
15、植为对照组。参照文献 10方法进行胚胎移植。在移植后 19d开腹检查胎鼠情况。1.3?统计学分析方法实验结果采用统计学软件 SPSS进行卡方检验分析。2?结果2.1?实验 1结果2.1.1?肉眼观察情况?由图 1可见,对照组的精子均匀分布于整个微滴中,而含有芸豆 PHA的实验组中,精子的分布不均匀,尤其是 500、1 000和 5 000?g/m l PHA组,精子凝集成块,说明 HTF培养液中82中国计划生育学杂志2011年 2月 第 19卷 第 2期?Chin J Fam Plann,Vo.l 19,No.2,Febr uary 2011的 PHA将精子凝集起来,精子制动,无法穿过卵母细胞
16、透明带以及细胞膜。第 1,2排为加入精子的液滴,第 3排为未加精子的培养液。其中 A,B滴为对照组,C,D,E,F,G滴分别为:50、200、500、1000、5000?g/mlPHA组图 1?体外受精的微滴2.1.2?镜下观察情况?由图 2可见,实验组中,卵母细胞外周没有游动的精子,而对照组中卵母细胞被许多精子包围。体外受精的过程中,在显微镜下可观察到实验组多数精子被凝集,极少有游动的精子;对照组中卵母细胞被精子推动做不定向运动。2.1.3?细胞发育情况?由表 1可见,含 500、1 000和 5 000?g/m l PHA培养液组受精率均为 0,含 50和 200?g/m l PHA 培养
17、液组受精率为 10.6%和5?5%,而对照组的受精率达到 80.4%。经卡方分析知,每个实验组与对照组的受精率之间都存在统计学差异。图 2?体外受精后的卵母细胞(A为实验组;B为对照组)表 1?不同浓度的 PHA对小鼠体外受精的影响 个(%)HTF培养液含 PHA 的量(?g/m l)卵母细胞数受精卵2-细胞期胚胎数桑葚胚囊胚0(对照组)9778(80.4)73(75.3)53(54.6)47(48.4)5010411(10.6)*9(8.7)*2(1.9)*0(0)*2001096(5.5)*5(4.6)*0(0)*0(0)*5001020(0)*0(0)*0(0)*0(0)*1 00099
18、0(0)*0(0)*0(0)*0(0)*5 0001050(0)*0(0)*0(0)*0(0)*与对照组比较 P 0.012.2?实验 2结果由表 2可见,含 500、1 000和 5 000?g/m l PHA预处理卵母细胞培养液组受精率均为 0;含 50和200?g/m lPHA培养液组受精率为 11.2%和 5.9%,而对照组的受精率 81.3%。经卡方分析知,每个实验组与对照组的受精率之间都存在统计学差异。芸豆 PHA预处理卵母细胞后抑制了小鼠受精。表 2?不同浓度的 PHA预处理卵母细胞对小鼠体外受精的影响 个(%)HTF培养液含 PHA 的量(?g/m l)卵母细胞数受精卵2-细胞
19、期胚胎数桑葚胚囊胚0(对照组)9174(81.3)69(74.7)11(12.1)5(5.5)508910(11.2)*9(10.1)*0(0)*0(0)*2001026(5.9)*4(3.9)*0(0)*0(0)*500900(0)*0(0)*0(0)*0(0)*1 000990(0)*0(0)*0(0)*0(0)*5 000970(0)*0(0)*0(0)*0(0)*与对照组比较 P 0.0183中国计划生育学杂志2011年 2月 第 19卷 第 2期?Chin J Fam P lann,Vo.l 19,No.2,February 20112.3?胚胎移植的结果经胚胎移植后小鼠,两侧子宫均
20、有正常的仔鼠产出。体外授精组移植 8个囊胚,产出 3个正常仔鼠,对照组移植 13个囊胚,产出 4个正常仔鼠。3?讨论实验结果显示,无论是用含 PHA的 HTF培养液预处理卵母细胞,还是直接用含 PHA的 HTF培养液作为受精液,不同浓度的 PHA(50 5 000?g/m l)均能抑制小鼠的受精,其中,含 500、1 000和5 000?g/m l的 PHA可完全抑制小鼠受精;含 50和200?g/m l的 PHA也能有效抑制小鼠受精。均未能发育成囊胚。精子的运动能力是保证精子在受精过程中与卵子相遇并完成对卵膜的机械穿透作用 2。在实验 1中,观察含芸豆 PHA 的实验组中,加入微滴中的精子很
21、快被凝集,低浓度组中只有很少的精子游动,高浓度组中的精子完全失去活力。而对照组的精子活力很高,并且能推动卵母细胞。可能是 PHA凝集精子,使精子制动而失去了运动能力。在实验 2中预处理卵母细胞后,在不含 PHA 的 HTF中洗 3次后才移至受精液中受精,所以 PHA由转移卵母细胞时带入受精液中的 PHA量可以忽略。但与对照组相比受精卵及囊胚数目仍较少,Nicolson等 11证明在仓鼠、大鼠和小鼠的透明带和卵母细胞膜上都有蓖麻凝集素、麦胚凝集素和伴刀豆凝集素受体的分布,它们在精卵识别和精子膜和卵母细胞质膜融合中发挥作用。精子不能有效结合 PHA处理过的卵母细胞,可能是在预处理的过程中,PHA
