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实验研究 Nestin在高眼压大鼠视网膜神经胶质细胞中的表达薛黎萍 丁 鹏 吴开力 江春光 胡竹林 肖丽波 胡世兴The expression of nestin in retinal glial cells in rat hypertention eyeXue L iping,D ing Peng,W u Kaili,Jiang Chunguang,Hu Zhulin,Xiao L ibo,Hu Shixing.Departm ent ofOphthal m ology,Second Peoples Hospital of Yunnan Province,Kunm ing 650021,ChinaAbstractBackgroundElevated intraocular pressure leads to the loss of retinal ganglion cells and vigorous reaction ofretinal glial cells.The expression of nestin in retinal glial cells secondary to hypertention and its significance are unclear.ObjectiveThis study aim to investigate the expression of nestin in retinal glial cells(RGCs)in ocular hypertention rats.M ethodsThe ocular hypertention modelswere established by cauterizing the li mbus2draining veins in the right eyes of 42 SDrats,and a conjunctival incision in the left eyes of the rats served as the sham group.The intraocular pressure(I OP)wasmeasured with the Tono2Pen XL tonometer.The number of RGCs in the ratswith ocular hypertention was counted.The expressionof the nestin protein in RGCswas semi2quantitatively analyzed usingWestern blot,and the induction of the expression of nestin inMller cellswas detected by immunochemistry.Double immunofluorescence was carried out to evaluate the expression of nestin/GS or nestin/GFAP in the foot plate of Mller cells under the confocal laser scaning microscope.ResultsSignificantdifferences were found in the I OP bet ween themodel group and the sham group at various ti me points(P0105).In 1 week to 3weeks after operation,the number of RGCs significantly declined in the model group compared with the sham group(P0105).I mmunochemistry showed that from 2 hours through 1 week after operation,the expression of nestin was gradually enhanced in themodel group in comparison with the sham group.Western blot revealed that the expression of the nestin protein reflected a similartendency to that of i mmunofluorescence.The present results determined that Mller glial cells reacted vigorously to increasedintrocular