DNA 异常甲基化在口腔鳞癌中的研究进展.pdf

医学分子生物学杂志,2023,20(5):455-461 J Med Mol Biol,2023,20(5):455-461DOI:10.3870/j.issn.1672-8009.2023.05.013综 述资助项目:苏州大学附属第一医院口腔科临床试验机构能力提升项目(No.SLT202009)通讯作者:肖灿(电话:[phone],E-mail:)This work was supported by a grant from the Suzhou University AffiliatedFirst Hospital Stomatology Clinical Trial Institution Capacity ImprovementProject(No.SLT202009)Corresponding author:XIAO Can(Tel:[phone],E-mail:canxi-)DNA 异常甲基化在口腔鳞癌中的研究进展许益敏1,3,崔丹2,3,卢志远1,3,卢杨1,3,周梦缘1,3,肖灿1,31苏州大学附属第一医院口腔科 江苏省苏州市,2150002苏州市华夏口腔医院口腔科 江苏省苏州市,2150003苏州大学医学院 江苏省苏州市,215000【摘要】口腔鳞癌是一种常见的头颈部恶性肿瘤,其发生和发展与基因的异常表达有关。DNA 异常甲基化是一种影响基因表达的机制,已经被证实在口腔鳞癌的发生和发展中起着重要作用。综述主要对 DNA 甲基化在口腔鳞癌中的研究进展及检测技术手段进行阐述,包括样本的类型、与口腔鳞癌相关的基因甲基化水平、生物学功能及其在肿瘤进展中的临床解读。未来的研究将继续深入探究 DNA 异常甲基化与口腔鳞癌的发生、发展、治疗和预后之间的关系,有助于寻找更有效的治疗策略和预后评估方法。【关键词】DNA 甲基化;口腔鳞癌;诊断;发生发展和预后【中图分类号】R782Advances in Research on Aberrant DNA Methylation in Oral Squa-mous Cell CarcinomaXU Yimin1,3,CUI Dan2,3,LU Zhiyuan1,3,LU Yang1,3,ZHOU Mengyuan1,3,XIAO Can1,31Department ofStomatology,SuzhouUnivercityAffiliatedFirstHospital,Suzhou,Jiangsu,215000,China2Department of Stomatology,Suzhou Huaxia Stomatological Hospital,Suzhou,Jiangsu,215000,China3School of Medicine,Suzhou Univercity,Suzhou,Jiangsu,215000,China【Abstract】Oral squamous cell carcinoma(OSCC)is a common malignant tumor of head andneck,whose development is related to the abnormal gene expression.Aberrant DNA methylation is amechanism that affects gene expression and has been proven to play an important role in OSCC initi-ation and development.This review mainly discusses the research progress and detection techniquesof DNA methylation in OSCC,including sample types,methylation levels of genes related to OS-CC,their biological functions and clinical interpretations