益气活血通络方联合针刺对糖尿病神经病理性疼痛大鼠背根神经节Nav1.7和Nav1.8表达的影响.pdf

益气活血通络方联合针刺对糖尿病神经病理性疼痛大鼠背根神经节 和 表达的影响程凯，陈前，袁慧伦，程连芝，江爱娟（安徽中医药大学中西医结合学院，安徽 合肥 ）摘要 目的观察益气活血通络方联合“足三里”针刺治疗对糖尿病神经病理性疼痛（，）大鼠背根神经节 和 表达的影响。方法采用高脂高糖饲养联合单次小剂量腹腔注射链脲佐菌素复制型糖尿病大鼠模型，通过检测大鼠的机械痛阈和热缩足反应时间判断 模型是否复制成功。将 大鼠随机分为模型组、针刺组、中药组、针药结合组。模型组予以生理盐水灌胃，针刺组针刺“足三里”，中药组予以益气活血通络方（）灌胃，针药结合组予以针刺“足三里”联合益气活血通络方灌胃，另设空白组。每日治疗次，每周治疗，连续周。治疗结束后取大鼠背根神经节，法检测 和 蛋白表达水平，法检测 、表达水平，免疫荧光染色法检测大鼠背根神经节中 、的荧光表达水平。结果与模型组比较，针刺组、中药组、针药结合组大鼠机械痛阈显著升高（犘 ），热缩足反应时间显著延长（犘 ），背根神经节中 、表达水平显著降低（犘 ）；与针刺组、中药组比较，针药结合组大鼠机械痛阈显著升高（犘 ），热缩足反应时间显著延长（犘 ），背根神经节中 、表达水平显著降低（犘 ）。结论益气活血通络方联合针刺治疗 的效果优于单一疗法，其作用机制与抑制背根神经节中 、表达有关。关键词 糖尿病神经病理性疼痛；益气活血通络方；针刺；背根神经节；中图分类号 根据国际糖尿病联合会的最新数据 ，年全球成年人（岁）患有糖尿病者有 亿，且约 糖尿病患者最终伴发糖尿病神经病理性疼痛（，）。是以感觉障碍，自发性疼痛，四肢烧灼样疼痛、刺痛，温痛觉超敏为临床特征，严重影响患者的生活质量。背根神经节是疼痛的反应中枢。在 的发展过程中，各种外周刺激可使离子通道表达水平发生改变，导致背根神经节过度兴奋，从而引起疼痛。研究表明，背根神经节中电压门控钠通道 （）和 参与痛觉的发生和传导。外周神经损伤时，神经的自发 性动作 电位和 异 常 的 高 频 活 动 导 致 和 在 背 根 神 经 节 中 高 度 表 达，和 表达水平升高可以扩大疼痛信号，增强疼痛传导。针药结合是临床上治疗疾病的常用方法，可以提升疗效，减少药物不良反应。前期研究 表明，益气活血通络方和针刺治疗可以有效缓解 大鼠的疼痛症状，减轻大鼠疼痛反应。因此，本研究旨在观察针药结合对 大鼠基金项目：国家自然科学基金项目（）；安徽省高校研究生科学研究项目（）作者简介：程凯（），男，硕士研究生通信作 者：江爱 娟（），女，教 授，背根神经节中 、表达的影响，为临床治疗 提供依据。材料 动物 只 级 大鼠，体质量 ，购自江苏省南京青龙山动物繁殖场 生产许可证号：（浙）。所有大鼠自由饮食，饲养于室温 、湿度 环境下。实验动物伦理编号为 。药物与试剂益气活血通络方（黄芪，鸡血藤，生地黄、当归、葛根各，延胡索、威灵仙各；安徽中医药大学第一附属医院院内制剂，批号 ）；链脲佐菌素（，；批号 ）：德国 公司；（批号 ）：德 国 赛 默 飞 世 尔 科 技 公 司；（批号 ）：美国 公司；（批号 ）：英国 公司。仪器血糖仪（型）：北京怡成生物电子技术有限公司；智能热板仪（）：成都泰盟软件有限公司；电子测痛仪（型）：美国 公司；通用电泳仪：美国伯乐公司；实时荧光定量 仪（型）：美国应用生物系统公司；凝胶成像分析系统（）：上 海 天 能 科 技 有 限 公 司；冰 冻 切 片 机（）：德国徕卡公司；荧光显微镜（：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 ）：日本尼康公司。