荧光探针用于细胞内硒代半胱氨酸检测的研究进展_张姻.pdf

收稿日期：；修回日期：；录用日期：基金项目：国家自然科学青年基金（）、湖南省自然科学基金（）和湖南省教育厅科学研究（）资助项目。：荧光探针用于细胞内硒代半胱氨酸检测的研究进展张姻，赵美，胡婉迪，卢丹青（中南林业科技大学材料科学与工程学院理学院，湖南 长沙 ）摘要：硒代半胱氨酸（）在人体调控免疫反应、抑制癌症的发生，以及维持生理氧化还原平衡等方面发挥着十分重要的作用。采用荧光探针直接在分子水平上对硒代半胱氨酸进行体内实时无损检测是探索生理活动机制的最有效的方法。总结了不同类型的荧光探针分子的设计原理及其对应的传感检测机制和成像应用。对比了不同的分析检测方式以及效果，介绍了用于生物硒代半胱氨酸检测的特异性荧光探针的最新进展。关键词：荧光探针；硒代半胱氨酸；荧光检测；细胞成像中图分类号：文献标志码：，（，）：（），：；微量硒元素可以整合在硒蛋白之中，在抗氧化、预防心血管疾病等方面扮演着重要的角色。人体内缺硒会导致克山病、大骨节病、肿瘤和癌症的患病概率增加。但是人体内硒的含量也不是越多越好，所需硒的范围约为 （硒对人体是有益处的），硒的含量过高时就会引起人体硒中毒。人体中硒的种类可以分为无机硒和有机硒：无机硒主要以硒酸盐、硒磷酸根离子等形式存在；有机硒主要以硒代半胱氨酸（）、硒代谷胱甘肽、硒代蛋氨酸（）等氨基酸形式存在，其中，硒代蛋氨酸是生物体中硒的主要储备来源，而硒代半胱氨酸是硒蛋白（）的主要活性位点。硒代半胱氨酸是硒蛋白的重要功能成分，影响着硒蛋白的许多功能（包括蛋白质结构、甲状腺激素的产生以及 合成和细胞生长）。已知 多种硒蛋白中，有 种已经被鉴定出可以作为活性位点 。对于质谱法、气相色谱法、液相色谱法等检测方法，通常样品制备复杂、实验条件苛 ，（），：综述与进展 化学世界化学世界化学世界综述与进展刻，而且无法在检测过程中提供有关硒代半胱氨酸生理功能上的相关证明 ，从而限制了它们在活细胞水平上进行检测的应用。荧光分析法因其灵敏度高、选择性好、响应时间短等优势，逐渐受到科研工作者的认可。硒代半胱氨酸主要分布在某些亚细胞器之中，在生物体内含量较低并且极易被空气氧化；硫醇通常以高浓度存在 如：还原性谷胱甘肽（）、同型半胱氨酸（），具有和硒代半胱氨酸相似的化学性质，在 检 测 识 别 过 程 中 对 检 测 结 果 的 干 扰 较大，因此针对硒代半胱氨酸被特异性的精确识别是一个巨大的挑战。在生物硫醇荧光探针设计策略的基础上，利用硒代半胱氨酸和硫醇值的不同（硒代半胱氨酸：；硫醇：），针对硒代半胱氨酸中的 以 形式存在，而硫醇以非离子化的 形式存在这一特点，设计合成了一系列荧光探针用于检测硒代半胱氨酸。年，文献 报道了生物硒醇特异性荧光探针开发的进展，从生物硒醇（硒代半胱氨酸、硫氧还蛋白还原酶（）和）的角度，总结了常见的检测生物硒醇的荧光探针。荧光探针科研工作者在开发 抑制剂时，发现了检测硒代半胱氨酸的机制。本文对有关的 种荧光探针的开发设计分别进行论述，归纳了用于检测硒代半胱氨酸的荧光探针的检测机制主要有：（）基于，二硝基苯磺酸酯键的裂解反应；（）基于，二硝基苯磺酰胺键的裂解反应；（）基于，二硝基苯氧键的裂解反应；（）基于丙烯酸酯的加成反应；（）基于 的裂解反应；（）基于的硒解反应。