C646靶向KAT3b通过Survivin乙酰化调控食管癌侵袭和迁移.pdf

基金项目:河北省医学科学研究重点课题计划项目(20210985)作者单位:067000承德医学院附属医院胸外科(郑竞雄、孙光蕊、邢磊、白宇航、梁宗英);050000石家庄,河北省胸科医院临床实验室(杨阳)通信作者:梁宗英,电子信箱:liangzy0318 C646 靶向 KAT3b 通过 Survivin 乙酰化调控食管癌侵袭和迁移郑竞雄杨阳孙光蕊邢磊白宇航梁宗英摘要目的探讨乙酰基转移酶抑制剂 C646 靶向 KAT3b 通过 Survivin 蛋白乙酰化影响食管癌细胞上皮间质转化(epi-thelial mesenchymal transformation,EMT)、迁移和侵袭的机制。方法体外培养食管癌 TE-1 细胞,MTT 法筛选 C646 最佳给药浓度;C646 处理 TE-1 细胞为实验组(C646 组),DMSO 处理 TE-1 细胞为对照组(DMSO 组);实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测 KAT3b mRN 表达量;免疫共沉淀法检测 Survivin 蛋白乙酰化;Westernblot 法检测 KAT3b 及 EMT 相关蛋白表达;MTT 法检测细胞存活能力,细胞划痕实验观察迁移能力,Transwell 实验检测侵袭能力。结果C646 组中 KAT3b mRNA 和蛋白表达量下降,且 Survivin 蛋白乙酰化水平下降;C646 组中 E-cadherin 蛋白表达上调,而N-cadherin、Snail 和 Slug 蛋白表达下降。C646 组中食管癌 TE-1 细胞存活、迁移和侵袭能力显著下降。结论C646 可能通过下调 KAT3b 的表达降低 Survivin 蛋白乙酰化水平,进而抑制食管癌细胞 EMT、存活及迁移侵袭能力。关键词乙酰基转移酶抑制剂C646KAT3bSurvivin乙酰化修饰中图分类号R735文献标识码ADOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2023.07.017Acetyltransferase Inhibitor C646 Targets KAT3b Via Survivin Acetylation to Regulate Epithelial Mesenchymal Transformation,Invasion andMigration in Esophageal Cancer.ZHENG Jingxiong,YANG Yang,SUN Guangrui,et al.Department of Thoracic Surgery,The AffiliatedHospital of Chengde Medical College,Hebei 067000,ChinaAbstractObjectiveTo investigate the mechanism of acetyltransferase inhibitor C646 targets KAT3b in regulating the epithelialmesenchymal transformation(EMT),migration and invasion via acetylation of Survivin protein in esophageal cancer.MethodsTE-1cells of esophageal cancer were cultured in vitro,MTT method was used to screen the optimal administration concentration of C646;TE-1 cells treated with C646 were the experimental group(C646group),and TE-1 cells treated with DMSO were the control group(DMSOgroup);The expression of KAT3b mRNA was measured by real-time quantitative polymerase