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光合细菌分离筛选与培养
着色菌属或称红硫菌属的分离与纯化培养,着色细菌与绿菌属一样也是光合细菌,但它们除了含有叶绿素外,还含有胡罗卜素,而且后者占优势。其细胞除球形外.有柱状,偶有弯曲有荚膜及极生鞭毛,能运动,细胞团块呈深浅不一的红色或紫红色。在有硫化氢条件下生长时,能氧化硫化氢与硫,累积硫于细胞内,而绿色硫细菌却沉硫于细胞外。分布在有腐烂藻类植物的海泥和淡水泥中。
1 分离培养基成分及其配制,由于此种完全培养基的有些成分不能在高压灭菌.或在高温下不相容必须先制备好基础培养基,然后把其他成分的无菌溶液加到冷基础培养基中。(1)基础培养基:NH4Cl 0.1 克 KH2PO4 0.1 克 MgCl2 0.05克 NaCl海生种30 克 淡水种10克 琼脂 20克 水 925毫升,溶解以上无机盐于水中,加入琼脂,加热至121℃ 15分钟,使琼脂溶解,分装于试管或螺旋口瓶里.121 ℃ 蒸汽下灭菌15分钟。不加琼脂可作为液体培养基。(2)无菌碳酸氛钠溶液:将NaHCO3 5克加水至100 毫升,在121℃ 蒸汽下灭菌15 分钟。(3)无菌硫化钠溶液:此液既作为HS-的来源,又起脱氧剂作用,若是预先配制,必须把它保存在没有氧的密闭容器里,否则应在临用前配制。取Na2S·9H2O 5克加水至100 毫升,在121 ℃ 蒸汽下灭菌15分钟.(4)完全培养基:基础培养基(融化冷至45 ℃ ) 10毫升 NaHCO3溶液 0.4毫升 Na2S9H2O 0.2毫升,依次无菌地如到基础培养基中,混匀后可用。
2.分离与纯化培养(1)分离培养:在广口玻璃瓶底放一层0.5-1厘米厚的混有腐烂海藻的海泥,用海水覆盖,暴露于光下。直至培养器最靠近光源的壁上长出红色菌为止。这些红色生长物通常含有着色菌.它的生长决定于泥中硫酸盐的还原,和随后释放的H2S。(2)纯化培养① 深层试管法:a 、选取具有着色菌特征的红色生长物(已用显微镜检查过细胞形态),放于一定量的完全培养液中,混匀。b .准备一系列深层融化的完全培养基管,并保存在45 ℃ 水溶中,将混匀于培养液中的生长物稀释成一系列稀释度。c .每支试管用经160 ℃ 灭菌1 小时的固体石蜡和液体石蜡1:1 的混合物覆盖,每管盖2 厘米高。d 曝光于25-28 ℃ 下培养,3-7 天后完全分开的红色菌落出现在较高的稀释度里。选择一支合适的试管培养物表面灭菌,切断玻璃,移去管子,然后在无菌的培养皿里,以无菌操作法把菌落解剖出来。e. 在无菌的完全培养基里乳化菌落,并在一系列稀释度中重复以上操作培养,保证纯度。纯培养物可在这些深层琼脂里保存,2 个月移种一次。② 琼脂培养基划线法:将红色生长物在完全培养基平板上划线接种,于厌氧条件下曝光25-28℃,培养4-7天.挑出典型菌落,重新划线培养,直到纯化为止。纯化后可保存在深层完全培养基中.