，二硝基苯磺酸酯键的裂解反应，二硝基苯磺酸酯基团是常见硫醇的识别基团，也是第一个用作硒代半胱氨酸检测的识别基团。等 长期从事硫醇荧光探针研究，年，等 设计了第一个检测硒代半胱氨酸的荧光探针（），通过进一步改变测定溶液的 值，来区分硒代半胱氨酸和同型半胱氨酸。探针以二硝基苯磺酸酯基团为识别基团，以荧光素为母体，在 时，硒代半胱氨酸（）更易发生离子化，产生的 比的亲核性更强，能打断，二硝基苯磺酸酯键；而同型半胱氨酸不能发生此反应，只有在 条件下，才能进行检测区分，在 时，不能进行区分。所以探针不适用于活细胞和组织中硒代半胱氨酸的检测。在 等 发现的第一个基于，二硝基苯磺酸酯键为识别基团的基础上，文献 报道了以苯并噻唑羟基香豆素（）作为荧光团，在设计合成快速检测生物硫醇的荧光探针时发现，随着二甲基亚砜（）用量的减少可以显著降低荧光探针与生物硫醇之间的反应速率，当二甲基亚砜的体积分数为时，荧光探针对包括毫摩尔级浓度的还原性谷胱甘肽在内的生物硫醇几乎没有任何反应，但对硒代半胱氨酸表现出较高的反应活性，并且在反应过程中伴随着明显的光学变化。等 设计合成了第一个基于，二硝基苯磺酸酯键为识别基团，在 的条件下，选择性地检测硒代半胱氨酸的荧光探针。体外光学实验表明，在生物硫醇、氨基酸、阴离子和金属离子的存在下，探针也对硒代半胱氨酸荧光检测具 ，（），有高选择性，而且检出限约为 ，可以更加方便地用于血清样本的检测和活细胞中硒代半胱氨酸的检测和成像应用，因此具有理想的生物应用潜力。文献 报道了一种近红外荧光探针用于特异性识别硒代半胱氨酸。探针直接采用四氢呋喃氧杂蒽融合染料作为荧光团（特有的近红外发光特性），克服了已有的荧光探针发射波长短、水溶性差等缺陷，能够在 内快速检测硒代半胱氨酸，对硒代半胱氨酸表现出特有的选择性响应，灵敏度高，检出限低至 ，并且还具有较好的生物相容性，可成功用于活细胞中硒代半胱氨酸的荧光成像。文献 报道选用氧杂蒽染料设计并合成了一种用于检测硒代半胱氨酸的荧光探针。探针 对 硒 代 半 胱 氨 酸 的 定 量 检 测 范 围 为 ，检出限为 ，也可用于活细胞中硒代半胱氨酸的荧光成像。文献 报道了一种基于荧光共振能量转移（）机理上设计而成的比例型荧光探针。探针选用香豆素荧光团作为能量供体、羟基萘二甲酰亚胺荧光团作为能量受体、，二硝基苯磺酸酯键作为荧光猝灭剂、硒代半胱氨酸作为选择性识别位点，探针自身仅显示蓝色荧光信号，随着硒代半胱氨酸加入，会显示出蓝色和绿色两个发射带（）。硒代半胱氨酸的检出下限值低至 ，具有快速灵敏的比例响应。文献 报道了结合荧光染料（）和荧光共振能量转移机制，设计出一种新型硒代半胱氨酸纳米荧光探针（）（）。如 所示，选 用 双 光 子 荧 光 团 萘 甲 酸（）为能量供体，荧光素（）衍生物与，二硝基苯磺酰氯反应合成了硒代半胱氨酸识别单元和能量受体（），并结合介孔二氧化硅纳米粒子作为生物相容性载体，通过共价耦联荧光共振能量转移供体和受体得到硒代半胱氨酸纳米荧光探针。硒代半胱氨酸纳米荧光探针将双光子荧光激发和荧光共振能量转移相结合，即使在生物硫醇存在的情况下，也可以直接选择性地检测硒代半胱氨酸。