毛细管区带电泳检测磷霉素的杂质谱.pdf

.765.收稿日期：2011-02-10作者简介：刘浩，男，生于1968年，博士，主任药师，主要从事药物分析研究。E-mail:；刘畅，文章编号：1001-8689(2011)10-0765-07中国抗生素杂志2011年10月第36卷第10期毛细管区带电泳检测磷霉素的杂质谱刘浩 刘畅(上海市食品药品检验所，上海 201203)摘要：目的 采用毛细管区带电泳(CZE)-间接紫外检测技术检测磷霉素的杂质谱。方法 在CZE系统中采用同时含阳离子探针和阴离子探针的背景电解质，分别为无光吸收特征的阳离子组分和阴离子组分提供背景吸收并同时检测和筛查，以便得到磷霉素较为完整的杂质谱；为证实分离系统的专属性和有效性，分别采用杂质对照品、半制备HPLC和梯度洗脱HPLC-电喷雾离子阱质谱对杂质谱中的主要杂质进行了确认。结果 采用该方法可将国外药典的HPLC系统难以分离的杂质与磷霉素分离，可从磷霉素的粗品中可分离出7个已知杂质和至少19个未知杂质，可检测在HPLC系统中难以检测的磷霉素的强保留杂质。结论 该方法可应用于磷霉素的杂质谱检测。关键词：毛细管区带电泳；杂质谱；磷霉素中图分类号：O657.7，R978.1+1 文章标识码：AImpurity profi ling of fosfomycin by capillary zone electrophoresisLiu Hao and Liu Chang(Shanghai Institute for Food and Drug Control,Shanghai 201203)Abstract Objective A capillary zone electrophoresis(CZE)method was established to detect the impurity profi le of fosfomycin.Methods In order to obtain full impurity profi le,a background electrolyte containing both an anionic probe and a cationic probe in a CZE system was used to simultaneously detect anionic ions and cationic ions possessing no chromophore in fosfomycin.Impurity reference standards,semi-preparative HPLC,and gradient HPLC electrospray ion trap mass spectrometry were used to confi rm the selectivity and validity of the separation system.Results Using the novel method,7 known impurities and at least 19 unknown impurities could be separated from a raw sample,while the pharmacopeia HPLC method might be diffi cult to separate most of these impurities,especially for the strong retained impurities.Conclusion This method can be used for the impurity profi ling of fosfomycin.Key words Capillary zone electrophoresis;Impurity profi le;Fosfomycin磷霉素是中国卫生部发布的“产NDM-1泛耐药肠杆菌科细菌感染诊疗指南(试行版)”建议的治疗超级细菌感染的6种非-内酰胺抗菌药物之一。该药的不良反应发生率为10%17%。