玉米 ZmGST 基因的克隆及表达特性分析.pdf

华北农学报():收稿日期:基金项目:山东省农业良种工程项目()山东省重点研发项目()作者简介:王可欣()女山东济南人在读硕士主要从事玉米分子育种研究通信作者:赵美爱()女吉林磐石人副教授博士硕士生导师主要从事玉米分子育种研究玉米 基因的克隆及表达特性分析王可欣郭昭阳殷宇航陈胜忠宋希云赵美爱(.青岛市主要农作物种质创新与应用重点实验室青岛农业大学 农学院山东 青岛.青岛农业大学 生命科学学院山东 青岛)摘要:谷胱甘肽硫转移酶基因()可以参与植物应对非生物胁迫的过程 为了解 在玉米中响应盐和干旱胁迫的能力以玉米自交系 为材料通过 克隆获得 基因并对该基因进行了生物信息学分析通过实时荧光定量分析该基因在玉米不同组织以及在模拟干旱和盐胁迫下的相对表达量构建原核表达载体后进行干旱和盐处理 结果表明 基因 序列全长为 编码 个氨基酸生物信息学分析结果表明该基因属于 家族为亲水不稳定蛋白不存在跨膜结构存在 个磷酸化修饰位点未发现有信号肽为非分泌型蛋白亚细胞定位预测 位于细胞核和细胞质 同源序列结果表明 与高粱的亲缘关系最近与 基因相似度最高 启动子分析结果发现含有 等元件参与防御和应激反应 实时荧光定量结果显示 基因在玉米根中的表达量最高并受盐胁迫诱导上调表达在处理 后达到最高 在原核水平的盐和干旱胁迫结果显示重组质粒 的大肠杆菌菌体在不同盐浓度的培养基中均能正常生长模拟干旱被抑制 推测 基因在玉米响应盐胁迫方面有重要作用关键词:玉米 盐胁迫原核表达中图分类号:.文献标识码:文章编号:():./.(.):().期王可欣等:玉米 基因的克隆及表达特性分析 .:我国作为传统农业大国人口基数大粮食问题一直备受关注 玉米(.)是我国第一大粮食作物在农业生产和粮食安全中发挥重要作用但在生长过程中经常遭遇干旱、盐碱、高温、低温等非生物胁迫导致减产和品质的降低其中盐碱地土壤所含的盐分严重影响作物的正常生长 我国盐碱地的面积约为 万 开发利用价值巨大已被开垦利用的盐碱地还未达到其总面积的五分之一 合理利用盐碱地不仅可以缓解我国地少人多的局面还可以在很大程度上缓解粮食供不应求的现状 盐碱地治理难度较大进行耐盐基因的挖掘和耐盐碱新品种的培育是可行的治理措施之一谷胱甘肽转移酶()是一个古老且具有多种作用的蛋白质超家族可以调控植物的生长发育并在初生代谢、次生代谢、细胞信号转导以及对抗生物和非生物胁迫等生物学过程中发挥重要作用 分为 个主要的蛋白质家族细胞质、线粒体、微粒体 和细菌磷霉素抗性蛋白其中细胞质 家族是最丰富的在植物中 可分为 类包括()、()、()、()、()和脱氢抗坏血酸还原酶()其中()和()是最大植物特异性和高度应激诱导的谷胱甘肽转移酶基因种类 根据 蛋白序列构建的隐马尔可夫模型鉴定出玉米基因组中一共含有 个 基因可分为、种 型 基因的表达与细胞分裂素、生长素等激素有关对植物的生长发育起着调节作用 基因在逆境胁迫中扮演着重要角色包括调控植物非生物胁迫过程 如 通过作为胁迫介导的信号转导途径的负成分在干旱和盐胁迫的适应性响应中发挥作用在烟草幼苗中过表达 基因增加了谷胱甘肽依赖性的过氧化物的清除和谷胱甘肽、抗坏血酸代谢的改变从而减少了氧化损伤 番茄相关 基因 在根和花中表达进行拟南芥异源验证获取的转基因植物对 和甘露醇诱导的盐和渗透胁迫的抵抗力增强 玉米 基因的表达显著受干旱、盐、低温等非生物胁迫的诱导 的作用是通过与谷胱甘肽的结合来解除有毒物质减轻氧化应激反应 