硒代半胱氨酸纳米荧光探针与传统的单光子激发荧光成像方法有所不同，硒代半胱氨酸纳米荧光探针采用了近红外双光子激发策略，使光散射和背景荧光最小化，从而改善活体深层组织的时空成像，减少了背景干扰。最为突出的是：硒代半胱氨酸纳米荧光探针中独特的受体荧光团将进行结构重排，从而触发荧光共振能量转移介导的比例荧光增强，通过诱导两个发射通道的自校准对硒代半胱氨酸进行检测。这种方式可以有效地消除与单波长发射荧光检测方法相关的信号误差，同时，硒代半胱氨酸纳米荧光探针可以克服小分子荧光探针水溶性差和在细胞膜上的停留时间短等缺陷，在生物成像应用方面，硒代半胱氨酸纳米荧光探针能在活细胞和组织中特异性地识别硒代半胱氨酸。基于，二硝基苯磺酰胺键的裂解反应 年，文 献 报 道 了 第 一 个 在 条件下工作的硒代半胱氨酸荧光探针。探针基于芳香亲核取代（）的机制，通过调节荧光猝灭单元的电子密度以及荧光团与猝灭团之间的联系去调整分子的反应活性，构建了一个小型的硒代半胱氨酸探针库。吸附在荧光团上的吸电子基团决定了探针的选择性，因此，二硝基苯醚和，二硝基苯磺酰胺对硒代半胱氨酸的选择性均高于硫醇。二硝基苯磺酰胺基团可以被广泛用作硒代半胱氨酸的识别基团，构建合成一系列用于生物系统中硒代半胱氨酸检测的荧光探针（）。等 利用荧光碳点（）具有较高的光稳定性、生物相容性和低毒性等优点，选用由间氨基苯酚制备的黄绿色发射荧光碳点（）作为荧光报告物，选择，二硝基苯磺酰基团（）作为 ，（），化学世界综述与进展识别单元，通过磺胺键在 表面共价耦联，得到，二硝基苯功能化荧光碳点（，图式）。经过体内、体外研究表明，二硝基苯功能化荧光碳点对硒代半胱氨酸具有较高的灵敏度和选择性，可以用作活细胞中外源和内源硒代半胱氨酸荧光成像的有用工具。图式 检测硒代半胱氨酸的机制 等 通过阻断探针上香豆素环位氮原子的内部扭转，设计合成了探针。探针可以显著提高荧光团的量子产率，显示出几乎为零的背景荧光，探针与硒代半胱氨酸快速反应后，荧光强度增加至 倍，具有较高的灵敏性（检出限为 ）。当探针与流式细胞仪结合使用时，能够检测各种人类癌细胞中的内源性硒代半胱氨酸，探针也是第一个检测出癌细胞内硒代半胱氨酸水平高于正常细胞的探针。文献 报道了一种基于糖缀合物的探针，并研制了一种以对硝基苯磺酰胺为检测基团的硒代半胱氨酸荧光探 针。等 开发了一种基于 碱（）及其互补质子化 碱（）形式的硒代半胱氨酸荧光探针。探针与硒代半胱氨酸有特殊的反应，能选择性地去除，二硝基苯磺酰胺键，使探针的亚胺氮的从 移至 ，而且探针具有良好的选择性和灵敏度，可检测活细胞中内源性和外源性硒代半胱 氨 酸。等 利 用 近 红 外 染 料（）和，二硝基苯磺酰胺基团为硒代半胱氨酸识别基团，开发了首个硒代半胱氨酸近红外荧光探针。探针 在 范围内表现出高选择性，表明探针 不仅适用于活细胞而且还适用于活体小鼠中硒代半胱氨酸的荧光成像。等 报道了一种近红外增强型硒代半胱氨酸荧光探针。探针 能够在较宽的 范围内，快速、高选择性、高灵敏度地检测硒代半胱氨酸，具有近红外发射（）、大斯托克斯位移（）、低检出限（）和低细胞毒性等优点，是首个可以方便地用于活细胞外源性和内源性硒代半胱氨酸的荧光成像，也可以轻松用于活体内硒代半胱氨酸的荧光成像研究。