22、和透明带上的相关受体结合而阻止受精;也可能有的 PHA进入到卵周隙或与卵母细胞膜表面的受体结合。另外还观察到,在经 PHA预处理后,出现卵母细胞被凝集现象。在预实验中,曾直接将带颗粒细胞的卵团放入受精液中受精,但发现含 PHA的实验组中由于精子基本没有活力,无法将颗粒细胞移开而接触到卵母细胞。从对照组来看,有无颗粒细胞对受精率无明显影响。所以,在实验中我们均采用脱颗粒细胞的卵母细胞来进行体外受精,以便观察 PHA对透明带的作用。本实验室用异硫氰酸酯(FI TC)标记的 PHA进行实验研究也初步证明了芸豆 PHA 受体广泛分布于小鼠卵母细胞的透明带和细胞膜中。外用杀精子剂壬本醇醚(N-9)因兼具
23、杀精子和微生物处理作用而一度成为热点,该类杀微生物剂主要通过裂解细胞膜而杀死或抑制病原体活性。然而近年临床研究表明经常使用 N-9会损伤宫颈及阴道粘膜细胞,增加生殖器官溃疡的产生,使女性更易感染病毒 12,13。目前,在包括艾滋病在内的性传播疾病(STDs)感染率增加的情况下,研发兼具避孕和预防 STDs的避孕方法具有重要的意义。如果以 N-9为代表的杀微生物剂为第一代非特异性杀微生物剂的话,第二代杀微生物剂是更加特化的杀微生物剂,它们为阴离子物质,作用于病毒的吸收和融合过程;第三代杀微生物剂则高度特化,它们能够抑制 H I V 复制或与特异性 H I V 受体结合,其中就包含凝集素。理论上说
24、,阻断病毒进入靶细胞是预防 H I V 感染最有效的手段。因此,能阻止H IV进入靶细胞的抑制剂作为杀微生物剂具有显著的优势 13,14。已有的研究指出植物凝集素制剂对人阴道黏膜无刺激作用 15。另外,本实验室以往的实验研究发现,芸豆 PHA对不同种类哺乳动物包括人的精子表现为低浓度的凝集作用和高浓度的制动/致死作用 7。本研究证明了芸豆 PHA对小鼠卵母细胞的作用不依赖颗粒细胞的存在,预处理卵母细胞和实时处理卵母细胞均可有效抑制受精。因此,植物凝集素作为一种对精子和卵子都可发挥作用的物质,值得进行更加深入和多方面的研究。本实验室进行的相关研究表明,芸豆 PHA不会导致精子畸形,也不增加骨髓微
25、核发生率,初步显示了其安全性 16 18。可以推断,芸豆 PHA 可作为一种新的抑制受精的物质,在基础研究和临床上有着广阔的应用前景。参考文献1?赵寅生.凝集素生物学功能及应用 J.安徽农业大学学报,2001,28(4):445-447.2?O ikawa T,Yanag i machi R,N icolson GL.W heat ger m agg lutininblocksmammalian fertilization J.Nature,1973,241(5387):256-259.3?O ikawa T,N icolson GL,Yanagi machiR.Inhibition of h
26、amster ferti?lization by phytoagglutinins J.Exp Cell Res,1974,83(2):239-246.4?M acedo NM,Costa-Lotufo LV,Pessoa C,et a.l Inhibition of sea ur?chin fertilization by plant lectins J.Protein Pept L ett,2007,14(9):886-883.5?涂喜庆,薛晓平,陈美慈,等.精子凝集作用的初步研究 J.广东医学,1987,9(5):35-38.6?涂喜庆,林婵珠,叶美丽,等.房事后检测植物凝集素避孕酸粒对
27、精子的作用 J.广东医学,1988,4(21):38-39.84中国计划生育学杂志2011年 2月 第 19卷 第 2期?Chin J Fam Plann,Vo.l 19,No.2,Febr uary 20117?王昌梅,张丽芬,杨明洁,等.白芸豆植物凝集素对不同物种精子的凝集作用与抗孕效果研究 J.中国计划生育学杂志,2010,18(5):272-276.8?王敏康,张田,王晓燕,等.几种克服昆明小鼠 2-细胞胚胎发育阻滞的培养液研究 J.动物学报,2000,46(1):81-87.9?史晓萍,董婉维,周生来,等.FVB小鼠精子冷冻及体外受精的研究 J.中国医科大学学报,2006,35(3)
28、:253-255.10?王敏康,刘冀珑,李劲松,等.小鼠的胚胎移植方法 J.动物学杂志,2000,35(6):32-34.11?N icolson GL,Yanagi machiR,Yanagi machiH.U ltrastr uc-tural lo?calization of lectin-binding sites on the zonae pellucidae and plas?ma membranes ofmamma lian eggs J.J Cell B io,l 1975,66(2):263-274.12?王睿睿,葛争鸣,马丽,等.具有避孕作用的杀微生物剂 J.中国新药杂志,2