近年来，随着临床应用范围的扩大，其不良反应呈增多趋势，且有些反应较为严重，以过敏性休克及过敏性休克而致死亡的报道居多。在抗感染药致过敏性休克中，与磷霉素有关的发生率居第4位1-3。已知抗生素中存在的高分子杂质(聚合物)可引发过敏反应4，其他杂质如工艺杂质和降解产物等也有可能导致不良反应的发生。因此，磷霉素的杂质谱检测在药品的质量控制中是非常必要的。磷霉素的亲水性较强且无光吸收特征，较难采用一般的分离分析方法控制其质量。现行英国药典 分析质控与制剂.766.毛细管区带电泳检测磷霉素的杂质谱 刘浩等采用氨基柱-HPLC-示差折光检测磷霉素氨丁三醇的杂质包括4个已知杂质：杂质A(磷霉素二醇物)、杂质B、杂质C和杂质D5。该系统所用流动相含有较高浓度的无机盐，且该检测器的平衡所需时间较长，导致稳定性较差的氨基柱可能在色谱系统完全平衡前即已损坏并降低分离能力；该检测器的灵敏度较低，因而样品溶液的浓度高达0.12g/mL，致使有关物质之间的分离较差，且可能有杂质包括副产物、降解产物、聚合物和中间体如顺丙烯磷酸(图1)等未被分离并检测；该方法未采用梯度洗脱，示差折光检测器也不适用于梯度洗脱，故可能有强保留的杂质未被检测出。磷霉素的杂质检测也可采用离子对HPLC-蒸发光散射检测(ELSD)技术6。但采用梯度洗脱时基线波动较大，强保留的杂质峰叠加在波动的基线上，难以识别和检测。将流动相中乙腈的浓度增加至约30%即可将强保留的杂质全部洗脱，唯杂质之间的分离较差；注射用磷霉素钠中添加的枸橼酸与个别未知杂质难以分离。采用梯度洗脱离子对HPLC-电喷雾离子阱质谱(ESI-MS)实验发现，无论怎样优化色谱系统，始终有一未见报道的杂质与磷霉素同时洗脱，根据多级质谱图推断其可能为磷霉素与磷霉素二醇物聚合物(暂命名为杂质E，图1)7。显然，如不能对该杂质进行有效的控制可能会引发过敏反应。杂质谱中的主要杂质进行了确认。1 仪器与试药Agilent G1600AX型毛细管电泳仪，配置光电二极管阵列检测器；Agilent 1100型高效液相色谱仪；Agilent 6330型质谱仪，配置电喷雾离子源和离子阱质谱检测器；Agilent 1100型示差折光检测器；Alltech 2000型蒸发光散射检测器。CZE计算机模拟软件Peakmaster 5.2(Charles University，布拉格，捷克共和国)。顺丙烯磷酸和磷霉素氨丁三醇粗品：东北制药总厂；磷霉素氨丁三醇市售品：山西博康制药有限公司；注射用磷霉素钠市售品：哈药集团三精药业有限公司；磷霉素二醇物对照品、磷霉素氨丁三醇对照品；欧洲药典委员会。正辛胺(99%)：Aldrich，分析纯；乙腈：Merck，梯度级；邻苯二甲酸(99.5%，T)、山梨酸：(99%，T)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、苄胺(99.5%，GC)：Fluka；双(2-羟乙基)氨基-三羟甲基甲烷(Bis-Tris，98%，T)：SIGMA；氨丁三醇(Tris)、二甲亚砜、无水甲酸、冰醋酸：分析纯；水：Millipore Milli-Q Gradient A10纯水仪制备。2 实验条件2.1 CZE条件对磷霉素中可解离的有关物质的筛查：非涂层弹性石英毛细管(50m i.d.，柱长为48.5cm，有效柱长为40cm，河北永年锐沣色谱器件有限公司)；背景电解质(BGE)：10mmol/L山梨酸溶液(用1mol/L苄胺溶液调节pH值分别为4.6、5.4、5.7、6.2和6.7)；操作电压：30kV；分析过程中于进样端持续加压25mbar；毛细管温度：20；检测波长：225nm(参比波长：off)；进样方法：进样端加压，25mbar，3s。样品溶液：磷霉素氨丁三醇粗品的水溶液(2mg/mL)。磷霉素杂质谱的检测：非涂层弹性石英毛细管(75m i.d.