chain reaction(RT-qPCR);Co-IPmeasured Survivin protein acetylation;the expression of KAT3b and EMT-related proteins was determined by Western blot;Cell survivalability was measured by MTT,migration ability was observed by scratch,invasion ability was observed by Transwell.ResultsTheKAT3b mRNA and protein expression levels decreased,and the Survivin protein acetylation levels decreased in the C646group.The ex-pression of E-cadherin protein was up-regulated in the C646group,while the N-cadherin,Snail,and Slug proteins were decreased.The survival,migration,and invasion ability of esophageal cancer TE-1 cell were significantly decreased in the C646group.ConclusionC646 may reduce the acetylation level of Survivin protein by down-regulating KAT3b expression,and subsequently inhibit the EMT,sur-vival,migration and invasion ability of oesophageal cancer cells.Key wordsAcetylyltransferase inhibitor;C646;KAT3b;Survivin;Acetylation modification食管癌是最具侵袭性的胃肠道癌症之一,极大危害了我国人民的身体健康1。虽然手术切除、化疗及放疗等治疗手段在一定程度上改善了食管癌患者的预后,但其总体生存率和生活质量仍较差2。Sur-vivin 是一种进化保守的真核生物蛋白,对细胞分裂至关重要,可抑制细胞死亡3。正常情况下,它只在增殖活跃的细胞中表达,但在大多数肿瘤中表达上调,参与肿瘤的增殖、凋亡、侵袭及转移4,5。前期研究显示,在食管癌组织及转移淋巴结中 Survivin 呈高表达并发生了乙酰化,且其高乙酰化水平与食管癌分期、组织分化及淋巴结转移相关6。表观遗传学中的乙酰化修饰是蛋白质转录翻译后主要修饰方式之一,乙酰化修饰和其他修饰之间的交叉调节对基因的28论著J Med Res,July 2023,Vol.52 No.7转录控制至关重要7。蛋白质乙酰化修饰需要乙酰基转移酶的参与完成,KAT3b 作为一种经典乙酰基转移酶可以通过调控蛋白质乙酰化修饰参与肿瘤的发生和转移,但其在食管癌中相关蛋白乙酰化修饰中的作用尚无研究报道8。本研究观察乙酰基转移酶抑制剂 C646 对食管癌细胞内乙酰基转移酶 KAT3b、Survivin 蛋白乙酰化水平的影响,探讨 KAT3b 与 Sur-vivin 乙酰化可能存在的内在联系以及在食管癌发生和发展中的可能作用机制。资料与方法1.细胞和试剂:人食管癌 TE-1 细胞购自上海宾穗生物科技有限公司;FK12 培养基、胎牛血清等购自郑州九龙生物制品有限公司;SDS-PAGE 试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒及 MTT 试剂盒等购自北京百奥莱博科技有限公司;KAT3b 和 Survivin 等抗体购自艾美捷科技有限公司;乙酰基转移酶抑制剂 C646 购自斯百全化学(上海)有限公司。2.细胞培养和分组:冻存细胞水浴速溶,F12K 培养基混匀,离心;弃上清,培养基混匀后转入培养瓶;细胞孵箱常规培养,将细胞培养至对数生长期后进行实验。