pressure as manifested by the induced expression of nestin.I mmunoelectron microscopy also confirmed the inducedexpression of nestin in Mller glial cells in ocular hypertention.ConclusionThe present result suggests that the inducedexpression of nestin in Mller glial cells is a response to increased I OP.The induced expression of nestin in Mller glial cellsespecially at their end2feet suggests a potential neuroprotective mechanis m in neuronal degeneration.Nestin may be a usefulbiomarker for retinal injury study.Key wordsintraocular pressure;Mller cell;nestin;retinal ganglion cells摘要 目的 探讨第六类中间丝蛋白nestin在高眼压大鼠视网膜神经胶质细胞中的表达情况及意义。方法 42只SD大鼠采用烧灼右眼涡静脉的方法制作高眼压模型为模型组,剪开左眼结膜作为假手术组。测量并记录眼压,计数术后不同时间点视网膜神经节细胞(RGCs)数。Western blot半定量分析术后视网膜内nestin蛋白含量。免疫电镜检测nestin在高眼压大鼠视网膜Mller细胞上的诱导表达。行nestin/谷氨酰胺合成酶(GS)或nestin/胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光双标,共焦显微镜观察nestin/GFAP在Mller细胞上的表达情况。结果 术后各时间点模型组与假手术组眼压的差异有统计学意义(P0105)。术后13周模型组RGCs数量显著减少,与假手术组比较差异有统计学意义(P0105)。免疫荧光结果显示术后2 h3周,模型组nestin在Mller细胞上表达的荧光强度逐渐增强,与假手术组比较差异有统计学意义。Western blot半定量分析结果与免疫荧光染色结果一致。免疫电镜结果进一步证实眼压升高后Mller细胞上出现nestin的诱导表达。结论 Nestin在Mller细胞上的诱导表达是Mller细胞对眼压升高产生的一种反应,nestin的表达量与病程进展相一致。眼压升高时,nestin在Mller细胞上诱导表达,尤其在足板处的强烈表达,可能对RGCs具有保护作用。Nestin有望成为一种新的研究视网膜损伤的生物标记物。关键词 高眼压;Mller细胞;nestin;视网膜神经节细胞分类号 R 775 文献标识码ADO I:10.3969/j.issn.100320808.2010.03.013本课题为云南省科技厅昆明医学院联合专项基金资助(2009C135)作者单位:650021昆明,云南省第二人民医院眼科(薛黎萍、江春光、胡竹林、肖丽波);620031昆明医学院第一附属医院神经外科(丁鹏);510060广州,中山大学中山眼科中心 眼科学国家重点实验室(吴开力、胡世兴)通讯作者:吴开力(Email:)632Chin Ophthal Res,March 2010,Vol.28,No.3 青光眼是由眼压升高而引起视功能损害的一种眼病,伴随眼压的升高出现明显的视盘和视野改变。视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)在受到原始损伤后引发一系列的反应,导致RGCs的凋亡或坏死,从而引起视功能的改变。视网膜是中枢神经系统的一部分,不仅含有神经元,还含有大量的神经胶质细胞。视网膜中的神经胶质细胞,特别是Mller细胞,具有营养、支持和保护神经元的作用。青光眼RGCs的丢失和神经纤维层丧失后由Mller细胞的突起代替。正常大鼠视网膜Mller细胞不表达第三类中间丝蛋白胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidicprotein,GFAP),但眼压升高后可以在Mller细胞上出现诱导表达,这与Mller细胞发生胶质化反应及增强对压力的抵抗性有关1。另外一种中间丝蛋白nestin在视网膜中的表达情况及是否参与病理改变尚未见报道。本研究建立大鼠高眼压模型,探讨眼压升高后nestin在视网膜中的表达情况及意义,为积极采取干预措施保护原发损害后幸存的神经元以及边缘性损害的神经元以减缓病变进展提供实验依据。