，柱长为96.5或112.5cm，相应的有效柱长分别为88和104cm，河北永年锐沣色谱器件有限公司)；背景电解质(BGE)：用于检测淌度大于磷霉素的杂质：含0.2mmol/L CTAB的10mmol/L邻苯二甲酸溶液(用Bis-Tris调节pH值为5.6)；用于检测淌度小于磷霉素的杂质：含0.2mmol/L CTAB的10mmol/L山梨酸溶液(用Bis-Tris调节pH值为5.6)；操作电压：-30kV；毛细管温度：20；检测波长：225nm(参比波长：off)；杂质定量时检测波长：320nm(参比波长：225nm，可使检测到的峰形为正峰以便于积CH3HP OHOHOHHHOH3CPOOHOPOHOCH3HOOH 顺丙烯磷酸 杂质E图1 顺丙烯磷酸和杂质E的结构式Fig.1 Structures of cis-1-propenylphosphonic acid and impurity E磷霉素的检测还可采用HPLC-间接紫外检测和毛细管区带电泳(CZE)-间接紫外检测8-10。但未见有采用该类方法检测磷霉素杂质的报道。根据磷霉素的合成工艺和结构特征，本品中还可能含有其他杂质，优化后的HPLC-ELSD实验也证实尚有一些难以分离的未知杂质，而上述HPLC-ESI-MS系统的检测灵敏度较低，故这些潜在的杂质未被检测出。鉴于目前HPLC技术难以对磷霉素及其杂质进行有效的分离分析，本课题采用新设计的CZE-间接紫外检测系统分离磷霉素及其杂质；方法建立过程中为证实分离系统的专属性和有效性，分别采用杂质对照品、半制备HPLC等技术和HPLC-ESI-MS对.767.分)；进样方法：进样端加压，25mbar，6s(检测淌度大于磷霉素的杂质)，或25mbar，3s(检测淌度小于磷霉素的杂质)。两次进样中间用BGE冲洗毛细管3min。样品溶液：含供试品约5mg/mL的水溶液。2.2 半制备HPLC条件色谱柱：Synergi 4 Fusion-RP 80A(250mm 4.6mm，4m)；流动相：用于检测保留值小于磷霉素的杂质：5mmol/L正辛胺溶液(用无水甲酸调节pH值至5.2)-乙腈(90:10)；用于检测保留值大于磷霉素的杂质：5mmol/L正辛胺溶液(用无水甲酸调节pH值至5.2)-乙腈(72:28)；流速：1.5mL/min；柱温：35；进样体积：20L；采用分流模式；雾化气：空气；蒸发温度：50；雾化气流速：0.9L/min。半制备时，断开色谱柱与检测器之间的连接，根据此前分析所得色谱图中各组分的保留时间，在各组分的保留时间点前约0.5min时开始收集洗脱液约1.5mL至收集小瓶并再次进样分析(进样体积为50L)以确认杂质溶液制备的成功。再将含杂质的洗脱液用HPLC-ESI-MS分析确认杂质的结构7。样品溶液：磷霉素氨丁三醇粗品的水溶液(20mg/mL)。3 结果与讨论3.1 半制备HPLC的结果如采用HPLC-ELSD系统6分析磷霉素氨丁三醇粗品并收集含目标杂质的洗脱液进行CZE分析，则因醋酸根与磷霉素的淌度接近而与磷霉素难以分离，且洗脱液中醋酸根的浓度较高可在该CZE系统中可产生去堆积效应，致使目标杂质在CZE过程中展宽而难以检测。将流动相中的正辛胺浓度减为5mmol/L，并改用无水甲酸调节流动相的pH值，进样分析所得色谱图与原系统6所得色谱图类似，表明分离选择性未发生改变，唯各组分的保留值稍减少，且流动相的缓冲容量较低。在CZE系统中，甲酸根的淌度显著低于磷霉素及其杂质的淌度且浓度较低，可减少由甲酸根所引起的去堆积效应，增加目标杂质的检测灵敏度。将含杂质的洗脱液用HPLC-ESI-MS7分析证实分离选择性并未因流动相的微调而发生改变。强保留的未知杂质因含量较低且在HPLC-ESI-MS系统中相互间的分离较差而未能确证其结构。3.2 CZE系统的建立与优化3.2.1 对磷霉素中可解离的杂质的筛查根据化合物的结构式，在酸性BGE中，磷霉素氨丁三醇中可能存在的杂质如磷霉素二醇物与两分子Tris聚合形成的磷酸酯以及Tris等均荷正电，在CZE系统中向阴极(进样端)迁移，无法检测；而磷霉素或磷霉素二醇物与Tris聚合形成的磷酸酯、杂质B和杂质C等均呈近电中性，无法产生电迁移，虽可为电渗流(EOF)所驱动但无法分离并检测。为考察是否存在上述杂质，拟采用同时含阳离子探针和阴离子探针的BGE，分别为无光吸收特征的阳离子组分和阴离子组分提供背景吸收，调节两种探针试剂的浓度比以得到不同pH值的BGE，使在酸性BGE中呈电中性的杂质可在近中性的BGE中解离并荷负电，从而产生电迁移并被检测。