浙江海域新纪录种——瓣叉鼻...态特征及其DNA条形码分析_黎海丽.pdf

浙江海域新纪录种浙江海域新纪录种 瓣叉鼻鲀瓣叉鼻鲀的形态特征的形态特征及其及其 DNA 条形码分析条形码分析 黎海丽1，杨天燕1，王业辉2，高天翔1*（1.浙江海洋大学水产学院，浙江舟山 316022；2.中国海洋大学水产学院,山东青岛 266003）摘摘 要要：2020 年 4 月，在浙江舟山海域采集到 12 尾鲀形目鱼类标本，鉴定结果显示其为浙江海域的新纪录种瓣叉鼻鲀 Arothron firmamentum。本研究对采集到的 12 尾瓣叉鼻鲀进行了形态学及 DNA 条形码分析。瓣叉鼻鲀具有以下主要形态特征：体色灰黑色，除眼周围与尾柄后部外，全身布满小刺，背鳍鳍条数 14，臀鳍鳍条数 1314，胸鳍鳍条数 1516，尾鳍鳍条数 11。测定了 12 尾标本的线粒体 COI 与 12S rRNA 基因片段序列，结合 GenBank 中所有学名为 A.firmamentum 的同源序列进行分析，基于 COI 与 12S rRNA 基因片段序列构建的邻接系统树表明 COI 与 12S rRNA 基因片段聚类结果完全一致，均与近缘种明显分开，证实本研究采用形态学与分子方法鉴定的鲀形目鱼类为瓣叉鼻鲀。关键词：关键词：瓣叉鼻鲀；新纪录种；浙江；形态特征；DNA 条形码 中图分类号：中图分类号：S931 文献标识码：文献标识码：A A New Record of Arothron firmamentum from Zhejiang Coastal Waters based on Morphological Characters and DNA Barcoding Analysis LI Haili1,YANG Tianyan1,WANG Yehui2,et al(1.School of Fisheries of Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022,China;2.Fisheries College,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)Abstract:In April 2020,12 specimens of Arothron firmamentum were collected from Zhoushan,Zhejiang Province,and the results showed that they were the new record of A.firmamentum in Zhejiang Province,and morphological and DNA barcode analyses were conducted on the 12 specimens collected.The main morphological characteristics of A.firmamentum were as follows:the body color was grayish black,the body was covered with small spines except around the eyes and the posterior part of the caudal peduncle,dorsal-fins rays 14,anal-fins rays 1314,pectoral-fins rays 1516,caudal-fins rays 11.The mitochondrial COI and 12S rRNA gene fragments of 12 specimens were determined and analyzed in combination with all the homologous sequences of A.firmamentum in GenBank,It was confirmed that both morphological and molecular methods were used in this study to identify the Tetraodontiformes as A.firmamentum.Key words:Arothron firmamentum;new record;Zhejiang;morphological characters;DNA barcoding 收稿日期：收稿日期：2022-07-11 基金项目：基金项目：浙江省重点研发计划(2021C02047)作者简介：作者简介：黎海丽(1996-)，女，广东省深圳人，硕士研究生，研究方向：鱼类研究与保护.