穿心莲内酯通过Nrf2_HO-1通路对脑出血大鼠血-脑脊液屏障的保护作用.pdf

基金项目:河北省医学科学研究课题项目(20201590)作者单位:056300邯郸,武安市第一人民医院通信作者:姜燕强,电子信箱:xtrmyywxg 穿心莲内酯通过 Nrf2/HO-1 通路对脑出血大鼠血-脑脊液屏障的保护作用姜燕强段国华陈利平李世岩赵华伟刘亚利刘英摘要目的探讨穿心莲内酯(andrographolide,AND)对脑出血大鼠血-脑脊液屏障(blood-brain barrier,BBB)的保护作用及机制。方法采用自体血注射法制备脑出血大鼠模型,分别 1 次/天灌胃给予 0.9%氯化钠溶液(模型组)、尼莫地平(NMP)10mg/kg 或 AND 低、中、高剂量(25、50、100mg/kg)进行治疗,疗程 7 天;另设假手术组。根据 mNSS 行神经功能缺失评分;测定脑血肿体积、脑含水量和 BBB 通透性;分光光度法检测氧化应激指标,ELISA 法检测炎性细胞因子水平,Western blot 法检测 Claudin-5、Occludin、ZO-1、Nrf2、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、核因子(nuclear factor,NF)-B、基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMP)9 表达。结果与假手术组比较,模型组神经功能缺失评分、脑血肿体积、含水量、BBB 通透性升高(P 0.01);丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和白细胞介素(interleukin,IL)-1、IL-6、肿瘤坏死因子(tumor necrosis facter,TNF)-水平升高,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)活性降低(P 0.01);Claudin-5、Occludin、ZO-1、Nrf2、HO-1 表达量降低而 NF-B、MMP9 表达量升高(P 0.01)。与模型组比较,AND 中、高组剂量和 NMP 组神经功能缺失评分、脑血肿体积、含水量、BBB 通透性降低(P 0.05 或 P 0.01);MDA 含量和 IL-1、IL-6、TNF-水平降低,SOD、CAT 活性升高(P 0.05 或 P 0.01);Claudin-5、Occludin、ZO-1、Nrf2、HO-1 表达量升高且 NF-B、MMP9 表达量降低(P 0.05 或 P 0.01);AND 高剂量组效果优于 NMP 组(P 0.05 或 P 0.01)。结论AND 对脑出血大鼠 BBB 结构和通透性具有保护作用,可能与激活 Nrf2/HO-1 通路,抑制氧化应激和炎性反应、下调 MMP9 表达有关。关键词穿心莲内酯脑出血血-脑脊液屏障氧化应激Nrf2/HO-1 通路中图分类号R285.5文献标识码ADOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2023.07.019Protective Effect of Andrographolide on the Blood-brain Barrier of Rats with Cerebral Hemorrhage through Nrf2/HO-1 Pathway.JIANG Yanqiang,DUAN Guohua,CHEN Liping,et al.Wuan First Peoples Hospital,Hebei 056300,ChinaAbstractObjectiveTo investigate the protective effect and mechanism of andrographolide(AND)on the blood-brain barrier(BBB)of rats with cerebral hemorrhage.MethodsThe model rats with cerebral hemorrhage were made by autogenous blood injection,which were treated with normal saline(model group),nimodipine(NMP)10mg/kg or AND low,medium,high dose(25,50,100mg/kg)by gavage once daily for 7d;and the sham group was set up.The neurological deficit was scored according to mNSS;the cerebral he-matoma volume,brain water content and BBB permeability were detected;the oxidative stress index of brain tissue was detected by spec-trophotometry,the level of inflammatory factors was detected by ELISA,the expression of