盐胁迫会导致植物失水使渗透压改变体内活性氧代谢系统会出现紊乱现象并产生大量活性氧从而损伤植物质膜和其他细胞组分进而影响植物的生长发育 基因在植物的抗氧化过程中具有十分重要的作用于是推测盐胁迫下过量表达玉米 基因能在一定程度上减缓对植物的损伤 基因除了抗逆相关功能还有一些其他生物作用主要包括清除体内的毒性代谢产物 并且参与到信号传递中 功能多样化的 在研究基因家族进化方面具有重要意义并为研究其在植物发育和对环境信号的响应中的作用开辟了途径本试验对 进行克隆和生物信息学分析通过实时荧光定量 探究 组织特异性表达以及干旱和盐胁迫下的基因表达量 转入原核载体 并通过 大肠杆菌研究该基因对盐胁迫、干旱非生物胁迫的作用为该基因转入真核表达载体提供参考 材料和方法.试验材料本试验使用的玉米自交系 由玉米分子育种实验室提供 选取饱满的玉米种子种植于营养土中三叶期时取样胁迫处理:使用./的 以及 处理 三叶期玉米并对根进行分时段取样分别是 于 保存 每个试验组 个重复.试验方法.的克隆和原核表达载体构建根据(.)中参考序列的 全长进行特异性引物设计见表 引物 以根的 作为模板进行 扩增后连接中间载体 将菌液 以及双酶切验证后检测得到的阳性克隆送青岛擎科生表 玉米 基因所用引物.名称引物名称 引物序列()()引物 引物 引物 华 北 农 学 报 卷物公司测序测序正确的菌液提取质粒 后存于 菌株由本实验室保存使用 质粒作为模板进行 扩增引物见表 引物 使用 连接酶配置 连接体系 将菌液 验证后检测得到的阳性克隆送青岛擎科生物公司测序 具体步骤参照参考文献.蛋白特性分析通过 网站的 功能分析该基因的 保守区 软件进行生物信息学分析 在线软件对蛋白质序列进行亲水性、疏水性的预测分析.对蛋白质序列跨膜结构预测分析.软件分析 蛋白的磷酸化位点.预测信号肽 进行亚细胞定位预测 分析 蛋白二级结构 分析三级结构 分析启动子区域元件.基因的组织特异性表达分析玉米自交系 正常生长至三叶期取根、茎、叶样品至液氮中保存根据 试剂盒提取 利用超微量分光光度计检测 浓度 反转录合成通过实时荧光定量()进行组织特异性表达分析 引物设计见表 引物 以玉米 作为内参基因基因号为.实时荧光定量 将./的 以及 处理后的玉米取样后进行实时荧光定量 反应程序为:预变性 变性 退火 延伸 循环数 釆用 相对定量的分析方法进行数据分析使用 软件进行数据差异性分析.重组大肠杆菌的盐、干旱胁迫处理 盐胁迫:配置 浓度为./的 液体培养基并在高温灭菌后将 空载和 的大肠杆菌分别在超净工作台中接种至上述 种浓度的 培养基中 摇床中/振荡培养每隔 取样测定吸光度并进行处理与分析干旱胁迫:本试验使用 模拟植物干旱条件配置 浓度为的 液体培养基后续试验步骤同盐胁迫 结果与分析.谷胱甘肽转移酶 的克隆以玉米 根、茎、叶 为模板进行 扩增可知 在根、茎、叶中均能扩增(图)条带大小为 连接 载体后进行菌液 鉴定(图)菌液扩增片段大小为 双酶切验证在指定位置出现线性化 条带(图)测序结果与已公布 序列碱基相似性为.氨基酸序列相似度为.连接 原核表达载体进行菌液 验证得到正确条带(图)测序与克隆序列比对相似度为.的组织扩增(.茎.根.叶).载体鉴定结果.酶切验证.载体鉴定结果.(.).图 的克隆及载体连接.蛋白质特性分析.蛋白质的理化特性 碱基序列以及蛋白质如图 所示编码 个核苷酸 个氨基酸 使用 软件进行生物信息学预测分析表明 编码的蛋白质分子式为相对分子量为.