另外，文献 报道了一种新的近红外荧光探针，探针 被用于测定活细胞和体内的内源性硒代半胱氨酸。探针 自身无荧光，随着探针 与硒代半胱氨酸反应后，荧光增强了 倍，表现出高灵敏度（检出限为 ）以及大的斯托克斯位移（），探针 对硒代半胱氨酸识别具有较好的选择性，能够识别活细胞中的外源和内源性硒代半胱氨酸。探针 选择性地检测了裸鼠移植的活体肿瘤中内源性产生的硒代半胱氨酸。等 将硒代半胱氨酸识别基团，二硝基苯磺酰胺和线粒体定位基团亲脂性三苯基膦阳离子整合到近红外七甲胺花青荧光团上，开发了一种线粒体靶向的近红外比例荧光探针，探针 在 内快速响应硒代半胱氨酸，不受活性硫物种（）、活性氧物种（）、活性氮物种（）和金属阳离子或阴离子的干扰。探针 可 以 有 效 地 积 聚 在 线 粒 体 中，选 择 性 地 检 测 、和 细胞系中的内源性硒代半胱氨酸浓度。探针 还被用于检测 诱导的线粒体相关急性细胞炎症模型中硒代半胱氨酸浓度的变化，并评估了硒代半胱氨酸对 诱导的急性慢性肝炎的保护作用。等 利用溶酶体中的弱酸性环境，通过结合硒代半胱氨酸识别基团和溶酶体靶向基团，首次合成了一种溶酶体靶向功能探针，并被用于活细胞中选择性监测。探针 不仅在溶酶体微环境中对硒代半胱氨酸高选择性的识别，还能克服常见生物硫醇的假阳性信号。，（），二硝基苯氧键的裂解反应，二硝基苯醚被用于设计硒代半胱氨酸检测的荧光探针的识别基团。等 以二氰亚甲基苯并吡喃（）为近红外荧光团、，二硝基苯醚（）为识别基团，开发了一种用于硒代半胱氨酸的比色和近红外荧光探针（）。探针 对硒代半胱氨酸的快速、高度选择性的检测，具有明显的比色和近红外荧光开启响应。等 通过硼二苯并吡咯亚甲基的芳香体系，选用其衍生物（）作为深红色荧光团，并与荧光猝灭部分，二硝基苯氧基一起构建了两个荧光探针探针 和探针。探针 和探针 对硒代半胱氨酸具有高灵敏度和高选择性，可用于检测癌细胞和活细胞中外源性和内源性硒代半胱氨酸，其中探针 的灵敏度（检出限下限为 ）高于探针（检出限下限为 ）。等 首次报道了一种基于荧光共振能量转移的荧光探针，通过非共轭连接键将荧光染料荧光团（香豆素衍生物 结构）与萘酰亚胺荧光基团结合而成，并采用了具有较强的内电荷转移（）效应的，二硝基苯醚（）作为硒代半胱氨酸响应 基 团。在 硒 代 半 胱 氨 酸 宽 范 围 内（）定量检测硒代半胱氨酸，检出限为 。基于丙烯酸酯的加成反应丙烯酸酯是常见的 受体型检测基团和典型的 抑制剂，可以结合到暴露的酶表面和高活性的半胱氨酸（）或硒代半胱氨酸残基上来抑制酶活性。等 研制了第一种基于分子内电荷转移（）的比例型硒代半胱氨酸荧光探针（图式）。探针 是以羟基萘酰亚胺为荧光团，以丙烯酸酯为反应受体和吸电子基团。探针 与硒代半胱氨酸响应之后，丙烯酸酯基团和硒代半胱氨酸会发生 加成，酯基被硒代半胱氨酸的氨基裂解，通过内部环化形成酰胺，造成探针的荧光发射会发生明显的变化，形成了一个新的发射带，红移约 。在 的条件下，对硒代半胱氨酸检测下限为 ，具有较好的生物相容性，被成功用于活细胞中硒代半胱氨酸的成像研究。，（），化学世界综述与进展图式以丙烯酸酯，键和键作为硒代半胱氨酸识别基团的检测机制 等 为研究硒代半胱氨酸与甲状腺疾病之间的关系，设计并合成了一种比例型近红外荧光探针（图式），并被用于对细胞和小鼠甲状腺疾病模型中硒代半胱氨酸的含量波动进行分析。