Claudin-5,Occludin,ZO-1,Nrf2,HO-1,NF-B,MMP9 were detected by Western blot.ResultsCompared with the sham group,the neurological deficit score,cerebral hema-toma volume,brain water content,BBB permeability in model group were increased(P 0.01);the MDA content and IL-1,IL-6,TNF-level were increased,the SOD,CAT activity were decreased(P 0.01);the expression of Claudin-5,Occludin,ZO-1,Nrf2,HO-1 were decreased and the NF-B,MMP9 were increased(P 0.01).Compared with the model group,the neurologicaldeficit score,cerebral hematoma volume,brain water content,BBB permeability in AND medium,high dose group and NMP group weredecreased(P 0.05 or P 0.01);the MDA content and IL-1,IL-6,TNF-level were decreased,the SOD,CAT activity wereincreased(P 0.05 or P 0.01);the expression of Claudin-5,Occludin,ZO-1,Nrf2,HO-1 were increased and the NF-B,MMP9 were decreased(P 0.05 or P 0.01);the effect of AND high dose group was better than NMP group(P 0.05 or P 0.01).ConclusionAND has protective effect on structure and permeability of BBB in rats with cerebral hemorrhage;which may be related tothe activation of Nrf2/HO-1 pathway,inhibition of oxidative stress and inflammation,down-regulation of MMP9 expression.Key wordsAndrographolide;Cerebral hemorrhage;BBB;Oxidative stress;Nrf2/HO-1 pathway29论著J Med Res,July 2023,Vol.52 No.7脑出血约占脑卒中患者的 30%,具有起病急、进展快、致死率和致残率高的特点。血肿占位、颅内压升高等将导致脑出血后炎症、氧化应激损伤,破坏血-脑脊液屏障(blood-brain barrier,BBB)而引发血管源性脑水肿,是导致脑出血患者死亡和残疾的重要原因1 3。核因子 E2 相关因子 2/血红素加氧酶 1(nuclear factor E2 related factor 2/heme oxygenase 1,Nrf2/HO-1)通路参与机体炎症和氧化应激反应的调控4。穿心莲内酯(andrographolide,AND)是提取自穿心莲的一种倍半萜类化合物,有研究发现 AND通过激活 Nrf2/HO-1 通路抑制氧化应激和炎性反应对缺 血 性 心 肌 细 胞 和 肝 细 胞 损 伤 起 到 保 护 作用5,6。本研究旨在探讨 AND 对脑出血大鼠 BBB 及Nrf2/HO-1 通路的影响,现将研究结果报道如下。材料与方法1.材料:(1)动物:240 只清洁级 SD 大鼠(雄性、7 周龄、220 240g)购自河北省实验动物中心SCXK(冀)2018-004。分笼饲养 1 周后进行实验,饲养环境:25、相对湿度 60%70%、光照黑暗各 12h交替。本实验经武安市第一人民医院医学伦理学委员会 审 核 批 准(伦 理 学 审 批 号:WASYY-KY-2020-013)。(2)药品与试剂:AND 胶囊购自惠州市九惠制药股份有限公司;尼莫地平(nimodipine,NMP)胶囊购自海南普利制药股份有限公司;伊文思蓝购自国药集团化学试剂有限公司;白细胞介素(interleu-kin,IL)-1、IL-6、肿瘤坏死因子(tumor necrosisfactor,TNF)-试剂盒和丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)试剂盒购自北京索莱宝生物科 技有限公司;Claudin-5、Occludin、ZO-1、Nrf2、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、核因子(nuclear factor,NF)-B、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)9、-actin 抗 体 和IgG 二抗购自北京博奥森生物技术有限公司。