在该CZE系统中，进样端为阳极，荷正电化合物向阴极迁移，与EOF的迁移方向相同，最先出现在检测窗中；而磷霉素及其杂质等荷负电化合物向阳极(进样端)迁移，与EOF的迁移方向相反，但其迁移速率小于EOF的迁移速率，故最终也会出现在检测窗中，淌度小者最先被检测到；因淌度大的磷霉素杂质迁移时间过长，为此，在分析过程中于进样端适当加压(压力辅助-CZE)，以驱动该类杂质加速迁移。采用Peakmaster 5.2软件设计CZE系统并经实验优化，最终确立的BGE为：10mmol/L山梨酸溶液(用1mol/L苄胺溶液调节pH值分别为4.6、5.4、5.7、6.2和6.7)。山梨酸根(pKa4.77)和苄铵(pKa9.33)分别为无光吸收特征的阳离子组分和阴离子组分提供背景吸收。结果(图23)显示，随着BGE的pH值增加，除Tris+外，并无其他荷正电杂质(迁移速度大于EOF)出现在电泳图中；pH值为5.4时，有一较大的杂质自EOF中分离出来并在EOF之后迁移；随着pH值的增加，该杂质与EOF的分离度增加，提示该杂质在酸性溶液中呈电中性并随着pH值的增加而逐渐解离并荷负电；该杂质与杂质B的迁移时间相同；随着pH值的进一步增加，再无新的杂质出现在电泳图中；pH6.7时，磷霉素二醇物区带展宽，磷霉素区带发生裂分，淌度大于磷霉素的杂质区带显著展宽；磷霉素氨丁三醇粗品中含有大量杂质，这些杂质之间的淌度差异较大，如选用与磷霉素和磷霉素二醇物淌度接近的山梨酸根作探针离子，则淌度小于磷霉素的杂质之间分离较好且峰形较佳，而淌度大于磷霉素的杂质之间分离较差且区带展宽以致检测灵敏度降低，提示不宜采用一套CZE系统同时分离所有杂质，淌度大于磷霉素的杂质的测定宜另选用含高淌度探针离子的BGE。3.2.2 淌度小于磷霉素的杂质的分析中国抗生素杂志2011年10月第36卷第10期.768.选择淌度与磷霉素二醇物接近的山梨酸根作探针离子，磷霉素二醇物的峰形对称；与山梨酸根淌度差异较大的磷霉素以及其他杂质则因电迁移扩散(EMD)而区带展宽，检测灵敏度降低；淌度差异越大，组分区带的展宽越严重，检测灵敏度也越低。BGE的pH值在5.45.8范围内可使各组分之间得到有效的分离。用Bis-Tris(pKa6.4)调节BGE的pH值可保证有足够的缓冲容量，可确保探针离子的浓度和BGE的pH值在电泳过程中不会因电解反应的发生而改变11，被测组分的迁移时间和峰面积均能得到较好的重现。已有大量的实验证实，毛细管的表面形态可随着CZE的运行而逐渐发生细微的变化并导致EOF迁移速率的改变。尤其是采用微酸性至中性(pH47)的BGE时，EOF迁移速率的不稳定可使组分迁移时间的重现性较差12。为此，在BGE中添加0.2mmol/L的CTAB，CTA动态吸附在毛细管表面使毛细管表面荷正电，EOF的迁移方向发生逆转并向阳极迁移，EOF的迁移速率较稳定且与荷负电的磷霉素及其杂质的迁移方向相同，故磷霉素及其杂质的迁移时间的重现性较好。取磷霉素氨丁三醇粗品溶液连续进样分析，磷霉素、顺丙烯磷酸、磷霉素二醇物、杂质E、杂质D和杂质B的迁移时间的相对标准偏差(RSD)分别为0.7%、0.8%、0.6%、0.8%、1.0%和1.1%(n=6)。选择225nm处检测，磷霉素及其杂质的信噪比最高。取磷霉素氨丁三醇粗品溶液进样分析(毛细管长112.5cm)，可分离出9个淌度小于磷霉素的杂质(图4B)，其中2个杂质分别为顺丙烯磷酸和磷霉素二醇物。因HPLC制备的杂质溶液中含有较高浓度的正辛铵、甲酸根和乙腈，CZE过程中会导致组分迁移时间的改变和杂质的误认，而且相邻杂质也较多，故采用在样品溶液中添加经HPLC-ESI-MS确认的杂质溶液后再进样分析，并与样品溶液、杂质溶液和流动相的电泳图进行比较，确认另外3个杂质分别为：杂质E、杂质D、杂质B和杂质C。因顺丙烯磷酸紧邻磷霉素迁移，故可通过在样品液中添加适量顺丙烯磷酸的方式来考察系统的适用性。如无顺丙烯磷酸，也可以0.1mol/L盐酸溶液为溶剂配制成5mg/mL的样品溶液，再于室温放置10min，即可产生足量的磷霉素二醇物供系统适用性考察(图4A)。