红螺菌属的富集培养与分离:其中包括红色红螺菌( 或称深红红螺菌)、度光红螺菌、巨大红螺菌、长形红螺菌、纤细红螺菌(或称细小红螺菌)、棕黄色红螺菌(或称黄褐红螺菌),此类细菌均生长于水和淤泥中,属厌氧或微嗜氧菌,在厌氧条件下.于光亮中能合成有机物.细胞螺旋状盘绕,长度不一,有不等数蜷曲.同种细胞的大小变化很大,有端生丛毛,能运动。细胞内含有菌紫素。菌绿素和类胡罗卜素等.故细菌呈红色、褐红色、绛红色或玫瑰色不一。1.富集培养(1)培养基成分及配制:NH4Cl 1.0 克 K2HPO4 0.5 克 MgCl2 0.2克 NaCl 0.1 克 酵母膏 0.1克 H2O 900毫升,将上面各物溶解于水,在121℃ 蒸汽下灭菌20 分钟。分别制备及过滤除菌下列各液:①5克碳酸氢钠加50 毫升蒸馏水溶解。② 乙醇或4%丙氨酸.③0.1N的磷酸溶液。在基础培养基中加入碳酸氢钠溶液和1.5-2.0毫升乙醇或50毫升4%丙氨酸.用0.1N的磷酸调pH 至7.0(2)富集培养:① 最适的接种物是暴露在光下的富含有机物的淤泥。接种时,放淤泥于50 毫升的带玻璃塞的磨口瓶中.酌量放一层。② 加满培养基,塞好塞于, 隔绝空气。③ 置于30 ℃ 的照明箱中培养,培养物放在离照明的25 瓦钨丝灯4 英寸处。④ 观察 通常在3 天内可见到液体培养基里和淤泥曝光的一侧呈现微红色的生长物。⑤ 从微红色处取1 毫升的富集培养物,接种于第二瓶的富集培养基中,培养2 天.2.分离培养(1)培养基成分及配制:从上面的富集培养基中加酵母膏至0.2%,及1.5-2.0克琼脂(但碳酸氢钠应改为2 克),制法同上。另取Na2S·9H2O 1 克,加水10 毫升,于121 ℃ 蒸汽下灭菌15分钟,在调pH 之前将此液加到分离培养基中,分装,灭菌后制成平板或柱状培养基。(2)接种:取富集培养物于分离平板培养基上划线或涂布接种.或用摇管法于柱状培养基中分离.后者由于硫化钠在培养基深处把氧气迅速消耗,很快就形成厌氧条件。如用前一种分离法,可用焦性没食子酸和碳酸钠造成厌氧条件.或于其他的缺氧条件下培养,挑选具有此类细菌特征的菌落.作穿刺接种,管口塞紧后封蜡,培养,备用。
1.培养基:
(1)酵母膏 0.5 g/L NH4C1 1.0 g/L NaAC 3.5 g/L MgCL2 0.1 g/L CaC12 0.1 g/L KH2PO4 0.6 g/L K2HPO4 0.4 g/L PH 7.2-7.4
(富集用)
★(2) 酵母膏 1.0 g/L 羟基丁二酸(苹果酸) 0.5 g/L NH4C1 1.0 g/L NaAC 3.0 g/L NaC1 1.0 g/L NaHCO3 1.5 g/L K2HPO4 0.2 g/L MgSO4 0.2 g/L
PH 7.0-7.2 ( 专利 富集用)
(3) 酵母膏 0.1g/L NaAC 3.0 g/L (NH4)2SO4 1.0 g/L MgSO4 0.2 g/L
NaC1 1.0 g/L KH2PO4 0.3 g/L K2HPO4 0.5 g/L CaC12 0.05 g/L
PH 7.2-7.4 (分离纯化用)
(4)酵母膏 3 g/L 蛋白胨 3g/L NaC1 10g/L MgSO4 0.5 g/L KH2PO4 0.25 g/L PH 7.2-7.4 (计数保存用)
★(5)酵母膏 0.5g/L NH4C1 1.0g/L NaAC 3.0g/L MgC12 0.1g/L NaHCO31.5 g/L CaC12 0.1g/L NaC11.0g/L KH2PO4 0.6g/L K2HPO4 0.4g/L 黄腐酸0.2g/L或苹果酸0.3g/L PH 7.2-7.4 (富集分离用)
可加促进剂黄腐酸0.1-0.3 g/L 乙醇3.0 g/L代替NaAC 作碳源 PH上升慢(专利)。
★(6)酵母膏 0.1g/L NaAC 3.0g/L 丙酸钠0.3g/L NaC1 0.5g/L NH4C11.0g/L MgSO4 0.2g/L 蛋白胨0.01g/L 谷氨酸0.2/1000g/L K2HPO4 0.3g/L KH2PO4 0.5g/L CaC12 0.05g/L MnC12 0.003g/L FeSO4 0.005g/L
PH 7.2-7.4(分离纯化用)
(7)NH4Cl0.1g NaHCO3 0.1g KH2PO4 0.02g CH3COONa 0.1-0.5g MgSO4.7HO2 0.02g NaCl0.05-0.2g 生长因子1ml 微量元素溶液1ml 蒸馏水97ml
PH7.0-7.2
(8)醋酸钠1.145g/L、蛋白胨0.055g/L、碳酸氢钠0.6g/L、硫代硫酸钠0.4g/L、氯化钠0.3g/L、硫酸镁0.1g/L、磷酸二氢钾0.05g/L。
2.富集培养:
2.1采样:淡水、海水、底泥、有机物污染、营养化虾池等
2.2富集培养:
1-5g底泥 1mL水样 一层底泥
或15mL水样 10mL/15×150mm 试管 250mL/250mL
200mL/250mL磨口瓶 带螺帽或橡胶塞 细口磨口瓶
石蜡封面 石蜡封面 装满扎好
转接10-15mL 转接0.5-1.0ml菌液 转接1mL菌液
菌液于同样条件下培养 于同样条件下培养 于25mL/25mL小磨口瓶
25℃-30℃ 7-14天(海水1-3月)
连续光照(2000-3000lx)40-60w灯泡距离20-50cm,培养基转为红色或紫色(棕红)。若不出现红色可在富集一次,直到出现红色的培养液。
注意事项:转接时一定震荡均匀
底泥和水样经曝晒后使用
避藻措施:滤光片>800nm,添加0.05%NaCL,绿色蓝色遮阴布遮阴.含氯化物培养基优于硫酸盐。
3.分离纯化
紫色非硫菌:生长较快,七天左右移植合适,海水种慢(2-3周)
平板混菌 单菌落划线 半固体或液体石蜡封面保存
石蜡密封二至三次
富集菌液 或双平板直接划线 双平板
连续光照 连续光照 连续光照
梯度稀释(10-4 10-5 10-6)
深层柱式半固体培养 挑单菌落于液体培养 重复半固体培养
(0.6%-0.8%琼脂) 或双平板培养
菌液混合均匀
石蜡封面,橡胶塞封好扎紧
28℃-30℃ 7-10天 28℃-30℃ 7-10天或
连续光照60w白炽灯泡. 增加一次穿刺接种,表面封蜡.