in tumor progression.The future researchwill continue to explore the relationship between abnormal DNA methylation and OSCC initiation,development,treatment and prognosis,in order to find more effective treatment strategies and prog-nosis assessment methods.【Key words】DNA methylation;oral squamous cell carcinoma;diagnosis;tumor develop-ment;prognosis 口腔癌是头颈颌面部常见的恶性肿瘤,在全身常见恶性肿瘤中居第六位,其中鳞状细胞癌是最为常见类型,约占口腔癌中的90%1-3。口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)可发生于唇、颊粘膜、口底、牙槽嵴和牙龈、舌前三分之二、硬腭和磨牙后三角处,是来源于口腔上皮组织的恶性肿瘤。据最新数据统计显示,2020 年全球口腔癌发病人数约 26.4 万例,死亡案例约 12.5万例,5 年死亡率高达 50%4。尽管治疗方式在不断改进提升,口腔鳞癌的死亡率仍未能大幅降低,因此,为了更准确有效的诊断及治疗,就必须要深入了解 OSCC 的发病机制。近几十年的研究发现,恶性肿瘤相关基因的激活或失活,并不一定要通过 DNA 序列改变,表观遗传调控失常亦可致癌5。DNA 甲基化作为表观遗传学中的一个研究热点,可以成为我们研究 OS-CC 发病机制的切入点,本文将对该热点在口腔鳞癌中的研究进展作一综述。1 DNA 甲基化的表观遗传修饰恶性肿瘤的发生过程极为复杂,目前普遍认为其发生可以归因于基因和环境的共同调控。表观遗传是在 DNA 序列不变的前提下发生可遗传的基因表达或表型的改变,比基因突变更频繁6。DNA甲基化是表观遗传学现象中最为常见且重要的机制之一,也是近期研究热点之一。其在正常生理过程中承担着调节基因表达、维持基因组稳定性等重要功能。DNA 甲基化异常会引起基因表达的过度或不足,影响细胞功能和信号通路,导致如癌症、心血管疾病、神经系统疾病等的发生发展。DNA 甲基化是 DNA 分子上的碱基被添加了甲基的过程,即 S-腺苷甲硫氨酸上的甲基在 DNA 甲基转移酶 DNMT 的催化作用下转移至 DNA 分子的胞嘧啶或腺嘌呤上7(图 1),其中双核苷酸序列中富含 C-G 对的区域被称为 CpG 岛,通常处于非甲基化状态,在转录调控中起重要作用。DNA 甲基化有不同的修饰形式,如 5-甲基胞嘧啶(5-mC)、5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)、N6-甲基腺嘌呤(6mA)等,真核生物中最常见且研究最充分的碱基甲基化是 5-mC8-9。大量研究显示,恶性肿瘤的发生发展中多可见 DNA 甲基化的身影,主要表现为 肿瘤细胞呈现全基因组的低甲基化;特定基因(抑癌基因等)CpG 岛的高甲基化10。全基因组的低甲基化一般是通过减少 5-mC 来增加染色体的不稳定性,尤其是在基因的编码区域13。而肿瘤特异性基因启动子 CpG 岛的超甲基化会直接导致基因失活影响肿瘤进展,尤其是在抑癌基因上发生,可导致组织细胞增殖分化异常,进而影响肿瘤的发生发展及预后14。同时,当 CpG岛发生低甲基化时,之前沉默的原癌基因可能会被激活。这些情况在包括头颈癌的各类肿瘤中均有被发现15。图 1 位点特异性 DNA 甲基化示意图11-12甲基化在肿瘤的发生发展中具有异质性16。肿瘤中 CpG 岛的高甲基化非常常见,但实际上全基因组低甲基化才是肿瘤恶性发展的趋势17。高甲基化和低甲基化致癌的作用机制并不一致,在肿瘤发展中所具有的模式、功能也不同。高甲基化可以阻止转录因子与基因启动子结合,影响基因的转录和表达,导致基因沉默或失活。