方法 模型复制参照文献 的方法，将 只雄性 级 大鼠适应性喂养周，随机选取只作为空白组，普通饲料喂养，其余大鼠使用高脂饲料喂养周，使之产生胰岛素抵抗。周后单次腹腔注射 （），后，测量大鼠空腹血糖（，），判定为型糖尿病（，）模型大鼠。周后检测 大鼠的机械痛阈（，）和热缩足反应时 间（，），若下降至基础值 以下，且减少至基础值 以下，则判定为 模型大鼠。动物分组及治疗将 模型大鼠随机分为模型组、针刺组、中药组与针药结合组，每组只。空白组不作处理；模型组给予生理盐水灌胃；针刺组参照大鼠的解剖定位，对比人体的穴位分布，选取“足三里”穴每日进行针刺治疗，针刺 ；中药组用益气活血通络方（）灌胃治疗，每日次；针药结合组采用益气活血通络方和针刺“足三里”穴联合治疗，在灌胃后进行针刺，每日次，方法同上。测定将各组大鼠放置于筛状金属板上，用有机玻 璃罩分 隔开，静 息 。然 后 用 电子测痛仪垂直刺激大鼠后掌底，当大鼠出现抬足或者躲避时仪器上所显示的数值，即为。连续测次，每次测量间隔，取其平均值。每周测定次。测定提前将热板测痛仪预热至，将大鼠放入其中。当大鼠足部接触热板开始计时，当大鼠出现舔后足时停止计时，每只大鼠重复测定次，每次测定间隔时间为 ，其平均值即为。每周测定次。样本采集和处理实验结束后，对大鼠腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉。然后固定俯卧位，用外科剪刀和手术刀分出大鼠脊柱，从腰骶膨大处手术切出段，然后用眼科剪及镊子取出大鼠背根神经节并保存在 冰箱。法 检 测 大 鼠 背 根 神 经 节 中 、蛋白表达水平使用蛋白质提取试剂盒从背根神经节组织中提取总细胞蛋白，并使用 试剂盒测量浓度。用 电泳分离蛋白质，并转移到 膜上。随后在脱脂奶粉中封闭后，将膜与 、在下孵育过夜，然后室温下二抗孵育。使用 化学发光液并在凝胶成像系统中进行分析。法检测大鼠背根神经节中 、表达水平使用 提取大鼠背根神经节中总 ，测定 纯度，将 逆转录成 ，使用 法进行扩增，检测 、表达水平，最后用 法计算 相对表达水平。本实验所使用的引物序列：正 向 引 物：；反向引物：；正向引 物：；反向引物：；正向引物：；反 向 引 物：。免疫荧光法检测背根神经节中 、表达水平将背根神经节在 组织固定液中固定，随后将组织通过蔗糖梯度溶液脱水，包埋组织，通过切片机将组织切片。用 山羊血清封闭 ，并与一抗（、）在下孵育过夜，再将载玻片与二抗（山羊抗兔 ）室温下孵育，载玻片添加 孵育 。载玻片用抗荧光淬灭固定介质固定，并用荧光显微镜观察 、的表达情况，使用 （）计算 、的荧光强度。统计学方法采用 软件对数据进行统计 学 分 析。连 续 型 变 量 采 用“均 数标 准 差（珔狓狊）”表示。多组均数比较采用单因素方差分析，均数多重比较采用 检验。犘 表示差异有统计学意义。结果 不同时点组大鼠、比较与空白组比较，治疗前模型组大鼠、均显著降低（犘 ）；治疗周后，与空白组比较，模型组、针刺组、用药组和针药结合组持续降低，持续缩短；治疗、周后，与模型组比较，中药组、针刺组、针药结合组显著升高，显著延长（犘 ），且针药结合组、显著高于中药组和针刺组（犘 ）。见图。组大鼠背根神经节中 、蛋白表达水平比较治疗周后，与空白组比较，模型组大鼠背根神经节组织中 、蛋白表达水平显著升高（犘 ）；与模型组比较，针刺组、中药组 ：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 和针药 结 合 组 大 鼠 背 根 神 经 节 组 织 中 、蛋白表达水平显著降低（犘 ）；针药结合组大鼠背根神经节组织中 、蛋白表达水平显著低于中药组和针刺组（犘 ）。