1 材料与方法1.1 实验动物及分组健康2月龄SD大鼠45只,雌雄不限,体重180240 g(新加坡国立大学实验动物中心提供)。实验动物均排除眼部及全身疾病,所有实验操作遵循ARVO眼科和视觉科学实验动物使用规范。其中3只鼠作为正常对照组,另外42只鼠右眼制作高眼压模型为模型组,左眼作为假手术组。实验组中18只鼠用于视网膜矢状位免疫组织化学染色,分别于术后2 h,1 d、3 d,1、2、3周取材(每组3只);18只用于Western blot定量分析,分别于术后2 h,1 d、3 d,1、2、3周取材(每组3只);3只于术后1周取材用于视网膜铺片染色;3只于术后1周取材用于免疫电镜分析。操作中尽量减少动物痛苦及意外致动物死亡。1.2 大鼠高眼压模型的制作参考Wang等1 的方法制作大鼠高眼压模型,术前测量并记录双侧眼压。剪开球结膜,暴露3条涡静脉并进行烧灼,15 min后检查血管是否复通,若复通则再次烧灼,完全成功后封闭结膜囊,结膜囊内点用氧氟沙星滴眼液。2 h后测量并记录眼压。所有大鼠右眼制作高眼压模型,左眼仅剪开结膜暴露涡静脉为假手术组。1.3 眼压的测量为检测模型制作是否成功,于术后2 h,1 d、3 d,1、2、3周进行眼压测量,眼压测量时间为9:0010:00。Tono2Pen XL手持式眼压测量仪进行眼压测量并记录,每只大鼠连续测量3次,取其平均值,3次眼压测量值之间相差 3 mmHg(1mmHg=01133 kPa)。右眼眼压较左眼眼压至少高25%则为模型制作成功。1.4 免疫组织化学染色计数RGCs3只正常大鼠和18只高眼压大鼠,分别于术后相应时间点(2 h,1 d、3 d,1、2、3周)用体积分数4%多聚甲醛灌注固定后取眼球,后固定4 h,20%蔗糖溶液4 过夜,OCT包埋后制作大鼠眼球矢状位冰冻切片,切片厚度为20m,切取部位出现视神经后随机取9片裱在明胶处理过的载玻片上,自然风干后置于-20 冰箱保存,备用。取各组切片0101 mol/L PBS洗3次,滴加正常羊血清室温孵育1 h,甩干,按照实验设计一抗为兔抗大鼠谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)(11 600)/小鼠抗大鼠nestin(1200)(美国Sigma公司),4 过夜。PBS洗3次,二抗为羊抗小鼠IgG2Cy3(1200)/羊抗兔IgG2FITC(1200)(美国Santa Cruze公司),室温暗盒中孵育1 h,PBS洗3次,封片,共焦激光显微镜(FV1000,日本Olympus公司)读片记录。为进一步验证模型制作是否成功,用神经元核抗原(neuronal nuclei,NeuN)标记RGCs并计数。取术后各时间点大鼠视网膜冰冻切片,一抗为小鼠抗大鼠NeuN(1200)(美国Sigma公司)按照SABC试剂盒(美国Santa Cruze公司)说明完成染色步骤,DAB显色,甲基绿复染,中性树胶封片,普通显微镜下读片,参照前期研究的方法取视神经颞侧1 mm处计数3个高倍镜下01173 mm长度中NeuN阳性细胞2。1.5 免疫印迹定量分析nestin蛋白的表达18只高眼压大鼠用于Western blot研究,分别于术后2 h,1 d、3 d,1、2、3周过量麻醉剂处死大鼠(每组3只),迅速摘除双侧眼球置于冰上,剪开眼球,取视网膜组织迅速置于液氮中。每个视网膜组织中加入约150L蛋白裂解液,高速研磨机上研磨30 s,4、13 000 r/min离心25 min,取上清,按蛋白定量试剂盒(美国Amsharm公司)说明测量并记录蛋白浓度。按照预实验结果以每管30g进行分装,视网膜蛋白提取液置于-70 冰箱保存,备用。将相应时间点已分装的大鼠视网膜蛋白提取液取出,加入5 上样缓冲液,95 变性5min后置于冰上,按说明书配制6%分离胶和5%浓缩胶,60V 30min后改90V 90min,使用半干转膜仪15 mA转膜170 min,将蛋白转至PVDF膜上,5%脱脂牛奶封闭1 h,TBS2T732眼科研究2010年3月第28卷第3期洗15 min3次,一抗为鼠抗nestin(150 000)(美国Sigma公司),4 过夜,TBS2T洗15 min3次,加入辣根过氧化酶的羊抗鼠IgG(120 000)(美国Santa Cruze公司)二抗室温孵育1 h,TBS2T洗15 min3次,按试剂盒(美国Amshar m公司)说明配制发光剂,将PVDF膜浸没于其中约5 min,备好显影液和定影液,X片曝光,将PVDF膜置于蛋白洗脱液中15min后取出,一抗改为小鼠抗大鼠 2actin(150 000)(美国Sigma公司),其余步骤同上。扫描仪扫描底片进行半定量分析。1.6 免疫组织化学染色检测nestin在Mller细胞的诱导表达视网膜矢状位切片染色和免疫印迹定量分析可见术后1周在Mller细胞上出现强烈的nestin诱导表达,在靠近RGCs的Mller细胞足板处表达更强烈,而假手术组在术后1周基本恢复到正常水平,因此取3只正常大鼠眼球和3只高眼压术后1周大鼠眼球行视网膜铺片染色。