随着硒代半胱氨酸的加入，探针 会出现明显的荧光增强，并伴随着从绿色到蓝色的颜色变化，溶液反应迅速，内 即 可 达 到 检 测 平 台，检 出 限 低 至 ，而且在线粒体定位中具有较好的适用性。基于 的裂解反应苯并硒二唑具有抗癌作用，可用于检测硫醇，通过生物硫醇特异性探针模拟器显示得知苯并硒二唑探针可以用来检测硒代半胱氨酸。等 将苯并硒二唑检测基团与近红外半菁染料连接，合成了一种新的荧光探针，并被用于探测活细胞和活体细胞内的硒代半胱氨酸（图式）。探针 在 条件下，具有高度的选择性和敏感性，能够监测活体细胞和体内硒醇硒代半胱氨酸水平的变化，硒代半胱氨酸在 诱导的 细胞中 浓 度 逐渐 增 加，探针 的应用首 次揭示了 可快速转化为高活性硒代半胱氨酸，这是硒抗癌的机制之一。基于的硒解反应含有二硫键的检测基团是典型的 底物。硒代半胱氨酸可以选择性地与 键发生 的交换反应。等 基于 键交换反应，首次合成了一种比例荧光探针（图式）。在毫摩尔级浓度的硫醇干扰下，探针 可以快速识别硒代半胱氨酸。在硒代半胱氨酸浓度为 时，探针 可以和硒代半胱氨酸形成良好的线性关系，检出下限低至 ，已被用于准确定量原代小鼠肝细胞、正常人肝细胞和人肝癌细胞中硒 ，（），代半胱氨酸的浓度。总结和展望基于生物硫醇荧光探针的基础上，发现用于检测生物硫醇的识别基团大多数都可以用于检测硒代半胱氨酸，将检测硫醇的同类型检测基团用于检测硒醇时，检测速度更快、更灵敏。虽然大部分硒代半胱氨酸探针已经可以用于生物体系（血清、细胞、组织、活体）中硒代半胱氨酸的检测，但这些都是依靠外界环境的诱导，准确量化生物体系中硒代半胱氨酸的浓度还需要进一步的研究。在后续设计探针时，除了要考虑具有理想的光学性能，还要考虑可以用于活细胞和活体中外源性和内源性硒代半胱氨酸的实时追踪，这类探针最大的应用价值是可以检测正常细胞和病变细胞中硒代半胱氨酸的真实浓度，用于鉴定硒蛋白的生理功能以及疾病的早期诊断。期望可以进一步结合靶向基团，开发出可直接用于靶向特定细胞器和组织的荧光探针，可以用于直接测定特定位点中硒代半胱氨酸的真实浓度变化，为研究硒代半胱氨酸的抗氧化应激作用和硒代半胱氨酸协同作用相关疾病的诊断提供技术指导。参考文献 ，：，（）：邵建华氨基酸微肥的生产和应用研究进展现代化工，（）：，：，：？，（）：，：，（）：，？，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，：，（），：，（）：，（）：陈秋娟，谢微，苏辉兰等 紫外可见分光光度法测定里松温泉水中硒的含量 现代化工，（）：，：，（），化学世界综述与进展 ，（）：，（）：，（），：，（）：，：，（）：，：，：，：，（）：，（）：，（）：，（），（）：，（）：，（，），（）：，（）：，（）：，：，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（），（）：，：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（），