见图。注：空白组；模型组；针刺组；中药组；针药结合组；与空白组比较，犘 ；与模型组比较，犘 ；与针刺组比较，犘 ；与中药组比较，犘 图组大鼠、比较（珚狓狊，狀）注：空白组；模型组；针刺组；中药组；针药结合组；与空白组比较，犘 ；与模型组比较，犘 ；与针刺组比较，犘 ；与中药组比较，犘 图组大鼠背根神经节中 、蛋白表达水平比较（珚狓狊，狀）组大鼠背根神经节中 、表达水平比较与空白组比较，模型组大鼠背根神经节中 、表达水平均显著上升（犘 ）；与模型组比较，针刺组、中药组和针药结合组大鼠背根神经节中 、表达水平均显著降低（犘 ）；针药结合组大鼠背根神经节中 、表达水平显著低于针刺组和中药组（犘 ）。见图。注：空白组；模型组；针刺组；中药组；针药结合组；与空白组比较，犘 ；与模型 组比 较，犘 ；与针刺组比较，犘 ；与中药组比较，犘 图组大鼠背根神经节中 、表达水平比较（珚狓狊，狀）组大鼠背根神经节中 、荧光表达水平比较与空白组比较，模型组大鼠背根神经节中 、的荧光表达水平显著上升（犘 ）；与模型组比较，针刺组、中药组和针药结合组大鼠背根神经节中 、荧光表达表达水平显著降低（犘 ）；针药结合组大鼠背根神经节中 、荧光表达水平显著低于针刺组和中药组（犘 ）。见图。讨论 发病机制复杂，西医治疗的效果不理想，而针药结合治疗 的效果明显，是治疗 的重要方法。可归属于中医学“消渴病”“痹证”范畴，因消渴日久，阴虚内热，瘀血阻滞而成。益气活血通络方是临床治疗 的有效验方。临床研究 表明，该方可以降低血液黏稠度，改善微循环，调节细胞因子、神经内分泌和炎症因子，从而有效缓解糖尿病神经病变患者疼痛症状。课题组前期研究 表明，益气活血通络方可以改善 大鼠微循环，降低血脂水平，减轻脊髓神经炎症反应，对抗神经细胞凋亡，促进神经细胞再生，进而缓解 大 鼠 疼 痛 症 状。针 灸 对 疼 痛 具 有 独 特 疗效。足三里穴是临床治疗糖尿病周围神经病变的常 用 穴 位，为足 阳 明 经 合 穴，针 刺 足 三 里 治 疗 起 到 活 血 通 络、除 痹 止 痛 的 作 用。临 床 研究 表明，针刺足三里可以有效缓解糖尿病周围神 ：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 注：大鼠背根神经节的免疫荧光染色结果（倍，蓝色代表 ，绿色代表 、）；空白组；模型组；针刺组；中药组；针药结合组；与空白组比较，犘 ；与模型组比较，犘 ；与针刺组比较，犘 ；与中药组比较，犘 图组大鼠背根神经节中 、荧光表达水平比较（珚狓狊，狀）经病变导致的疼痛，改善神经传导速度。课题组前期研究表明，针刺足三里可以通过改善 大鼠炎症反应，缓解疼痛症状。针药结合是常用的中医治疗方法，早在 素问移精变气论 就有“毒药治其内，针石治其外”的记载，针药结合因其疗效显著，被历代中医大家所尊崇。中药内服可以调整人体的阴阳平衡和改善脏腑气血生理功能，外用针灸可以疏通经络，调整气血运行方式，从而达到通经止痛的目的。针药结合可以通过内外同治达到纠正人体气血阴阳失衡，改善全身状态，进而发挥治疗疾病的作用。本实验根据课题组前期方法构建 大鼠模型，与空白组比较，模型组大鼠显著降低，显著缩短。而经过益气活血通络方、针刺、针药结合种治疗方式干预后，组大鼠先下降后逐渐回升，先缩短再逐渐延长，说明种治疗方式都可以缓解 大鼠的疼痛症状。而针药结合组与益气活血通络方组和针刺组比较，大鼠显著回升，显著延长，说明针药结合相较于单纯用药和单纯针刺而言，更能缓解 大鼠的疼痛症状。