通信作者：通信作者：高天翔.E-mail: 网络首发时间：2023-07-03 10:06:41网络首发地址：https:/ Tetraodontiformes 隶属于辐鳍鱼纲 Osteichthyes、新辐鳍亚纲 Actinopterygii，广泛分布于太平洋、印度洋和大西洋的热带和亚热带暖水海域。我国沿海分布鲀形目有 10 科63 属 137 种1。浙江海洋鱼类志2中记载浙江海域鲀科鱼类有 4 属 21 种，分别为东方鲀属 Takifugu 有 14 种、兔头鲀属 Lagocephalu 有 5 种、圆鲀属 Sphoeroides 和泰式鲀属 Tylerius各有 1 种，瓣叉鼻鲀在浙江海域尚未有记载和报道3-6。瓣叉鼻鲀 Arothron firmamentum 隶属于鲀形目 Tetraodontiformes、鲀科 Tetraodontidae、叉鼻鲀属 Arothron，分布于印度西太平洋、日本、中国台湾、澳大利亚及新西兰7，为近海中下层暖水性鱼类，最大体长约 35 cm，常出现于底拖网渔获物中，目前,仅见一些关于瓣叉鼻鲀的形态学测量及鲀毒素的研究8-9,未见遗传学相关的报道10-13。DNA 条形码(DNA barcoding)是指一段短的、能够高效鉴定物种的目的基因片段，通过DNA 序列比较分析后，即可准确鉴定物种。2003 年，加拿大学者 HEBERT,et al14提出了采用线粒体 DNA 的 COI 基因片段序列，对动物界 11 个门 13320 个物种进行研究，结果显示线粒体 COI 基因能够对动物界的物种进行有效的鉴定。研究表明 98%以上的物种序列差异超过 2%，认为 COI 基因可以作为 DNA 条形码对物种进行分类鉴定。基于 COI 基因的DNA 条形码技术已广泛用于物种鉴定、新种、新纪录种的发现等方面15-21。DNA 微型条形码(Mini-DNA Barcode)是指利用标准条形码基因序列长度为 100200 bp 的一部分进行物种鉴定的 DNA 序列22-23。2015 年，日本学者 MIYA,et al24设计了 12S rRNA 的通用引物，并证明了它在海水鱼类中的良好通用性。本研究采集浙江舟山海域的瓣叉鼻鲀标本，采用传统形态学的测量方法，对形态特征进行描述，同时测定该物种的 COI 和 12S rRNA基因片段序列，并与 GenBank 中的同源序列进行了比较分析。研究结果为浙江海域鱼类的分类提供了重要的参考，并为浙江海域叉鼻鲀属鱼类研究补充基础资料。1 材料与方法材料与方法 1.1 实验材料实验材料 瓣叉鼻鲀样品(编号为 A.firmamentum1-12)于 2020 年 4 月采自浙江舟山海域，采样方式为底拖网渔获，共 12 尾，体长范围为 161.1193.3 mm，体重范围为 153.86158.77 g。所有样品保存于实验室-20 冰箱中。1.2 实验方法实验方法 1.2.1 形态学研究形态学研究 对 12 尾瓣叉鼻鲀用电子天平测量样品体重，精确至 0.01 g。采用传统形态学方法对 17个外部形态特征进行测定分析，包括 5 种可数性状、12 种可量性状。5 种可数性状包括：1)背鳍数；2)胸鳍数；3)臀鳍数；4)尾鳍数；5)椎骨数。12 种可量性状包括：1)全长；2)体长；3)头长；4)眼径；5)吻长；6)眼后头长；7)尾柄长；8)尾柄高；9)背鳍基长；10)胸鳍基长；11)臀鳍基长；12)尾鳍基长，可量性状使用游标卡尺进行测量，精确到 0.01 mm，结果见图 1。(1.全长，2.体长，3.头长，4.眼径，5.吻长，6.眼后头长，7.尾柄长，8.尾柄高，9.背鳍基长，10.胸鳍基长，11.臀鳍基长，12.尾鳍基长。)图图 1 瓣叉鼻鲀形态学测量指标瓣叉鼻鲀形态学测量指标 Fig.1 The schematic diagram of morphologic measurement of A.firmamentum 1.2.2 遗传学研究遗传学研究 剪取背部肌肉，采用苯酚-氯仿法提取基因组 DNA，所得基因组 DNA 溶于 100 L 双蒸水中，4 保存。用于扩增线粒体 COI 基因片段采用正向引物 F2 与反向引物 R2，引物序列为:F2:5-TCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3和R2:5-ACTTCAGGGTGACCGAAG AATCAGAA-325。用于扩增线粒体 12S rRNA 基因片段采用正向引物 MiFish-U-F 与反向引物 MiFish-U-R，引物序列为:MiFish-U-F:5-GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC-3和 MiFish-U-R:5-CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG-326。