此外 DNA 高甲基化还影响 DNA 修复机制,影响 DNA 修复酶正确识别甲基化位点从而导致 DNA 损伤累积。DNA 低甲基化在基因组的全局或局部水平均可发生。全局低甲基化会导致基因组不稳定性增加,癌症风险增加。局部低甲基化则与某些特定的肿瘤相关基因的表达改变有关。此外低甲基化还可能影响癌症相关的 DNA 甲基转移酶表达,引起更多的 DNA 低甲基化事件的发生18-19。目前高甲基化和低甲基化在癌症进展中如何共同作用的机制尚无明确的定论,因此我们需要对 DNA 异常甲基化进行定量分析,或可为癌症的早期预警及治疗提供重要依据。2 DNA 甲基化的检测DNA 甲基化检测中,样本的类型和来源非常重要。样本中 DNA 的质量和纯度会直接影响到检测的结果。一般来说,DNA 甲基化检测样本类型包括固体组织、血液、唾液、尿液、粪便等,其中固体组织样本最为常见。OSCC 中 DNA 甲基化的研究多集中在肿瘤早期诊断和恶性转化指标上20,通常涉及到的样本类型主要包括固体组织(多集中于健康黏膜、癌旁及肿瘤组织)、血液及唾液。DNA 甲基化检测的方法有很多种,主要是区分 DNA 序列中的 C 和 5-mC 碱基。根据目的的不同可以分为全基因组和特定 CpG 位点的 DNA 甲基化水平测量21。根据技术类型又分为基于甲基化654许益敏,等.DNA 异常甲基化在口腔鳞癌中的研究进展敏感限制性内切酶的测量、基于亚硫酸氢盐的测量和基于亲和富集方法的测量,具体归纳见表 122。其中,全基因组重亚硫酸氢盐甲基化测序(wholegenome bisufite sequencing,WGBS)是目前 DNA 甲基化检测方法的金标准。该技术利用高通量测序技术对 DNA 甲基化位点进行全基因组或全外显子组的测序分析,能够全面、高精度地检测 DNA 甲基化状态。从整体来看,限制性内切酶的测量对检测样本的纯度、完整性具有较高的要求且主要通过比较酶切片段长度的差异来分析,更适用于检测 CpG密度较低的 DNA 序列;基于亲和富集的甲基化检测方法对 DNA 质量要求相对较低,但对 DNA 起始含量的要求较高,更适合 CpG 密度较高的序列;基于亚硫酸氢盐(Bs)转换的检测方法对样本纯度和完整性的要求较前两类方法略低,检测石蜡包埋的 DNA 样本通常会采用此法。针对低浓度、甲基化水平较低的样本,也会采用 Bs 转换结合 PCR扩增的策略提升检测的灵敏度23。表 1 常见 DNA 甲基化检测技术的对比技术类型测序方法覆盖范围分析类型灵敏性特异性基于甲基化敏感限制 性内切酶的测量限制性内切酶的测序法特定位点定性高强基于亚硫酸氢盐的测 量全基因组重亚硫酸氢盐测序(金标准)甲基化特异性 PCR变性高效液相色谱质谱检测甲基化敏感熔解曲线分析焦磷酸测序甲基化芯片测序CpG 岛或全基因组特定位点全基因组全基因组DNA 片段整体特定位点全面覆盖CpG 岛、启动子定量定性,数字 PCR绝对定量定性定量定性定量定量高强高强低中超高强高强高中高强基于亲和富集方法 的测量甲基结合结构域捕获测序约 80%的 CpGs定量高强纳米孔测序CpG 岛定量高强单分子实时合成测序CpG 岛定量高强3 OSCC 中的 DNA 异常甲基化3.1 DNA 异常甲基化与 OSCC 发生发展中的危险因素OSCC 的发生受内外多因素的调控,其中烟酒、槟榔是主要的发病危险因素24。Guerrero 和Baba 等25-27发现,烟草的使用与全基因组的低甲基化、抑癌基因启动子高甲基化有关,Supic 等33则发现 OSCC 相关的基因 CpG 岛高甲基化与长期摄入酒精有关。同时有研究认为吸烟和酒精之所以导致全基因组低甲基化,是因为它与维生素 B12水平较低有关,维生素 B12是 S-腺苷甲硫氨酸合成的重要来源26。而维生素 B12又主要是从日常食物中摄取而来,因此,我们合理怀疑,节食可能是影响甲基化机制的另一个因素。除此之外,慢性炎症28、人类乳头瘤病毒(HPV)持续感染和遗传易感性等因素也可能会导致广泛的遗传和表观遗传改变进而致癌,这其中就包括 DNA 异常甲基化29。Foy 等11的研究表明,启动子区 CpG 岛的甲基化表型差异化可能是 OSCC 发展的早期事件。