C646 处理 TE-1 细胞为实验组(C646 组),有机溶 剂 DMSO 处 理 TE-1 细 胞 为 对 照 组(DMSO组)。3.实验方法:(1)实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)实验:提取 300ng RNA,应用 RNA 反转录试剂盒反转录为互补 DNA。应用 SYBR Green qPCRMaster 荧光定量试剂盒检测 mRNA 的表达;PCR 的反应条件:94 预变性 4min;94 变性 30s;55 退火30s;72 延伸 45s(30 个循环)。溶解曲线参照仪器自动程序。使用 U6 和 GAPDH 作为内参,相对表达量以 2-Ct计算。(2)Western blot 法检测:提取蛋白并测定总蛋白浓度;制备电泳蛋白上样液,行凝胶电泳。电泳后,转膜。加一抗 4 过夜。次日孵育二抗,重复洗膜后显影。(3)免疫共沉淀实验:提取细胞总蛋白,测定浓度。加入目的蛋白纯抗体 5l 和A/G 琼脂糖珠 5ml,混匀后 2 裂解缓冲液补充至总体积 450l,离心后,取上清液 400l 置入离心管,4,15r/min,共沉淀 12h。4 离心,弃上清液。1 裂解缓冲液 500l 洗涤 A/G 琼脂糖珠。离心 3min,弃上清液。重复洗涤 3 次;最后一次洗涤完毕后,弃去上清液。1 裂解缓冲液 35l 和等体积的2 SDS上样缓冲液混合,煮沸后离心;下一步行 Western blot法。(4)MTT 实验:单细胞悬液计数后,以每孔 8 103个细胞接种于 96 孔板。常规培养至每孔细胞密度达到 80%进行转染。12、24、48、72h 后,每个时间点拿出一块板,每孔加入 5mg/ml MTT 液 30l,继续常规孵育 4h。离心,弃上清。每孔加入二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)150l,80r/min 水平摇床摇匀 5 10min。酶标仪检测每孔的 570nm 的吸光度(A)值。(5)细胞划痕实验:收集各组细胞并配成单细胞悬液;以每孔 8 103个细胞接种到 96 孔板。每孔 100l,共 3 组。常规培养,待细胞铺满孔底后无菌移液枪头垂直板面划痕。每孔加入 2ml 无血清的培养基继续培养 48h,在倒置显微镜下测量划痕的宽度。细胞迁移率(%)=(测量时划痕宽度/初始划痕宽度)100%。(6)Transwell 实验:取转染后铺满孔底的 3 组细胞,用 0.25%不含 EDTA 的胰蛋白酶消化为单细胞悬液,收集后计数细胞。Matrigel 胶提前融化为液态状态备用。50mg/L Matrigel 1 8稀释液包被Transwell 小室底部 8m 孔径的聚碳酸脂微孔滤膜,37 过夜聚合成胶。小室经过紫外线灭菌 2h,抽去残余的 Matrigel 胶液,用无血清的 F12 培养液在 37条件下湿化 1h。将 Transwell 小室按顺序放入 24 孔板,无菌镊子取出小室,室外加入含 15%血清 F12 培养基 600l。小室内加入 200l 细胞悬液(细胞数为2 104个),培养液为不含血清的 F12 培养基,每组细胞重复 6 个样本。24 孔板放入 CO2孵育箱内常规培养 48h。取出小室,磷酸盐缓冲液(phosphate buff-ered saline,PBS)淋洗,擦去微孔膜内层细胞。多聚甲醛固定后结晶紫染色。显微镜下拍照计数。4.统计学方法:应用 SPSS 21.0 统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数 标准差(x s)表示,两组间比较采用配对样本 t 检验,计数资料组间比较采用 2检验,以 P 0.05 为差异有统计学意义。结果1.C646 可浓度依赖性抑制食管癌 TE-1 细胞的活力:MTT 法检测结果表明,C646 可浓度依赖性抑制食管癌 TE-1 细胞增殖活力,差异有统计学意义(P 0.05);经计算其半抑制浓度 IC50=1.042mol/L。确定 1.0mol/L 为 C646 的最佳给药浓度(图 1)。