距离30-40cm。 连续光照
直到培养基中没有杂菌菌落,染色镜检得纯菌株。
注 :
1.也可蘸去一环富集液直接化线双平板培养。白色或杂色为杂菌,紫红色为光合
细菌不同土壤和水样得到不同光合细菌,有杂菌过多无法得单菌落,有时会分离
到藻类.
2. 光合细菌培养周期较长,培养时采用在大烧杯中放入培养的平皿,周围
放一些加水棉球,盖上玻璃板在培养箱中培养以防干裂。
3.可取1mL富集液于10mL半固体培养基中混均培养,当琼脂中出现红色
菌落时,进行单菌落液体培养。
4.商品制剂中光合细菌的分离鉴定及快速培养
(1)培养基:
固体培养基★(6)
液体培养基:蛋白胨1.5g/L NaC1 0.5g/L NH4C11.0g/L MgSO4 0.2 g/L K2HPO4 0.5g/L Na2CO3 5g/L PH 7.2-7.4
碳源和电子受体:苯甲酸 柠檬酸钠 乳酸钠 乙酸钠 丙酸钠 甘油 丙酮酸
苹果酸 甲醇 甘露醇 硫代硫酸钠。
(2)实验方法:
1)厌氧条件建立:双层平板培养基法或厌氧袋法。
2)光合细菌的分离纯化:双层平板进行分离,通过观察,挑取红色单菌落,复平板划线得菌株B3。
3)菌落及菌体观察:革兰氏染色油镜观察。
4)碳源和电子受体利用试验:在每支厌氧管中分别加入各种碳源和电子受体,然后接种菌株B3光照培养,几天后观察结果。
(3)细菌鉴定:据伯和常见细菌系统鉴定手册进行鉴定。
(4)B3快速培养条件确定:
分别在不同条件下培养,采用分光光度计测定OD值。
最大吸收波长确定:以液体培养基为空白
光合细菌制剂规摸性培养
1.生产条件
1.1营养:淡水型对盐要求0.1%-0.2%,海水型 1%-3%。紫色非硫菌要求多种生长因子,多为B族类。淀粉厂废水.酒精厂废液均为很好材料
1.2光照 :最适2000-3000lx(勒)40W、60W灯泡(1000lx左右)距离25-30cm。
光照强度1000-6000lx均可生长,超过4000lx菌液转色快,易老化,附壁碎片沉淀不易保存。光线不足,速度慢.菌液浅,杂菌易污染。
1.3温度: 最适28℃-30℃ 5-7天转为棕红色并有少量附壁现象
15℃-35℃均能生长,达到对数期时间不同.
20℃-30℃ 四至五天达到对数期.