29、005,14(3):274-277.13?王敏康,王昌梅,张丽芬.植物凝集素在避孕与预防性传播疾病中的应用前景 J.生殖与避孕,2009,29(10):670-675.14?Balzarini J,Van Damme L.Intravaginal and intrarecta lm icrobicidesto preventHI V infection J.C MA J,2005,172(4):461-464.15?涂 喜庆.植 物 血凝 素 外用 避 孕药 片 的 制取 方 法:中国,88106169.7 P.1989-09-06.16?王昌梅,张丽芬,杨明洁,等.大白芸豆植物凝集素毒性研究
30、 J.安徽农业科学,2009,37(28);13639-13640.17?王昌梅,张丽芬,杨明洁,等.芸豆植物凝集素对小鼠骨髓细胞微核发生率的影响 J.毒理学杂志,2010,24(3):211-214.18?王昌梅,张丽芬,杨明洁,等.芸豆植物凝集素对昆明白小鼠精子畸形的影响 J.生殖医学杂志,2010,19(3):88-91.责任编辑:王丽娜(上接 76页)!以监测为主,缺乏更主动地落实干预措施;缺乏全程管理和服务的理念,在目前我国的经济文化背景下,能主动到医院进行优生咨询、检测的基本上局限于有经济条件、有一定文化知识水平的人群,而对于大部分育龄人群而言,非常必要更积极、主动、全面、深入地进
31、行出生缺陷知识宣教(一级干预);在二级、三级干预过程中,主动、全程地进行管理和服务引导,从而最大限度地实现出生缺陷干预的群体性预防目标。为了克服上述旧模式的缺点,通过建立和应用 M ISBDI,利用人口计生部门工作网络及信息网络的优势,逐渐将出生缺陷干预工作从基于医院为基础的监测干预模式向基于人群的监测干预模式发展,在此过程中,M ISBDI为落实全程管理和服务的干预模式提供了高效、快捷、及时、准确的手段,彻底弥补了单纯依赖人工的不足,有效克服了服务对象分散、项目涉及病种复杂、数据繁多等困难,减轻了基层工作的难度,加强了各级监督管理的功能,确保对每一例对象干预指导工作的全程服务。通过 M IS
32、BDI的信息反馈,辅助辖区出生缺陷干预工作人员全程跟踪管理及服务指引,可以明显提高全市出生缺陷干预方案的实施效率和干预质量。3.2?MISBDI的优势和发展通过 M ISBDI可以达到所属辖区接近全部育龄人群出生缺陷干预信息数据的录入、查询,其中以家庭为基本干预单位,以个人身份为遗传信息的携带单位,在家庭发生变迁、再婚等情况下,遗传家族史、基因携带情况等均能进行追溯,包括当子代进入育龄期后进行出生缺陷干预时,仍然可以提供相关遗传信息参考,从而形成较为完善的广州市群体出生缺陷干预监测信息数据库。在此基础上,系统还可以针对属性数据(缺陷儿预后、家系情况)进行全面的描述性分析和统计分析,结合社会统计
33、学软件(如SAS、SPSS)、家系软件、地理绘图软件等的功能,自动完成统计报表、图表、家系图、疾病地理分布图等的制作,为预测和分析区域出生缺陷疾病发生、发展及趋势提供良好的指引和依据。随着计算机技术以及社会经济和文化的发展,人们获得知识的途径和方法也越来越多。人们对生命的来源、遗传奥秘、家族遗传的规律等的求知欲也越来越强,以目前 M ISBDI的研究为基础,从现有的人口管理政策的角度出发,建立我国人口家族式纵横管理的遗传信息库,到发展为可以向公众开放终端,甚至进行自主参与的现代化家族遗传体系互动平台(电子家谱和电子 DNA),逐渐构建以互动式家族遗传信息服务为特点的遗传学家系网络数据库,并通过
34、干预服务数据的累积,逐步形成我市出生人口缺陷防控监测数据库,这些研究将为进一步对危及我市出生人口素质的疾病进行有效防控提供科学依据。参考文献1?国务院办公厅.国务院办公厅转发卫生部关于做好提高出生人口素质工作意见的通知 EB/OL.(1999-2-3)2010-07-09.http:/ m l2?吴伟雄,冯善伟,江帆,等.广州市出生缺陷干预工程工作方案 S.广州:广州市人口和计划生育科学研究所,2006.3?毛萌,朱军.出生缺陷监测研究现状 J.实用儿科临床杂志,2009,24(11):801-803.4?陈世新.1795例婚检妇女未婚先孕未婚先育结果分析 J.中国妇幼保健,2010,23:3240-3241.责任编辑:裴开颜 85中国计划生育学杂志2011年 2月 第 19卷 第 2期?Chin J Fam P lann,Vo.l 19,No.2,February 2011