2.分组、模型制备与给药:240 只大鼠随机取 40只作为假手术组,剩余 200 只参照文献7报道的自体血注射法制备脑出血大鼠模型:禁食、禁水 12h 后实施麻醉,经左侧股动脉取血后俯卧位固定于脑立体定位仪,沿正中切开头皮和骨膜、暴露前囱,在中线右旁 3.5mm 与前囱前 0.2mm 交汇处钻孔,通过微量注射器在脑基底节区(深度 6mm)10l/min 注射 50l自身股动脉血,无菌骨蜡封闭钻孔、缝合皮肤;造模完成后,随机分为模型组、NMP 组和 AND 低、中、高剂量组,每组 40 只。给药:NMP 组 1 次/天灌胃给予浓度2mg/ml 的 NMP 溶液 5ml/kg,AND 低、中、高剂量组分别 1 次/天灌胃给予浓度 5、10、20mg/ml 的 AND 溶液5ml/kg(根据人和大鼠药物剂量换算公式,分别为 1/2倍、1 倍、2 倍人临床剂量),假手术组和模型组 1 次/天灌胃给予 0.9%氯化钠溶液 5ml/kg,疗程 7 天8。3.神经功能缺失评分和脑血肿体积检测:各组随机取 8 只大鼠,根据 mNSS 进行神经功能缺失评分。麻醉后,颈椎脱臼处死、断头、取脑组织,4%多聚甲醛溶液固定 72h,通过高速冷冻切片机、以注射给药针孔为中心连续切片(厚度 0.5mm),检测血肿最大层面互为垂直的最大横径和最大纵径长度,然后根据多田公式计算脑血肿体积,血肿体积=(/6)最大横径(mm)最大纵径(mm)血肿层数 切片厚度(mm)。4.脑含水量的测定:各组随机另取 8 只大鼠,麻醉后颈椎脱臼处死、断头、取脑组织,0.9%氯化钠溶液冲 洗 并 拭 干,去 除 小 脑 和 脑 干 后 称 重 为 湿 重(W湿),100 烘干至恒重后称量为干重(W干),脑含水量(%)=(W湿-W干)/W湿 100%5.BBB 通透性测定:各组随机另取 8 只大鼠,尾静脉注射 2%的伊文思蓝溶液 4ml/kg,1h 后实施麻醉,开 胸 暴 露 心 脏,由 左 心 室-右 心 耳 通 路 灌 注300ml 0.9%氯化钠溶液,断头、取脑组织,取右侧半脑、研磨匀浆后加入 3 倍量甲酰胺溶液(浓度 50%),60 孵育 24h 后 3000r/min 离心 10min 取上清液,按照试剂盒说明检测伊文思蓝含量,伊文思蓝含量可反映 BBB 通透性。6.脑组织 MDA 含量,SOD、CAT 活性和 IL-1、IL-6、TNF-水平检测:取各组剩余的 8 只大鼠,麻醉后颈椎脱臼处死、断头、在冰上剥取脑组织,取右脑注射针孔周围脑组织,剪碎后加入 4 RIPA 裂解液在冰上静置 30min 使其 充分裂解,3500r/min 离心10min 取上清液,按照试剂盒说明,通过分光光度计检测 MDA 含量和 SOD、CAT 活性;通过酶标仪检测IL-1、IL-6、TNF-水平。7.蛋白免疫印迹法检测脑组织 Claudin-5、Oc-cludin、ZO-1、Nrf2、HO-1、NF-B、MMP9 表达:取脑组织裂解液,4、12000r/min 离心 15min 取上清液,BCA 法 测 定 蛋 白 浓 度,分 别 取 30g 蛋 白 行 SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白,转膜、封闭处理后滴加目标蛋白、-actin 抗体后 4 孵育过夜,洗膜后滴加 IgG室温孵育 1.5h,通过 ECL 显色,以目标蛋白与-actin条带灰度值的比值做为目标蛋白相对表达量。39医学研究杂志 2023 年 7 月第 52 卷第 7 期论著8.统计学方法:应用 SPSS 17.0 统计学软件对数据进行统计分析,符合正态分布的计量资料以均数 标准差(x s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用 LSD-t 检验,以 P 0.05 为差异有统计学意义。结果1.各组大鼠神经功能缺失评分、脑血肿体积、脑含水量、BBB 通透性比较:与假手术组比较,模型组神经功能缺失评分、脑含水量、伊文思蓝含量升高(P 0.01);与 模 型 组 比 较,AND 中、高 剂 量 组 和NMP 组神经功能缺失评分、脑血肿体积、脑含水量、伊文思蓝含量降低(P 0.05 或 P 0.01);与 NMP组比较,AND 高剂量组神经功能缺失评分、脑血肿体积、伊文思蓝含量降低(P 0.05 或 P 0.01,图 1)。图 1各组大鼠神经功能缺失评分、脑血肿体积、脑含水量、伊文思蓝含量比较(n=8)与假手术组比较,P 0.01;与 NMP 组比较,#P 0.05,#P 0.01;与模型组比较,P 0.05,P 0.01 2.各组大鼠脑组织 MDA 含量和 SOD、CAT 活性比较:与假手术组比较,模型组 MDA 含量升高,SOD、CAT 活性降低(P 0.01);与模型组比较,AND 中、高剂量组和 NMP 组 MDA 含量降低,SOD、CAT 活性升高(P 0.05 或 P 0.01);与 NMP 组比较,AND 高剂量组MDA 含量降低,SOD、CAT 活性升高(P 0.05,图 2)。图 2各组大鼠脑组织脑组织 MDA 含量和 SOD、CAT 活性比较(n=8)与假手术组比较,P 0.01;与 NMP 组比较,#P 0.05;与模型组比较,P 0.05,P 0.0149论著J Med Res,July 2023,Vol.52 No.7 3.