理论等 期王可欣等:玉米 基因的克隆及表达特性分析 电点.总负电荷残基数()为 正电荷残基总数()为 不稳定指数为.属于不稳定蛋白质 通过 网站的 功能进行该基因的 保守区分析(图)发现克隆的 蛋白内存在一个 结构域属于()这一分支是植物抗氧化系统的重要成员可能在逆境响应等生物学过程中发挥重要作用该基因包含 个外显子(图).核苷酸及氨基酸序列.保守域分析.基因结构分析.图 核苷酸及氨基酸序列、保守域分析以及基因结构.利用 在线软件对 蛋白质序列进行亲水性、疏水性预测分析亲水性蛋白多于疏水性蛋白该蛋白属于亲水性蛋白(图).对蛋白质序列跨膜结构预测分析其氨基酸序列中不存在跨膜结构(图)可直接进行原核表达的验证 采用 .修饰位点进行分析发.疏水亲水分析.跨膜结构分析.磷酸化预测.信号肽预测.图 的生物信息学分析.华 北 农 学 报 卷现 存在 个磷酸化修饰位点(图)其中(苏氨酸)有 个、(丝氨酸)个、(酪氨酸)个磷酸化修饰位点较为均等可能与信号转导、生长发育等有关 使用 .对 蛋白进行信号肽预测分析(图)未发现有信号肽为非分泌型蛋白 进行亚细胞定位预测定位在细胞核里的可能性最大为.胞质为.线粒体为.最小的是细胞外(包括细胞壁)是.蛋白结构预测通过 分析 蛋白二级结构如图 所示二级结构依次为 螺旋(蓝色)占.、折叠(绿色)占.、无规则卷曲(紫色)占.和延伸链(红色)占.再通过 进一步分析三级结构如图 所示发现同样存在多个 螺旋与无规则卷曲与二级结构分析一致 螺旋为主要元件图 蛋白二级结构直观图与空间结构.以及玉米 家族系统进化树 为了解 蛋白与不同物种的亲缘关系将获得的氨基酸序列在 上进行 得到的序列进行系统进化树分析(图)该基因 与高粱()的亲缘关系最近 对玉米 基因家族进行系统进化树分析利用李晓玉等对玉米 家族的建立隐马尔可夫模型()的方法分析将玉米 基因根据序列相似性分为 型(蓝色区域)、型(紫色区域)、型(橙色区域)三类(图)利用 与这些序列对比发现 与克隆的 基因的全长氨基酸相似度最高为.(红色)属于 型图 的系统进化树.基因启动子分析利用 对启动子区域进行元件分析 基因启动子区(图)含有多个响应逆境及植物激素的作用元件图 玉米 家族系统进化树.包括 参与低温反应原件、参与防御和应激反应元件、与脱落酸反应相关元件以及 光响应元件推测基因被盐胁迫诱导可能与 元件相关.的组织特异性表达分析实时荧光定量 对玉米不同组织(根、茎、叶)中的基因表达特异性分析结果显示 在不同组织中均有表达相对表达量在根中最高其次为叶和茎(图)根部表达量约为茎的 倍叶的.倍说明 主要在根中发挥作用 胁迫处理后的相对表达量结果显示(图)在模拟干旱条件下 基因下调表达 表达量降低在 最低 盐处理后该基因的表达量呈上升趋势在 的基因表达量是 的 倍 因此推测 期王可欣等:玉米 基因的克隆及表达特性分析 在干旱胁迫时受到抑制在盐胁迫处理时被诱导表明该基因可能对这两个逆境胁迫存在不同作用图 启动子元件分析.的组织特异性分析.受到胁迫后的表达量分析()不同小写字母表示显著差异(.).().图 的相对表达量.基因耐盐功能分析成功 构 建 重 组 大 肠 杆 菌 ()后对 以及 进行不同浓度盐胁迫测得平均 如图 所示转入了重组质粒 的菌体生长情况高于转入空载体 的菌体说明对照菌体 在./盐浓度培养基中菌体的生长明显受到了抑制而转入重组质粒 的大肠杆菌菌体在./盐浓度的培养基中均能正常生长 基因在原核水平内可能对盐胁迫有一定的抗性与盐胁迫玉米后该基因上调表达结果一致图 盐处理后 菌株、菌株生长曲线图.