PCR 反应总体系为 25 L，包括 17.25 L 去离子水，0.25 L Taq 酶，2.5 L10PCR buffer，2 L DNTPs，1 L DNA 的模板，正反向引物各 1 L。反应条件如下：95 预变性 5 min，随后 95 变性 45 s，55 退火 30 s，72 延伸 45 s，36 个循环，最后 72 延伸 10 min。以上反应均设阴性对照以排除 DNA 污染的情况。PCR 扩增产物采用 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，条带明亮清晰且单一的 PCR 产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序。测序所得的序列用 DNAStar 软件包中的相关软件进行编辑和校对，利用 Seqman 软件结合测序峰图进行序列的校正和编辑。从 GenBank 中下载拉丁学名为 A.firmamentum 及Arothron hispidus 的 COI 和 12S rRNA 同源序列(表 1,表 2)进行比对分析。使用 MEGA X 软件以黑鳃兔头鲀 Lagocephalus inermis 作为外群构建 K2P 邻接(Neighbor-joining)系统发育树，并计算遗传距离，对于测序获得序列提交 NCBI。表表 1 本研究所用本研究所用 COI 序列信息序列信息(“”表示信息缺失表示信息缺失)Tab.1 The COI sequences used in this study(“”indicate data missing)物种名(拉丁学名)样品编号 引用 GenBank 序列号 瓣叉鼻鲀 A.firmamentum A.firmamentum1-12 ASIZP0916976 P45306_NMNZ_P045306 ON307214 AP006742 KU945265 MN123273 纹腹叉鼻鲀 A.hispidus lSl17 HBL-Ll-2001-187 WL-M651 BDU-RKK04 JF952687 KP194920 EU148579 KX758093 黑鳃兔头鲀 L.inermis 268.20#1 BW-A6874 JF493725 GU674211 表表 2 本研究所用本研究所用 12S rRNA 序列信息序列信息 Tab.2 The 12S rRNA sequences used in this study 物种名(拉丁学名)样品编号 引用 GenBank 序列号 瓣叉鼻鲀 A.firmamentum A.firmamentum1-12 HUMZ:206344 ON310826 AP006742 LC037106 纹腹叉鼻鲀 A.hispidus CBM:ZF:12756 KAUM:I:60551 CBM:ZF:18906 FMNH:PAL06-49 T604 AB972076 LC037120 LC458221 KT600935 黑鳃兔头鲀 L.inermis CBM:ZF:14852 KUGEN_ECpf-pSkLI07 LC104476 KF781131 2 结果结果 2.1 瓣叉鼻鲀形态特征瓣叉鼻鲀形态特征 2.1.1 外部形态特征描述外部形态特征描述 瓣叉鼻鲀体型及体色、斑纹等特征见图 1。12 尾样品鱼体呈长椭圆形，头胸部宽圆，微侧扁，躯干后部渐细，尾柄圆锥状，细长，后部渐侧扁。头中大，短粗，头长显著短于鳃孔至背鳍起点长。吻短，吻长显著短于眼后头长。眼中大，侧上位。眼间隔稍圆突。每侧具 1个鼻孔，紧位于鼻瓣内外侧，鼻瓣呈卵圆形突起。口小，前位，呈横浅弧形状。上下颌齿呈喙状，与上、下颌骨愈合，形成 4 大齿板，中央缝显著。唇厚，有细裂纹，下唇较长其两端向上弯曲，伸达上唇外侧。除眼周围与尾柄后部外，全身布满小刺。背鳍位于体后部、肛门稍后上方，近似镰刀形，中部鳍条稍长。臀鳍与背鳍同形，基底与背鳍基底相对，或稍后于背鳍起点。无腹鳍，胸鳍侧中位，短细，近扇形，尾鳍宽大，呈圆弧形。头部和体背部灰黑色，被密布深紫黑色不规则小圆点或多角形斑点，斑点在头部较细小，体背部较粗大，无胸斑，只见较密集深色斑点，背鳍基底深色斑点亦较密集，腹面白色。2.1.2 可量性状和可数性状可量性状和可数性状 全长为体长的 1.211.29 倍，体长为头长的 2.644.05 倍，为体高的 4.034.09 倍，为尾柄长的 4.868.12 倍，为尾柄高的 8.5211.07 倍，为吻到背鳍起点 1.401.45 倍；头长为吻长的 2.654.15 倍，为眼径的 9.6615.60 倍，为眼间距的 5.508.06 倍，为背鳍长的 3.313.71倍，为胸鳍长的 4.554.83 倍，为臀鳍长的 3.223.52 倍，为尾鳍长的 1.532.15 倍；尾柄长为尾柄高的 1.322.29 倍。