为了深入探究 OSCC 的发病机制,研究人员对 OSCC患者和正常人的基因组 DNA 进行了测序和甲基化检测。结果发现,OSCC 患者在某些关键区域存在显著的 DNA 甲基化差异,这些差异进一步影响相关基因的表达,并最终导致细胞功能改变。此外,该研究也阐述了环境因素和个体遗传因素会影响颌面部的甲基化模式,进一步增加 OSCC 的发病风险。因此,对 OSCC 发展早期事件的深入了解,或能为预防、诊断和治疗提供新思路。3.2 OSCC 中的 DNA 高甲基化目前 DNA 甲基化与 OSCC 发生发展的显著相关性尚无充分及决定性实验可以证明,但已有文献报道 40 多个肿瘤抑制基因的高甲基化在口腔鳞癌发生发展中有一定的影响30。根据基因名称、样本类型、生物学功能及临床解读将这些基因进行整理,结果见表 2。3.3 OSCC 中的 DNA 低甲基化非特异性基因或全基因组低甲基化在口腔鳞癌中的研究较少,本部分对检索到的文献归纳整理,结果见表 3。754医学分子生物学杂志,2023,20(5):455-461 J Med Mol Biol,2023,20(5):455-461表 2 口腔鳞癌中 DNA 高甲基化基因及其生物学功能基因生物学功能临床解读样本类型ABO31血型抗原肿瘤进展口腔鳞癌APC32细胞增殖肿瘤进展固体组织ATM32细胞增殖,DNA 修复预后差(手术切除)CDKN2A33调节细胞周期,衰老肿瘤发生,侵袭CDKN2B33调节细胞周期复发CDH134细胞间粘附肿瘤进展,侵袭CHFR35,p15INK4B45调节细胞周期肿瘤进展CRABP233,MED1533,PAX633,SOX1753,GATA541调节转录预后差DKK336调节转录转移,预后差CYGB33编码球蛋白/ERCC133DNA 修复预后差E-cadherin37信号转导转移EYA438,LHX633,HOXB444,SFRP1-2-4-552,SOX754调节转录肿瘤进展FHIT39调节细胞周期,凋亡肿瘤进展FLT439血管内皮生长因子的受体肿瘤进展HIN140肿瘤抑制预后差hMLH143,hMSH243DNA 修复肿瘤进展NPY40调节昼夜节律肿瘤进展p14ARF37细胞增殖,血管生成肿瘤进展,大小,转移;预后好p5346DNA 修复,细胞分裂肿瘤进展p7333凋亡肿瘤进展PI3K47细胞分裂肿瘤进展和转移PRTFDC148蛋白质均聚,镁离子结合肿瘤进展PTEN49分化、生存、增殖、入侵、凋亡肿瘤侵袭,预后差RASSF50调节细胞周期,凋亡预后差RUNX351调节转录肿瘤进展,转移STAT333调节转录肿瘤侵袭,预后差THBS133细胞与细胞和细胞与基质相互作用肿瘤侵袭TP7335压力细胞应激和细胞发育预后差WIF151调节转录肿瘤侵袭WRN33DNA 修复,复制肿瘤侵袭TGM-355用于表皮末端分化和形成角化细胞包膜 肿瘤进展HOXA956基因表达,分化肿瘤进展,转移唾液CD4457细胞间相互作用、粘附和迁移肿瘤侵袭DCC32神经发育,凋亡肿瘤进展GSTP158细胞信号调节肿瘤进展KIF1A59沿轴突微管的膜运输肿瘤发生NID260细胞粘附肿瘤侵袭,转移p16INK4a37调节细胞周期,衰老肿瘤进展PAX132细胞粘附肿瘤进展CCNA161调节细胞周期预后差TIMP332上皮-间充质相互作用肿瘤进展DAP-kinase62细胞凋亡、自噬肿瘤进展,预后差MGMT63DNA 修复肿瘤进展RAR64细胞生长,分化肿瘤进展854许益敏,等.DNA 异常甲基化在口腔鳞癌中的研究进展表 3 口腔鳞癌中 DNA 低甲基化基因及其生物学功能基因基因的生物学功能临床解读样本类型AIM265细胞增殖预后差口腔鳞癌固体组织(手术切除)CEACAM166肿瘤细胞生长预后差Survivin18细胞增殖,凋亡肿瘤侵袭LINE-167DNA 复制68肿瘤进展4 DNA 甲基化与 OSCC 的诊断、治疗及预后目前针对 OSCC 的治疗手段主要是外科手术辅以放化疗,虽然治疗策略在不断改善,但其预后仍不容乐观,这多归因于疾病发现的时机。大部分鳞癌患者一经发现就是晚期69。研究显示,OSCC 在T1 阶段确诊、治疗,5 年生存率为 80%以上,晚期确诊则仅 20%30%70。