基因耐旱功能分析成功构建重组大肠杆菌()后对 以及 进行 的不同浓度干旱胁迫测得平均 如图 所示转入了重组质粒 的菌体在 中与空载体 的菌体生长情况一致均明显受到抑制在 中高于空载菌体生长状况但趋势较为相似推测该基因对干旱敏感 结论与讨论谷胱甘肽转移酶家族成员众多存在于各种植物中在拟南芥、水稻、小麦、玉米等均有研究 在 家族中植物特有的是、和 类其中 型是二聚体的可以催化各种生物的结合在除草剂中具有选择性解毒的作用 型是玉米谷胱甘肽转移酶成员最多的 华 北 农 学 报 卷图 干旱处理后的 菌株、菌株生长曲线图.一类 同样地本试验克隆了 型的玉米 类基因中的一种通过生物信息学分析发现 蛋白相对分子量是.为不稳定的亲水蛋白未发现信号肽不存在跨膜结构域同样符合该基因在细胞核的预测 通过分析其表达量利用 网站得到该基因在根中表达水平最大值约是在叶中表达水平最大值的 倍且表达最大值在根毛附近无根毛区域表达量较根毛区域表达量相差较大 表达差异结果与实时荧光定量结果相符在根中表达量最大 系统进化树分析与高粱的亲缘关系最近在玉米 家族中与 相似度最高 类 基因在逆境胁迫中发挥作用 水稻 基因 和 编码 类谷胱甘肽转移酶响应水稻根系缺氧胁迫诱导以及盐胁迫 还通过在各种生物或非生物胁迫下过量表达来增强植物对逆境的抵抗力是抗氧化防御系统中重要的酶系 如大豆 是 类谷胱甘肽转移酶家族基因通过增强谷胱甘肽转移酶的活性介导活性氧和谷胱甘肽的清除从而增强植物对盐胁迫的耐受性 柳树 的过表达通过增强清除活性氧的能力来改善干旱和耐盐性 这些与 响应盐胁迫的功能类似但是其作用机理仍需探究可见 基因研究具有重要意义玉米在生长过程经常会遇到干旱、盐、低温等非生物胁迫可引起玉米不同程度的脱水从而引起渗透胁迫使得 浓度急剧上升从而诱发大量的活性氧()的生成 还可以起到诱导植物抵抗逆境的作用但过量的 会使生物大分子如膜脂、核酸、蛋白质等发生一定损伤从而引起二次胁迫 的主要功能是通过促进亲电性底物与 发生反应从而实现对活性氧和外来物质的清除谷胱甘肽硫转酶能使 的巯基与某些亲电子性化合物相结合对 和某些蛋白的损害有一定的保护作用 能将疏水性较强的外源性与内源性的代谢物进行代谢并提高它们的极性最后排出体外从而保证植物正常的生长发育 因此推断 作为一类与活性氧有关的酶可能与 相关为了研究 基因是否对胁迫产生响应荧光定量结果显示在盐胁迫条件下该基因表达上调通过原核表达试验证明重组质粒 的大肠杆菌菌体在不同盐浓度的培养基中均能正常生长因此推测该基因可能与耐盐作用相关也可能与 相关 进一步探究干旱敏感作用机理对于深入研究 基因功能和真核生物中的作用具有参考价值同时也揭示了该基因在玉米逆境胁迫下反应机制至关重要参考文献:廖婕 任慧敏 柳参奎 亓果宁.盐碱胁迫下植物生理和钙信号通路分子机制的研究进展.分子植物育种():.:./.():.江杰 王胜.我国盐碱地成因及改良利用现状.安徽农业科学():.:./.():.:.():.:./.李永生 方永丰 李玥 张同祯 慕平 王芳 彭云玲 王威 张金文.玉米逆境响应基因 克隆和表达分析.农业生物技术学报():.:./.().():.():.期王可欣等:玉米 基因的克隆及表达特性分析 :./.:.:./.李晓玉 江海波 江海洋 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