背鳍鳍条数 14，臀鳍鳍条数 1314，胸鳍鳍条数 1516，尾鳍鳍条数 11，椎骨数 20。2.2 DNA 条形码分析条形码分析 2.2.1 COI 基因片段序列分析基因片段序列分析 对 12 尾瓣叉鼻鲀的 COI 基因片段进行双向测序，获得 652 bp 的序列，共检测到 1 个单倍型，其GenBank 号为OQ744448。将本研究得到的序列与GenBank 中学名为A.firmamentum以及 4 条与瓣叉鼻鲀同属的学名为 A.hispidus 的同源序列(表 1)进行比较分析，采用邻接法以黑鳃兔头鲀为外群构建系统发育树，结果表明系统树上明显分为两个组群(图 2)。GenBank中序列号为 AP006742、KU945265 和 MN123273 的 3 条序列与本研究的 12 尾瓣叉鼻鲀先聚为一支，该组内的平均遗传距离为0，而来自GenBank的另外4条序列JF952687、KP194920、EU148579 和 KX758093 聚为一支，两组群间的遗传距离为 0.023。图图 2 基于基于 COI 基因构建的邻接系统发育树基因构建的邻接系统发育树 Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic tree based on COI gene 2.2.2 12S rRNA 基因片段序列分析基因片段序列分析 对 12 尾瓣叉鼻鲀的 12S rRNA 基因片段进行双向测序，获得 171 bp 的序列，共检测到1 个单倍型，其 GenBank 号为 OQ743531。将本研究得到的序列与 GenBank 中学名为 A.firmamentum 以及 4 条与瓣叉鼻鲀同属的学名为 A.hispidus 的同源序列(表 2)进行比较分析，采用邻接法以黑鳃兔头鲀为外群构建系统发育树，结果表明系统树上明显分为两个组群(图3)。GenBank 中序列号为 AP006742、LC037106 的 2 条序列与本研究的 12 尾瓣叉鼻鲀先聚类，该组内的平均遗传距离为 0，而来自 GenBank 的另外 4 条序列 AB972076、LC037120、LC458221 和 KT600935 聚为一支，两组群间的遗传距离为 0.010。图图 3 基于基于 12S rRNA 基因构建的邻接系统发育树基因构建的邻接系统发育树 Fig.3 Neighbor-joining phylogenetic tree based on 12S rRNA gene 3 讨论讨论 3.1 形态特征形态特征 瓣叉鼻鲀的原记录分布范围为台湾省、日本、澳大利亚、新西兰和印度西太平洋海域7。在我国浙江舟山海域首次发现了瓣叉鼻鲀，为浙江海域的鲀科、叉鼻鲀属新纪录种，其记录分布范围从我国台湾海域扩大到东海北部的舟山海域。本文对采集到的 12 尾瓣叉鼻鲀标本进行了形态学测量和观察，研究发现不同分布区的瓣叉鼻鲀，背部颜色有变化，大多数标本背部颜色为褐色，腹部为白色，腹部大多数没有网状图案，一些来自日本和新西兰的标本，背部颜色为灰黑色，腹部通常有网状图案8。这种现象，BRIGGS27指出，关于南北两极或反热带物种的关系都可以通过等温线的疏密来解释。本研究标本的特征值与瓣叉鼻鲀的原始描述和 de ASTARLOA,et al28的形态描述特征值鱼鳍条数一致(表 3)，体形存在一定的差异，可能由于栖息海域环境不同造成体形上的变化，水环境复杂多样，鱼类在漫长的演化过程中，体形向着适应各种生活环境的方向发展，使鱼类具有各种不同的体形；也有可能由于不同测量方式产生的人为误差。瓣叉鼻鲀共同点为上下颌骨与齿愈合成 4 齿板，具中央缝；体背和腹刺区相互分离，不在体侧相连接29。本研究得到的线粒体 COI 和 12S rRNA 基因序列经 NCBI 在线比对，与在线公布的 A.firmamentum 的同源性最高，达到 100%，且遗传距离在同种种内范围，通过形态特征和 DNA 条形码的研究，可判定本研究中的标本为瓣叉鼻鲀。表表 3 瓣叉鼻鲀的形态特征比较瓣叉鼻鲀的形态特征比较 Tab.3 Morphological data of A.firmamentum 形态特征/mm 原始描述(Temminck&Schlegel,1850)de ASTARLOA,et al 本研究 全长 125.5 195.1292 体长 109.7 161.1193.3 背鳍数 14 14 14 臀鳍数 1314 13 1314 胸鳍数 16 15 1516 椎骨数 20 20 20 尾鳍数 11 11 11 全长/体长 1.14 1.211.29 吻长/头长 1.15 2.654.15 眼径/头长 2.37 9.6615.60 眼间距/头长 5.508.06 背鳍长/头长 3.07 3.313.71 胸鳍长/头长 2.04 4.554.83 臀鳍长/头长 3.50 3.223.52 尾鳍长/头长 1.33 1.532.15 体高/体长 5.03 4.034.09 头长/体长 3.33 2.644.05 尾柄长/体长 6.94 4.868.12 尾柄高/体长 10.25 8.5211.07 尾柄长/尾柄高 1.48 1.322.29 吻到背鳍起点/体长 1.51 1.401.45 3.2 DNA 条形码分析条形码分析 DNA 条形码技术推动了生物分类学，生物多样性和生态学等学科的发展30。