腹腔注射麻醉,灌注固定后取眼球,轻轻剥离视网膜,做6道放射状切口使视网膜能够平铺,与视网膜矢状位免疫组织化学染色步骤相同,一抗为兔抗大鼠GS(11 600)/小鼠抗大鼠nestin(1200)(美国Sigma公司),二抗为羊抗小鼠IgG2Cy3(1200)/羊抗兔IgG2FITC(1200)(美国Santa Cruze公司),共焦激光显微镜(FV1000,日本Olympus公司)读片记录。1.7视网膜免疫电镜检测nestin的表达为进一步验证在光镜下看到的结果,取3只术后1周高眼压大鼠行免疫电镜染色,2%多聚甲醛+3%戊二醛灌注固定后取眼球,后固定4 h,5%蔗糖溶液4 过夜。震动切片机将视网膜切成厚约150m细长条置于24孔板中。0101 mol/L PBS洗15 min3次,正常羊血清封闭1 h,一抗为鼠抗nestin(1200)(美国Sigma公司),4过夜。0101 mol/L PBS洗15min3次。羊抗鼠辣根过氧化物酶IgG(1200)(美国Santa Cruze公司)4 过夜。0101mol/L PBS洗15min3次,SABC(美国Santa Cruze公司)试剂盒中A、B混合液室温孵育1 h,含013%硫酸镍胺的DAB显色液显色15 min,显微镜下选取好的组织块,锇酸后固定,环氧树脂包埋,超薄切片,醋酸双氧铀及柠檬酸铅染色,EM208S透射电子显微镜下观察、拍照。1.8 统计学方法采用SPSS 1115统计学软件进行统计分析。检测指标的数据资料以xs表示,术后不同时间点模型组与假手 术组眼压值、RGCs计数和nestin蛋 白的Western blot半定量分析结果的比较采用配对t检验;模型组不同时间点nestin蛋白的Western blot半定量分析结果的差异比较采用单因素方差分析,组间差异的两两比较采用SNK2q检验。P0105)。正常组和假手术组的眼压基数为(171570142)mmHg。术后2 h术眼眼压迅速升至(261771168)mmHg,持续上升,至术后1 d时达到最高值,为(271101127)mmHg,为基础眼压的1155倍。随后术眼眼压逐渐下降,至术后3周,术眼眼压为(231921185)mmHg。各时间点模型组与假手术组眼压比较差异有统计学意义(P0105)(表1)。表1 手术后不同时间点模型组与假手术组眼压值的比较(xs,mmHg)Table 1Comparison of I OP between model group and sham groupin postoperation(xs,mmHg)GroupI OP in postoperation0 h2 h1 d3 d1 week2 weeks3 weeksModelSham operation171570142261771168181091198271101127171521123241871134171471193241661126171251177241130174171521126231921185161991136t121721191191121333131966151422101353P010000100001000010000100001000(Pairedttest)2.2RGCs数量的改变青光眼眼底改变的显著特点是神经纤维层变薄和RGCs数量减少,因此本研究采用单克隆抗体NeuN标记的RGCs计数并进行统计学分析。术后3 d,术眼RGCs数量未出现明显减少,与假手术组比较差异无统计学意义(t=31436,P=01284)。术后1周,RGCs数量出现明显减少,与假手术组相比差异有统计学意义(t=51866,P=01013),至术后3周,RGCs进一步减少,与假手术组差异有统计学意义(t=71601,P=01000)(图1-2)。以上结果表明本研究制作的高眼压模型所产生的病理改变接近于临床青光眼的病理改变。832Chin Ophthal Res,March 2010,Vol.28,No.3图1RGCs的NeuN标记 NeuN染色位于细胞核(箭头)A:正常对照组标记的RGCsB:术后3 d,模型组RGCs数量未出现明显减少 C:术后1周,RGCs数量明显减少 D:术后3周,RGCs进一步减少 ONL:外核层 I NL:内核层Fig.1NeuN staining of RGCs(arrow)A:Labeled RGCs byNeuN in nor mal controlB:The number of RGCswas nor mal in postoperative 3 daysC:Thenumber of RGCswas decreased in postoperative 1 weekD:The number of RGCswas