同时病理活检是确诊口腔鳞癌的金标准,这加剧了隐匿性 OSCC 早期发现的难度,延误了癌症的早期诊治,这也是各方学者致力于研究生物标志及机制的主要原因。研究表明,根据与口腔鳞癌发生发展相关的DNA 甲基化标志物,可开发简单易用易识别的诊断试剂盒用于 OSCC 的早筛63,71。最常报告的超甲基化位点是 p16,p14,DAPK,MGMT72。外显子基因组范围的甲基化研究也对这些位点进行了验证。但同时,根据样本类型选择的不同,这些基因的 DNA 甲基化水平也不同,例如 DAPK 甲基化水平在唾液中就明显降低73。这也提示我们甲基化模式具有组织异质性,其中的机制仍待我们进一步研究探讨。此外,由于唾液的获取简单、快速、无创,因而对 OSCC 唾液表观遗传标志物的研究也成为了研究热点方向。目前研发表观遗传靶向药物成为 OSCC 治疗的新途径,其中 DNA 甲基化是药物研究中的热点之一,多集中于甲基化异常的位点。目前国内外已研发出针对多种 DNA 甲基化的 DNMT 抑制剂并应用于临床5。同时,放化疗依旧在口腔癌的治疗中扮演着重要角色,文献中不乏报道许多表观基因改变可应用于治疗的指导,如:OSCC 患者中 MGMT启动子甲基化状态可用于预测其化疗敏感性74。另外,除了上表中统计的与预后相关的基因,Imai等75发现 SALL2 基因 DNA 甲基化也与 OSCC 预后相关,韩宇庆等63发现 CD133 和 CD147 的甲基化状态与患者的生存率有关。总结来说这些表观遗传标志物的发现及研究,对 OSCC 的探索有着突破性的意义。5 小结目前 DNA 甲基化在 OSCC 中的研究有不少的进展,越来越多的生物标志物(包括早期诊断、预后、及治疗靶点)出现在大众视野,成为 OSCC诊治过程中的一个参考指标,但从标志物的有效性来看,缺乏敏感性及特异性高的分子标志物。从研究位点来看,OSCC 中 DNA 甲基化研究多聚焦于候选基因启动子 CpG 岛,对全基因组甲基化检测分析较少。从候选基因来看,OSCC 甲基化研究大部分是通过回顾以往文献来确定候选基因,有偏倚风险,同时个别候选基因序列片段的甲基化改变不能有效说明恶性肿瘤发生内在机制,还需进一步验证。从样本来看,研究对象多为健康、癌旁与癌组织,缺少中间进展环节,例如口腔黏膜白斑、红斑、糜烂性扁平苔癣等。文献检索发现,仅有少量研究在发育不良的癌前样本上检测了部分基因的甲基化模式变化76-77,而这些连续的病理变化过程中 DNA 甲基化差异表达的变化分析,对 OSCC 发生发展机制的探讨有更显著更有指导性的意义。大量研究在分析 OSCC 中 DNA 甲基化水平时,多结合烟酒炎症等危险因素,但通过大量文献回顾发现,肥胖、糖尿病、高血压等中国高发生率疾病与 DNA 甲基化亦存在着相关联性,这也提示我们在综合分析时是否需要考虑其他全身因素对 DNA甲基化水平的影响。因此,在对未来研究的展望中,我们应对病理各阶段特别是癌前病变进行更深入的 DNA 甲基化差异表达研究,筛选出最有潜力的基因24,通过构建动物模型,或者建立人口腔癌的 DNA 甲基化谱系,综合分析各样本类型中的DNA 甲基化水平,为 DNA 甲基化在口腔鳞癌中发生发展的机制研究奠定基础;为患者的早筛、预后及治疗提供新的突破口。参考文献1 RAI V,MUKHERJEE R,GHOSH A K,et al.Omits inoral cancer:New approaches for biomarker discoveryJ.Arch Oral Biol,2018,87:15-34.2 SIEGEL R L,MILLER K D,FUCHS H E,et al.Cancerstatistics,2022J.CA Cancer J Clin,2022,72(1):7-33.3 HUSSEIN A A,HELDER M N,DE VISSCHER J G,et al.Global incidence of oral and oropharynx 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