背根神经节参与神经病理性疼痛的治疗机制，而 和 在背根神经节中高度表达，在 ：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 背根神经节动作电位的传导过程中占主导作用。研究 表 明，在 神 经 病 理 性 疼 痛 中，和 的表达水平增高与疼痛的程度呈正相关，而通过抑制 和 的表达，可以起到很好的镇痛作用。模型大鼠的痛觉过敏，同时伴随背根神经节中 和 增加，而通过干预手段降低背根神经节中 和 的表达水平，可以有 效缓解 大 鼠的 疼 痛。刘 鹏等 的研究证明，中药可以改变背根神经节中 和 表达，从而缓解糖尿病病理性疼痛。等 和 等 发现，针刺足三里可以改变神经疼痛大鼠背根神经节中 和 表达，进而改善大鼠疼痛症状。在本实验中，与空白组比较，模型组大鼠背跟神经 节中 和 表达水平显著升高，说明 和 参与 发生发展，这与 等 的实验结果一致。而经过益气活血通络方、针刺、针药结合种 治 疗 方 式 干 预 后，大 鼠 背 根 神 经 节 中 和 的表达水平显著降低；而针药结合组与中药组和针刺组比较，和 的表达进一步降低，说明针药结合能进一步降低大鼠背根神经节中 和 的表达水平。综上所述，益气活血通络方联合针刺可有效缓解大鼠 ，且效果优于单纯针刺和益气活血通络方，其作用机制可能与其抑制背根神经节中 和 的表达有关。的机制复杂，针药结合是否还可以通过其他通路来影响 还需要进一步探究。参考文献：，：，：？，（）：，：，（）：，：（），（）：，：李伯华，朱慧婷，程海英“针药结合”应用现状与思考北京中医药，（）：，（）：，：马俊龙，唐何勇，王帆竞，等益气活血通络方对糖尿病神经病理性疼痛大鼠脊髓星形胶质细胞活性及 信号通路的影响中华中医药杂志，（）：程连芝，周家梅，马俊龙，等延胡索乙素通过抑制 信号通路介导的小胶质细胞活化改善糖尿病大鼠神经病理性疼痛中国中药杂志，（）：梅世明，刘承梅针药结合治疗糖尿病周围神经病变临床研究中医学报，（）：方朝晖，吴以岭，赵进东糖尿病周围神经病变中医临床诊疗指南（年版）中医杂志，（）：林逸轩，王帆竞，李金菊，等益气活血通络方治疗糖尿病周围神经病变疗效观察中医药临床杂志，（）：李道卫，申国明，王浩，等芪归糖痛宁颗粒调节炎性因子预防糖尿病周围神经病变的机制研究安徽中医药大学学报，（）：江爱娟，申国明，王浩，等益气活血通络方对糖尿病周围神经病变大鼠背根神经节 和 表达的影响中国临床药理学与治疗学，（）：，：，（）：，（）：，（）：徐斌针药结合的科学基础及基本原则 世界针灸学会联合会，中国中医科学院，海南省卫生健康委员会“中医针灸”申遗十周年特别活动暨世界针灸学会联合会 国际针灸学术研讨会论文集海口：出版 ：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 者不详，：?：？，（）：，（）：，（）：刘鹏，马贤德，石岩复方益糖康对糖尿病大鼠 蛋白及 表达的影响中国实验方剂学杂志，（）：刘鹏，马贤德，石岩中药复方益糖康对糖尿病大鼠 蛋白及 表达的影响中华中医药学刊，（）：，：，（）：（收稿日期：）犈 犳 犳 犲 犮 狋 狅 犳犢 犻 狇 犻犎 狌 狅 狓 狌 犲犜 狅 狀 犵 犾 狌 狅犘 狉 犲 狊 犮 狉 犻 狆 狋 犻 狅 狀犆 狅 犿 犫 犻 狀 犲 犱狑 犻 狋 犺犃 犮 狌 狆 狌 狀 犮 狋 狌 狉 犲狅 狀狋 犺 犲犈 狓 狆 狉 犲 狊 狊 犻 狅 狀狅 犳犖 犪 狏 犪 狀 犱犖 犪 狏 犻 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