在色谱和电泳等分离检测系统中应用紫外检测器，组分的响应值如峰面积与组分的浓度(进样量)和组分的转换因子(conversion factor)即摩尔吸收值相关并呈线性关系13。在CE系统中，组分的峰面积还与迁移时间相关。迁移时间短的组分通过检测窗的速率快，峰面积相对较小，故CE定量一般采用校正峰面积，即峰面积/迁移时间。如在CZE系统中采用间接紫外检测模式测定无光吸收特征的组分，则所毛细管区带电泳检测磷霉素的杂质谱 刘浩等A：pH4.6；B：pH5.4；C：pH5.71：Tris+；2：EOF；3：杂质B；4：磷霉素二醇物；5：磷霉素图2 磷霉素氨丁三醇粗品溶液的叠加电泳图Fig.2 Overlaid electropherograms of raw fosfomycin trometamol solutionsA：pH6.7；B：pH6.21：Tris+；2：EOF；3：杂质B；4：磷霉素二醇物；5：磷霉素图3 磷霉素氨丁三醇粗品溶液的叠加电泳图Fig.3 Overlaid electropherograms of raw fosfomycin trometamol solutionsA：系统适用性试验溶液；B：磷霉素氨丁三醇粗品1：磷霉素；2：磷霉素二醇物；3：杂质E；4：杂质D；5：杂质C；6：杂质B；7：顺丙烯磷酸；8：未知杂质图4 样品溶液的叠加电泳图Fig.4 Overlaid electropherograms of sample solutions.769.(图5A，毛细管长96.5cm)。按校正峰面积归一化法计算，磷霉素氨丁三醇对照品中检出的顺丙烯磷酸和磷霉素二醇物的含量依次为0.18%和0.24%，但未检出杂质E(图5 B)；注射用磷霉素钠市售品中检出的顺丙烯磷酸、磷霉素二醇物和一个未知杂质的含量依次为0.44%、0.22%和0.19%，但未检出杂质E(图5C)，该未知杂质与来源于顺丙烯磷酸的一个未知杂质的迁移时间相同。显然，因HPLC法无法分离并控制顺丙烯磷酸，造成磷霉素氨丁三醇对照品和注射用磷霉素钠市售品含有较高含量的顺丙烯磷酸，使得对照品的含量标示值偏高和注射用磷霉素钠市售品存在安全隐患。取HPLC保留值大于磷霉素的杂质洗脱液进样分析，确认这些杂质多在磷霉素之前迁移(图5D)。紧邻杂质D之前迁移的一较大的未知杂质(图4B)在HPLC-ELSD系统和HPLC-ESI-MS系统中均未能检出，HPLC制备的杂质溶液的电泳图中也未出现该杂质区带。该杂质的结构确认可能需采用CE-MS联用技术。有组分的校正峰面积仅与具有紫外吸收的探针离子(通常情况下也是同离子)和组分的浓度相关。因此，组分的定量测定并不需要具备每一个组分的对照溶液，只要样品溶液中含有一种已知浓度的标准物质并已知该组分和标准物质的转换因子即可。而组分的转换因子又与其替换比(transfer ratio)相关。后者系指CZE过程中一摩尔组分替代的具有紫外吸收的探针离子的摩尔数14-15。组分的峰面积、浓度、转换因子和替换比等之间关系的详细的推论过程见文献13。如标准物质和组分的淌度差异较小(如5%)并接近反离子淌度的绝对值，则其替换比的差异约为2%，可采用校正峰面积归一化法进行计算。如迁移时间相差1.5倍以上，则采用校正峰面积归一化法测得结果可能与对照品对照法的测定结果相差30%16。在本文的系统中，磷霉素二醇物的峰形对称，即EMD较小，表明探针离子(山梨酸根)与磷霉素二醇物的淌度几乎相同。而且，磷霉素二醇物与邻近组分包括磷霉素、顺丙烯磷酸和杂质E的淌度差异较小。用Peakmaster 5.2软件计算得山梨酸根与反离子(Bis-Tris+)的淌度分别为-2710-9m2V-1s-1和2010-9m2V-1s-1。因此，对磷霉素二醇物及其附近迁移的杂质如顺丙烯磷酸和杂质E等的检测既可采用磷霉素对照品作自身对照，也可采用校正峰面积归一化法。但对于与磷霉素二醇物迁移时间差异较大的杂质如杂质D、杂质C和杂质B(迁移时间相差近1.5倍)等的检测可能误差稍大。