2.C646 抑制 KAT3b mRNA 和蛋白表达:RT-qPCR 检测结果表明,C646 组 KAT3b mRNA 相对表达量为 0.24 0.03,DMSO 组为 1.37 0.04,C646 组KAT3b mRNA 相对表达量显著降低,差异有统计学38医学研究杂志 2023 年 7 月第 52 卷第 7 期论著图 1MTT 法检测 C646 对食管癌 TE-1 细胞活力的影响与 0mol/L 组比较,P 0.05,P 0.01意义(P 0.05,图 2)。Western blot 法检测结果显示,C646 组中 KAT3b 蛋白表达量明显降低,两组比较,差异有统计学意义(P 0.05,图 3)。图 2C646 对食管癌细胞 KAT3b mRNA 表达量的影响与 DMSO 组比较,P 0.05图 3C646 对食管癌细胞 KAT3b 蛋白表达量的影响3.C646 降低 Survivin 蛋白乙酰化水平:免疫共沉淀法和 Western blot 法检测结果显示,C646 组 KAT3b蛋白表达下降,且 Survivin 蛋白乙酰化水平显著降低。与 DMSO 组比较,差异有统计学意义(P 0.05,图 4)。图 4C646 对食管癌细胞 Survivin 蛋白乙酰化水平的影响4.C646 抑制食管癌 TE-1 细胞的 EMT:Westernblot 法检测结果显示,与 DMSO 组比较,C646 可显著上调 TE-1 细胞中上皮细胞标志蛋白 E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达,下调间质细胞标志蛋白 N-钙黏蛋白(N-cadherin)以及 EMT 相关转录调控因子 Snail 和 Slug 的表达,两组间比较差异有统计学意义(图 5)。图 5C646 对食管癌细胞内 EMT 相关蛋白表达的影响5.C646 抑制食管癌 TE-1 细胞的存活能力:MTT 法检测结果显示,C646 组中 TE-1 细胞的吸光度值显著降低,抑制了 TE-1 细胞的存活能力,两组间比较差异有统计学意义(P 0.05,图 6)。图 6C646 对食管细胞存活能力的影响与 DMSO 组比较,P 0.056.C646 抑制食管癌 TE-1 细胞的迁移能力:细胞划痕实验结果显示,C646 组的划痕愈合缓慢,距离近轻度缩短,抑制了 TE-1 细胞的迁移能力,两组间比较差异有统计学意义(P 0.05,图 7)。7.C646 抑制食管癌 TE-1 侵袭能力:Transwell实验结果显示,C646 组穿膜细胞数显著减少,抑制了TE-1 细胞的侵袭能力,两组间比较差异有统计学意义(P 0.05,图 8)。讨论食管癌整体预后较差,5 年生存率仅为 20%35%,尽管手术和放化疗方案优化方面取得了进步,但总体获益甚少9。肿瘤的高侵袭转移性是导致患48论著J Med Res,July 2023,Vol.52 No.7图 7C646 对食管癌 TE-1 细胞迁移能力的影响图 8C646 对食管癌 TE-1 细胞侵袭能力的影响结晶紫染色,400。A.C646;B.DMSO者高病死率的主要原因,其中癌基因活化与抑癌基因失活是导致肿瘤在临床治疗中失败的关键因素10。因此,有效抑制癌细胞的存活能力,预防食管癌的侵袭和转移是提升其术后远期生存率的重要方法之一。Survivin 是一种抗凋亡基因,其表达的蛋白是多种恶性肿瘤中的独特分子标志物11。Survivin 的过表达可以抑制肿瘤细胞的凋亡,促进其增殖分化和血管生成12。研究发现,Survivin 可以抑制骨肉瘤和脑膜瘤细胞的凋亡,导致其异常增殖,且 Survivin 与两者侵袭、耐药和复发相关13,14。乙酰化是表观遗传学中较常见的一种蛋白修饰方式,参与多种肿瘤的发生和发展。既往研究多关注于组蛋白的乙酰化修饰在肿瘤中的作用机制,而近年来研究发现,多种非组蛋白也可以发生乙酰化修饰,且与肿瘤的发生和发展密切相关15,16。研究发现,Survivin 在食管癌组织中发生了乙酰化修饰,且其乙酰化与食管癌分期、分化及淋巴结转移相关,然而,Survivin 乙酰化修饰促进食管癌发生和发展的具体机制仍不清楚17。通过体外实验进一步证实食管癌细胞内 Survivin 呈高乙酰化状态,说明 Survivin 作为一种非组蛋白同样可以发生乙酰化修饰,而且其可能参与了食管癌的增殖、侵袭和转移,这与前期研究结果一致18。乙酰基转移酶参与蛋白质的乙酰化修饰,且在肿瘤的发生和发展过程中起到了至关重要的作用19。