各组大鼠脑组织 IL-1、IL-6、TNF-含量比较:与假手术组比较,模型组 IL-1、IL-6、TNF-含量升高(P 0.01);与模型组比较,AND 中、高剂量组和 NMP 组 IL-1、IL-6、TNF-含量降低(P 0.05 或 P 0.01);与 NMP 组比较,AND 高剂量组IL-1、IL-6、TNF-含量降低(P 0.05,图 3)。图 3各组大鼠脑组织 IL-1、IL-6、TNF-含量的比较(n=8)与假手术组比较,P 0.01;与 NMP 组比较,#P 0.05;与模型组比较,P 0.05,P 0.01 4.各组大鼠脑组织 Claudin-5、Occludin、ZO-1表达比较:与假手术组比较,模型组 Claudin-5、Oc-cludin、ZO-1 表达量降低(P 0.01);与模型组比较,AND 中、高剂量组和 NMP 组 Claudin-5、Occlu-din、ZO-1 表达量升高(P 0.05 或 P 0.01);与NMP 组比较,AND 高剂量组 Claudin-5、Occludin、ZO-1 表达量升高(P 0.05 或 P 0.01,图 4、图 5)。图 4各组大鼠脑组织 Claudin-5、Occludin、ZO-1 表达A.假手术组;B.模型组;C.AND 低剂量组;D.AND 中剂量组;E.AND 高剂量组;F.NMP 组图 5各组大鼠脑组织 Claudin-5、Occludin、ZO-1 表达量比较(n=8)与假手术组比较,P 0.01;与 NMP 组比较,#P 0.05,#P 0.01;与模型组比较,P 0.05,P 0.015.各组大鼠脑组织 Nrf2、HO-1、NF-B、MMP9表达比较:与假手术组比较,模型组 Nrf2、HO-1 表达量降低,NF-B、MMP9 表达量升高(P 0.01);与模型组比较,AND 中、高剂量组和 NMP 组 Nrf2、HO-1 表达量升高,NF-B、MMP9 表达量降低(P 0.05 或P 0.01);与 NMP 组比较,Nrf2、HO-1 表达量升高,NF-B、MMP9 表达量降低(P 0.05 或P 0.01,图6、图 7)。图 6各组大鼠脑组织 Nrf2、HO-1、NF-B、MMP9 表达A.假手术组;B.模型组;C.AND 低剂量组;D.AND 中剂量组;E.AND 高剂量组;F.NMP 组讨论Occludin 是构成 BBB 的细胞骨架蛋白,ZO-1蛋白为胞质附着蛋白,Occludin 和 ZO-1 相互作用形成 TJPs 的基础结构,邱珂等9研究发现,Occludin、ZO-1 缺失将导致 TJPs 结构受损。Claudin 家族蛋白是构成 BBB 的跨膜蛋白,有研究发现 Claudin-5表达量与 BBB 通透性密切相关10,11。脑出血后颅内高压和脑疝占位等将病理性刺激小胶质细胞活化,释放活性氧(ROS)并分泌炎性细胞因子,导致脑组织59医学研究杂志 2023 年 7 月第 52 卷第 7 期论著图 7各组大鼠脑组织 Nrf2、HO-1、NF-B、MMP9 表达量比较(n=8)与假手术组比较,P 0.01;与 NMP 组比较,#P 0.05,#P 0.01;与模型组比较,P 0.05,P 0.01炎症和氧化应激损伤12。ROS 大量生成导致抗氧化酶 SOD、CAT 被过度消耗,过剩的 ROS 将攻击细胞膜磷脂双分子层结构、诱导 Occludin 蛋白降解,破坏TJPs 结构而使 BBB 通透性升高13。Dohgu 等14和赵军苍等15研究发现 IL-1、IL-6、TNF-等炎性细胞因子能够破坏 TJPs 结构并诱导内皮细胞黏附分子表达,导致 BBB 通透性升高。本研究发现,经AND 或 NMP 治疗能够明显降低脑出血大鼠神经功能缺失评分、脑含水量、脑血肿体积和 BBB 通透性,上调 Claudin-5、Occludin、ZO-1 表达,降低 MDA、IL-1、IL-6、TNF-含量并提高 SOD、CAT 活性,AND 高剂量组作用优于 NMP 组,提示 AND 对 BBB结构和通透性具有保护作用,其机制可能与抑制氧化应激和炎性反应有关。Nrf2 核转 位 后 能 够 诱 导 抗 氧 化 酶 表 达,提 高ROS 清除能力而降低氧化应激损伤。HO-1 为 Nrf2靶基因,能够诱导 ROS 还原清除。NF-B 能够诱导炎性细胞因子表达,进而介导炎性反应,Dang 等16研究发现,HO-1 能够抑制 NF-B 活化,从而间接抑制炎性反应。MMP9 能够降解 BBB 基膜,顾双双等17研究发现,MMP9 表达量升高能够促进 BBB 通透性的增高。Qin 等18研究发现,MMP9 表达受 NF-B 调控。本研究发现,经 AND 或 NMP 治疗能够显著上调 Nrf2、HO-1 表达并下调 NF-B、MMP9 表达。综上所述,AND 对脑出血大鼠 BBB 结构和通透性具有保护作用,其机制可能与激活 Nrf2/HO-1 通路、抑制氧化应激和炎性反应、下调 MMP9 表达有关。参考文献1 顾云鹤,张默峤,王宏达,等.MMP-9 抑制剂对大鼠脑出血模型脑水肿程度的影响及其对血脑屏障的作用J.中国实验诊断学,2018,22(12):2157-21612 Castro P,Azevedo E,Serrador J,et al.Hemorrhagic 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