取磷霉素氨丁三醇对照品配制浓度分别为5、7.5、25、37.5、50、75和100g/mL的系列溶液(相当于样品中杂质的含量为0.1%2.0%)进样分析，以磷霉素的峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性回归，线性相关系数为0.9990。取浓度为50g/mL的对照品溶液(相当于杂质含量为1.0%)连续进样分析6次，磷霉素峰面积的RSD为3.1%(n=6)。本方法的定量限按磷霉素峰信噪比10:1计为5g/mL(相当于杂质含量为0.1%)，检测限按信噪比3:1计为1.5g/mL(相当于杂质含量为0.03%)。增加进样体积可降低检测限，但磷霉素可能与紧邻的顺丙烯磷酸难以分离而使后者无法检测。取磷霉素氨丁三醇市售品配制成6份溶液，分别进样分析，按校正峰面积归一化法计算，磷霉素氨丁三醇市售品中测得的顺丙烯磷酸、磷霉素二醇物和杂质E的含量平均值依次为0.06%、0.29%和0.49%，相应的RSD依次为4.1%、3.7%和3.1%(n=6)中国抗生素杂志2011年10月第36卷第10期A：磷霉素氨丁三醇市售品；B：磷霉素氨丁三醇对照品C：注射用磷霉素钠市售品；D：保留值大于磷霉素的杂质的洗脱液1.磷霉素；2.顺丙烯磷酸；3.磷霉素二醇物；4.杂质E；5.未知杂质；6.甲酸根图5 样品溶液的叠加电泳图Fig.5 Overlaid electropherograms of sample solutions3.2.3 淌度大于磷霉素的杂质的分析采用与磷霉素和磷霉素二醇物淌度接近的山梨酸根作探针离子时，淌度大于磷霉素的杂质之间分离较差且区带展宽以致检测灵敏度降低，此外，磷霉素氨丁三醇市售品中淌度大于磷霉素的杂质含量较低较难检出。为此，拟采用瞬间等速电泳(t-ITP)技术富集杂质以增加检测灵敏度。在t-ITP过程中，微量的被测离子根据科尔劳施调节功能(Kohlrausch regulation function)以浓缩的区带的形式夹在高淌度离子(前导离子)区带和低淌度离子(终止离子)区带之间迁移，直至进入CZE分离模式17-18。磷霉素样品溶液中含有可作为终止离子的低.770.淌度离子磷霉素，不含可作为前导离子的高淌度离子。考虑到CZE-间接紫外检测系统宜简单化以避免系统区带的产生，故拟选用一种高淌度的探针离子同时兼作前导离子，在毛细管前端构建终止型t-ITP体系。经研究，拟选用邻苯二甲酸根(pKa5.41、2.95)为探针离子，用Bis-Tris调节BGE的pH值在5.45.8之间，在BGE中添加0.2mmol/L CTAB，可使各组分之间得到有效的分离，磷霉素及其杂质的迁移时间的重现性较好。已知t-ITP体系中堆积效应会随着前导离子浓度的增加而增强，故本文系统中探针离子浓度增加可增强堆积效应并相应地使供试品溶液的进样体积增加。但探针离子浓度的增加是有限的，因BGE的背景吸收不能超出紫外检测器的线性范围。按文献方法19进行试验，浓度为20mmol/L时，背景吸收开始偏离检测线性范围。浓度为15mmol/L时，基线噪声会显著增加，故最终选择为10mmol/L。检测波长越低，吸收值越大，但基线噪声也相应增加，选择225nm处检测，磷霉素及其杂质的信噪比最高。进样端加压(25mbar)8s时，因进样量较大，无法分离出磷霉素之前迁移的一个未知杂质，进样时间降为6s时可将该杂质分离出。与采用山梨酸作探针离子相比，进样体积增加了1倍。取磷霉素氨丁三醇粗品溶液进样分析，可分离出至少15个淌度大于磷霉素的杂质(图6C，毛细管长112.5cm)，其中一个杂质为 H2PO4-。样品溶液中高浓度的磷霉素产生的去堆积效应，可使淌度小于磷霉素的磷霉素二醇物等杂质峰展宽甚至变形，检测灵敏度降低并难以检测。取磷霉素氨丁三醇对照品配制浓度分别为5、7.5、25、37.5、50、75和100g/mL的系列溶液(相当于杂质的含量为0.1%2.0%)进样分析，以磷霉素的峰面积比为纵坐标，磷霉素浓度为横坐标，进行线性回归，线性相关系数为0.9991。取浓度为50g/mL的对照品溶液(相当于杂质的含量为1.0%)连续进样分析6次，磷霉素峰面积的RSD为3.3%(n=6)。