KAT3b 属于乙酰转移酶 P300/CBP 家族中的代表性成员,可以催化多种组蛋白和非组蛋白发生乙酰化,同时自身也参与并调控细胞周期、自噬及多种肿瘤的发生及转移20。研究发现,KAT3b 在肾癌组织中呈高表达,且下调其表达可以促进肾癌 786-O 细胞的凋亡,抑制细胞的增殖、侵袭和迁移21。前期研究表明,KAT3b 在食管癌组织中呈高表达,且其阳性表达与食管癌的分期、分化及淋巴结转移相关17。这提示 KAT3b 可能通过自身功能或者靶向调控其他基因的途径,促进了食管癌发生和发展。食管组织中 Survivin 蛋白发生乙酰化同样需要乙酰基转移酶的参与,但催化其发生乙酰化的乙酰基转移酶尚未明确。既往研究证实,抑制乙酰基转移酶的表达可以使肿瘤细胞内乙酰化蛋白的乙酰化状态发生改变,进而改变肿瘤的生物学行为22。理论上,抑制乙酰基转移酶的表达会改变食管癌组织中 Sur-vivin 蛋白乙酰化修饰状态,进而改变食管癌的生物学行为。在沉默或下调乙酰基转移酶促进相关蛋白发生去乙酰化作用机制中,沉默 KAT3b 有可能发挥更高的去乙酰化的作用,但在食管癌中,KAT3b 作为乙酰基转移酶是否参与 Survivin 乙酰化修饰的关系尚不明确。C646 作为一种乙酰基转移酶抑制剂,可以特异性抑制乙酰基转移酶 KAT3b,也可以显著降低组蛋白 H3 和 H4 乙酰化水平,且可抑制曲古霉素 A 诱导的蛋白乙酰化。本研究以食管癌 TE-1 细胞为研究对象,应用 C646 对食管癌细胞进行处置,通过 MTT法检测证实,C646 可呈浓度依赖性地抑制食管癌TE-1细胞增殖活力。乙酰基转移酶抑制剂在体内可以抑制多种乙酰基转移酶的活性,但其往往具有针对性的主要抑制一种乙酰基转移酶的活性和表达。通过 RT-qPCR 和 Western blot 法检测了 C646 处置后的食管癌 TE-1 细胞内乙酰基转移酶 KAT3b 的表达情况,结果显示,C646 可以显著抑制 KAT3b mRNA和蛋白的表达。这说明 C646 可以有针对性地抑制KAT3b 的活性和表达,是 KAT3b 的特异性抑制剂。进一步检测 Survivin 乙酰化水平,结果显示,KAT3b表达下调后,食管癌细胞内 Survivin 乙酰化明显降低,提示 KAT3b 作为乙酰基转移酶参与了 Survivin 的乙酰化修饰,可能是调控 Survivin 进而改变食管癌生物学功能的一个重要上游分子。58医学研究杂志 2023 年 7 月第 52 卷第 7 期论著上皮间质转化(epithelial mesenchymal transforma-tion,EMT)是促进肿瘤侵袭转移的重要机制,肿瘤细胞逐渐失去细胞极性和黏附力继而获得间质细胞的高迁移能力,进而加速肿瘤的侵袭转移,是多种恶性肿瘤侵袭转移的早期标志物23。EMT 在肿瘤侵袭和迁移过程中起到关键作用的基因分子主要包括 E-cadherin、N-cadherin、Snail 和 Slug 蛋白表达,也是预测肿瘤侵袭和转移的重要标志物24。EMT 标志蛋白及相关转录调控因子如 Snail、Slug 等表达及其功能受蛋白翻译后修饰如乙酰化、磷酸化和泛素化等调控,继而介导 肿瘤的发生、发 展25。本 研 究 证 实,C646 干预后的食管癌细胞中 E-cadherin 的表达上调,而 N-cadherin 及 Snail 和 Slug 蛋白表达下降。此外,采用细胞功能学实验进一步证实 C646 抑制了食管癌细胞的存活、迁移和侵袭能力。以上研究结果表明,C646 干预食管癌 TE-1 细胞后抑制了乙酰基转移酶 KAT3b 的活性,使其催化的 Survivin 蛋白发生去乙酰化进而调控了 EMT 标志蛋白及相关转录因子的表达,进而抑制了食管癌 TE-1 细胞的存活、侵袭和迁移能力。综上所述,乙酰基转移酶抑制剂 C646 可通过下调乙酰基转移酶 KAT3b 靶向调控 Survivin 蛋白乙酰化修饰,进一步通过调控 EMT 过程中起到关键作用的因子,进而抑制食管癌的增殖、侵袭和迁移能力,为食管癌的临床治疗提供了新方法。参考文献1 Watanabe M,Otake R,Kozuki R,et al.Recent progress 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