35℃-40℃三至四天生长旺盛,五天明显抑制,附壁下沉,细胞碎片。
1.4PH :6.5-7.5 培养过程中PH不断上升
6.5-8.5均能生长
PH≤6.5 前三天慢,四天后生长良好
PH≥8.0 三天良好,第四天慢(PH上升),八天达峰值
PH≥9.0显著影响,菌数下降。
1.5氧气:光合细菌在微氧条件相对缺氧时生长快,菌体的营养成分相对较高,
其需氧量在0.2~0.5vvm。种子在玻璃瓶培养时,采用棉塞封口,每天至少摇晃
2次 。
2.生产工艺
流程:试管菌种 三角瓶 种子培养 开放式培养
2.1试管培养:2×15mL/15×150mm 活力强,繁殖速度快,菌液鲜艳
试管菌种定期转接防止老化
2.2 三角瓶培养:2×400mL/500mL三角瓶 ,121℃ 20-30min
接种量2%-3% 28℃-30℃ 5-7天,菌液均匀无沉淀,颜色紫红至棕红色,有菌液固有的清香味。
2.3 血清瓶培养(或卡氏罐):2×8L/10L血清瓶 121℃ 20-30min
接种量5% 连续光照 28℃-30℃ 5-7天,菌液均匀,转色好,无附壁沉淀碎片现象。
2.4 种子培养:6×20L/20L塑料桶
灭菌:容器采用化学灭菌法;0.5L/T水 次氯酸钠水溶液浸泡12-24小时,滤菌水冲洗二遍即可使用
培养基灭菌;卡氏罐培养基灭菌后于无菌室内分装,或所有物料加30-50%水
高压蒸汽灭菌分装后滤菌水补齐。
接种量:10%-15% 28℃-30℃ 5-7天 连续光照
2.5开放式培养:
2.5.1. 灭菌:25×20L/20L塑料桶
0.5T暂存罐灭菌,将0.5T滤菌水泵人暂存罐,加入培养物料,充分溶解后分装
于25×20L塑料桶(化学灭菌)中备用。
2.5.2. 培养条件:接种量20%-30% PH7.2-7.4 28℃-30℃ 连续光照 7-9天
2.5.3 .发酵管理:
a. 摇动:每天至少二次,定时进行 防止菌种下沉。
b. PH调节:PH≥9.0及时调整(醋酸 盐酸等),PH上升光合菌生长特征。
c. 外观:菌液均匀,基本无分层 无附壁 碎片或沉淀现象(光强 温高 退
化菌种等)。颜色由浅红 粉红变为 棕(深)红色 ,10-30亿cfu/mL
2.5.4.保存期:夏天三个月 冬天六个月,保持80%活力。
2.6分段培养法:是提高菌浓度的有效方法
一般培养三天后,PH变为8.0左右,补充新鲜培养基后,PH又变为7.0。
可考虑1.0%食醋。
2.7问题与讨论:a.变浅:接种量少 ,菌种老化杂菌多,PH过高过低,光线不
足,温度过高过低,水硬度大。
b.变黑:气温较高季节长期失去光照。
c.变绿:多见于高温季节绿硫菌繁殖,连续多次密闭发酵,更换菌种和水源。
d.变灰:接种小,菌种不纯,光线不足,PH 过低。
2.8光合细菌的成品保存:
低温凉爽,每天不低于2小时光照,光合细菌生长惯性,若突然无光照,5-10
天菌液发臭,刚开始时给一定光即可缓和,逐渐降光照,光合细菌进入稳定期时
在阴凉避光可保存6月之久。
附 :光合细菌固定方法:
1.沸石粉: 粒度120目
2.光合细菌浓缩液:用浓度3-5g/L磷酸氢钙溶液,将光合细菌培养液菌体过夜,
虹吸法吸取上清液即为光合细菌浓缩液.
3.菌体固定化
沸石粉50g 添加粘度500mpa 海藻酸钠2.0kg 或 粘度800mpa 2.5kg 粘度1000mpa 1.5kg,在加入光合细菌浓缩液12-15 kg混均,制粒机成型粒径5mm,置于20g/L的氯化钙溶液硬化12h,取出自来水漂洗二次装袋保藏.光合细菌持续降解氨氮.小分子有机酸等有害污染物的作用。
光合细菌计数及保藏
1.光合细菌计数:双琼脂平板计数法
血球计数板法:准,繁,液体管法:时间长(12天),比色法:简单偏差大,标准比浊管难保藏,双琼脂平板计数法:简单.准确。
1.1.培养基:双琼脂平板 上层1%琼脂,下层0.8%琼脂
1.2.操作步骤:
梯度稀释 烤板(下层) 加上层琼脂(15mL)
10-610-710-8 涂布或混菌 28一30℃
45一50℃ 5一7天
20一30 min 连续光照 测活菌数
2.菌种保藏:
2.1.液体保藏法: 时间1一2月,适于短时间生产性保存.28一30℃ 5一7天,每天震荡一次防止附壁或下沉,易污染(霉菌).防止退化,每月转接一次。表面封蜡保存法(放在干燥器中)保存一年以上,适于长时间保种。
2.2.半固体保存法:琼脂0.8一1.0% 穿刺接种封石蜡. 杂菌率低.总菌含量稍
低,使用前活化扩增。 28一30℃ 60w灯泡距离30一40cm 7一14天,连续光
照下置于冰箱保存.保存时间一年以上。
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