本方法的定量限按磷霉素峰信噪比101计为5g/mL(相当于杂质含量为0.1%)，检测限按信噪比31计为1.5g/mL(相当于杂质含量为0.03%)。因磷霉素与探针离子的淌度差异较大，使得磷霉素峰因EMD而展宽，如以磷霉素作自身对照会低估本方法的检测灵敏度，但实际上淌度大于磷霉素的杂质与探针离子的淌度差异较小，杂质峰形尖锐，故实际检测灵敏度更高。取注射用磷霉素钠市售品溶液连续进样分析，H2PO4-的迁移时间的RSD为0.5%(n=6)。取磷霉素氨丁三醇市售品配制成6份溶液，分别进样分析，按校正峰面积归一化法计算，注射用磷霉素钠市售品中淌度大于磷霉素的杂质总量的平均值为0.98%，RSD为3.1%(n=6)(图6 A)。按校正峰面积归一化法计算，磷霉素氨丁三醇市售品中淌度大于磷霉素的杂质总量为0.52%(图6B)；磷霉素氨丁三醇对照品中淌度大于磷霉素的杂质总量为0.35%，将进样体积增加12倍可检出微量H2PO4-。注射用磷霉素钠市售品和磷霉素氨丁三醇市售品中也均含磷酸根(图6A、图6B)。毛细管区带电泳检测磷霉素的杂质谱 刘浩等A：注射用磷霉素钠市售品；B：磷霉素氨丁三醇市售品C：磷霉素氨丁三醇粗品1：磷霉素；2：磷霉素二醇物；3：H2PO4-图6 样品溶液的电泳图Fig.6 Overlaid electropherograms of sample solutions取HPLC保留值大于磷霉素的杂质洗脱液进样分析并与磷霉素氨丁三醇粗品溶液和流动相的电泳图进行比较，进一步确认HPLC保留值大于磷霉素的杂质多在磷霉素之前迁移。英国药典方法缺乏对这些强保留杂质的认知和控制可能会造成临床的安全隐患和对照品含量标示值的偏高。取HPLC保留值小于磷霉素的杂质的洗脱液进样分析并与磷霉素氨丁三醇粗品溶液的电泳图进行比较，确认HPLC保留值小于磷霉素的杂质均在磷霉素之后迁移。取注射用磷霉素钠市售品的水溶液进样分析并与磷霉素氨丁三醇粗品溶液的电泳图进行比较，确认注射用磷霉素钠中添加的枸橼酸根在所有有关物质之前迁移，不影响有关物质的检查。参 考 文 献1 凌静,冯友根,赵莉丽.磷霉素钠不良反应分析J.中国现代应用药学杂志,2005,22(7):604-606.2 王艳宁,钟慧.1994年-2004年磷霉素致过敏性休克文献分析J.中国药房2006,17(6):452-453.3 杨丽杰,李晓盟,郭美华.磷霉素钠注射液148例不良反.771.应文献分析J.中国临床药理学与治疗学,2008,13(3):320-322.4 胡昌勤.抗菌药中高分子杂质的特性及抗菌药过敏反应(上)J.中国药师,2006,9(3):238-240.5 British Pharmacopoeia Commission.British Pharmacopoeia 2010,Volume 1S.The Stationary Office,London,2009,957-959.6 Liu H,Wang H W,Sunderland V B.Determination of fosfomycin trometamol and its related substances in bulk drug by ion-pair HPLC with evaporative light scattering detectionJ.J Liq Chromatogr Rel Tech,2006,29(1):15-24.7 刘畅,凌文婷,刘浩.液相色谱-电喷雾离子阱质谱法分析磷霉素氨丁三醇及其有关物质J.药物分析杂志,2009,29(12):2081-2084.8 胡玉玲,达世禄,冯钰锜,等.吖啶作为检测试剂的磷霉素间接紫外反相高效液相色谱研究J.