2005年，WARD,et al31利用线粒体 COI 基因序列对澳大利亚 207 种海洋鱼类进行分析，发现COI 基因在鱼类鉴定中具有良好的通用性，能够对鱼类进行有效的物种鉴定。动物线粒体COI 基因片段序列已被公认为是全球动物鉴定系统的核心标记基因片段32-33，是适合用来对亲缘关系较近的物种进行鉴定的标准基因。本研究基于 COI 基因片段序列构建的邻接系统树显示，本研究序列与 GenBank 中的瓣叉鼻鲀序列聚为一支，其同种内的遗传距离为0，没有超过物种划界阈值(2%)34，说明 COI 基因序列适用于叉鼻鲀属鱼类系统发育研究。DNA 微型条形码开始是针对博物馆标本提出的，在博物馆中的许多标本因为储存年限和储存方法问题，无法扩增出正常长度的 COI 序列，这给 DNA 条形码数据库的建立的发展带来了困扰。针对这一情况，HAJIBABAEI,et al35首先提出了 DNA 微型条形码的概念，并将约 130 bp 的序列应用于蛾类干制标本的鉴定，研究表明约 130 bp 的 DNA 微型条形码可以有效地鉴定物种。近年来，环境 DNA 研究和高通量测序的结合则为生物多样性的检测提供了新的研究思路，其中，MIYA,et al24使用 12S rRNA 引物对水族馆水样证明了引物的有效性，隶属于 70 个科 152 个属，表明 12S rRNA 可以作为生物多样性研究的一项重要的手段。本研究使用 12S rRNA 序列对叉鼻鲀属鱼类进行分析，结果显示种内遗传距离为 0，种间遗传距离为 0.010。本研究结果与 COI 基因序列研究结果一致，说明 12S rRNA 也适用于叉鼻鲀属鱼类系统学研究。综上所述，基于线粒体 COI 和 12S rRNA 基因的 DNA 条形码在识别叉鼻鲀属鱼类物种方面和传统形态学基本一致，而且该基因不但可以用于叉鼻鲀属鱼类物种间系统发育关系的探讨，同时也为探讨以线粒体 COI 和 12S rRNA 基因作为 DNA 条形码对叉鼻鲀属鱼类进行物种识别的可行性提供了一定的参考。4 结论结论 本文报道了浙江海域新纪录种瓣叉鼻鲀，并进行了形态学及 DNA 条形码分析。瓣叉鼻鲀的学名为 Arothron firmamentum(Temminck and Schlegel,1850)，广泛分布于印度西太平洋、日本南部、中国台湾、澳大利亚及新西兰海域。本研究结果表明 DNA 条形码研究的必要性，并为浙江海域叉鼻鲀属鱼类的分类鉴定提供了重要的基础。参考文献参考文献 1 陈大刚,张美昭.中国海洋鱼类M.青岛:中国海洋大学出版社,2015.2 赵盛龙,徐汉祥,钟俊生.浙江海洋鱼类志M.杭州:浙江科学技术出版社,2016:1030.3 辽宁省科学技术委员会辽宁动物志编辑委员会.辽宁动物志:两栖类,爬行类M.沈阳:辽宁科学技术出版社,1987.4 成庆泰,周才武.山东鱼类志M.济南:山东科学技术出版社,1997.5 王所安,王志敏,李国良,等.河北动物志 鱼类M.石家庄:河北科学技术出版社,01-May-2001.6 倪勇,伍汉霖.江苏鱼类志M.北京:中国农业出版社,2006.7 KIM J H,SON K T,MOK J S,et al.Toxicity of puffer fish,Arothron firmamentum(byeolbok)and Lagocephalus spp.in KoreaJ.Journal of the Korean Fisheries Society,2008,41(5):309-314.8 HARDY G S.A redescription of the antitropical pufferfishArothron firmamentum(Plectognathi:Tetraodontidae)J.New Zealand Journal of Zoology,1980,7(1):115-125.9 NAKASHIMA K,ARAKAWA O,TANIYAMA S,et al.Occurrence of saxitoxins as a major toxin in the ovary 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