色谱,1999,17(3):271-274.9 Petsch M,Mayer-Helm B X,Sauermann R,et al.Capillary electrophoresis analysis of fosfomycin in biological fluids for clinical pharmacokinetic studiesJ.Electrophoresis,2004,25(14):2292-2298.10 Petsch M,Mayer-Helm B X,Sauermann R,et al.Determination of fosfomycin in pus by capillary zone electrophoresisJ.J Chromatogr A,2005,1081(1/2):55-59.11 Macka M,Andersson P,Haddad P R.Changes in electrolyte pH due to electrolysis during capillary zone electrophoresisJ.Anal Chem,1998,70(4):743-749.12 Kaupp S,Bubert H,Baur L,et al.Unexpected surface chemistry in capillaries for electrophoresisJ.J Chromatogr A,2000,894(1/2):73-77.13 Beckers J L,Bocek P.Calibrationless quantitative analysis by indirect UV absorbance detection in capillary zone electrophoresis:The concept of the conversion factorJ.Electrophoresis,2004,25(2):338-343.14 Doble P,Andersson P,Haddad P R.Determination and prediction of transfer ratios for anions in capillary zone electrophoresis with indirect UV detectionJ.J Chromatogr A,1997,770(1/2):291-300.15 Beckers J L.Transfer ratio in indirect UV detection in capillary zone electrophoresis:A mathematical approachJ.J Chromatogr A,1999,844(1/2):321-331.16 Roldan-Assad R,Gareil P.Capillary zone electrophoretic determination of C2-C18 linear saturated free fatty acids with indirect absorbance detectionJ.J Chromatogr A,1995,708(2):339-350.17 Urbanek M,Krivankova L,Bocek P.Stacking phenomena in electromigration:From basic principles to practical proceduresJ.Electrophoresis,2003,24(3):466-485.18 Beckers J L,Bocek P.Sample stacking in capillary zone electrophoresis:Principles,advantages and limitationsJ.Electrophoresis,2000,21(14):2747-2767.19 Johns C,Macka M,Haddad P R,et al.Practical method for evaluation of linearity and effective pathlength of on-capillary photometric detectors in capillary electrophoresisJ.J Chromtogr A,2001,927(1/2):237-241.中国抗生素杂志2011年10月第36卷第10期