decreased in postoperative 3 weeksONL:outer nuclear layerI NL:inner nuclear layer图2 术后3 d模型组与假手术组比较RGCs数量的差异无统计学意义(t=31436,P=01284);术后1周和3周,2组间RGCs数量的差异均有统计学意义(t=51866,t=71601,3P0105)Fig.2There was no significant difference in the numbers of RGCsbetween model group and sham group in postoperative 3 days(t=31436,P=01284).Significant decrease of RGCs was seen in modelgroup compared with sham group in 1 week and 3 weeks(t=51866,t=71601,3P0105)2.3Nestin在Mller细胞上的诱导表达2.3.1 视网膜矢状位免疫组织化学染色 在正常大鼠视网膜中,除一些血管成分以外,在RGCs层有极少量的nestin阳性染色。术后2 h,nestin阳性染色增加,这些nestin阳性细胞同时有GS表达,说明眼压升高后Mller细胞表达nestin。术后1 d、3 d,nestin的表达显著增加,至术后1周,nestin的表达量达高峰。术后13周,nestin的表达一直保持较高水平。部分nestin阳性细胞的纤维贯穿视网膜全层。在RGCs层,Mller细胞足板和星形胶质细胞纤维交织处,nestin的表达更强烈。在视网膜的内侧RGCs层的nestin阳性纤维明显肥大,交织在一起,结合免疫荧光双标染色结果和nestin阳性细胞形态,可以认定这些nestin阳性细胞是Mller细胞,nestin仅在Mller细胞的细胞质中表达,在细胞核中不表达。模型组nestin表达增加,术后2 h3 d假手术组nestin的表达也出现轻度增加,术后1周假手术组nestin的表达即恢复到正常水平(图3)。2.3.2Western blot检测 结果显示nestin为一相对分子质量约220 000的蛋白条带。整个实验过程中,在30g/孔视网膜蛋白水平上,假手术组均未出现肉眼可见的nestin蛋白条带(图4A)。术后2 h术眼nestin蛋白量较假手术组未出现明显差异,术后1 d才出现可见的差异,其染色强度是对照组的(11290114)倍。术后3 d开始术眼nestin蛋白表达量明显增加,术后2 d,1、2、3周分别为对照组的(11630115)、(11780114)、(11790118)、(11770113)倍(图4B)。Western blot结果与免疫荧光双标结果吻合。2.3.3 视网膜铺片免疫组织化学染色 正常大鼠视网膜表达GFAP的星形胶质细胞位于RGCs层和神经纤维层,构成比较规则的网状结构,在视网膜铺片中看不到Mller细胞的全貌,仅能看到内侧足板,位于星形胶质细胞纤维构成的网状结构中,呈点状分布。在Mller细胞足板和星形胶质细胞无nestin表达,仅在一些血管组织上检测到nestin的微弱表达。术后1周,Mller细胞的足板出现GFAP和nestin表达,星形胶质细胞无nestin表达(图5)。2.3.4 免疫电镜检查 术后1周眼压升高后nestin在Mller细胞细胞质中诱导表达,但细胞核中无表达(图6),与光镜结果一致。932眼科研究2010年3月第28卷第3期图3 高眼压模型术后不同时间点nestin在Mller细胞上的诱导表达 A:正常大鼠视网膜可见GS标记的Mller细胞,表现为绿色荧光(箭头),nestin仅在一些血管上有微弱的表达,表现为红色荧光(箭头)B:假手术组术后2 h nestin的表达有轻度增加 C:模型组nestin的表达在术后2 h即出现中度增加 D:模型组术后1 d nestin表达进一步增加 E:假手术组术后3 d nestin的表达轻度增加 F:模型组术后3 d nestin的表达显著增加 G:假手术组术后1周nestin的表达减少 H:模型组术后1周nestin的表达达高峰 I:模型组nestin的表达持续到术后3周 a:GSb:nestinc:GS和nestin双标 RPE:视网膜色素上皮 ONL:外核层 OPL:外丛状层 I NL:内核层 IPL:内丛状层 RGCs layer:神经节细胞层 NFL:神经纤维层Fig.3The induced expression of nestin in Mller glial cells subjected to hypertentionA:In normal retina,GS2labeled Mller glial cells present greenfluorescence(arrows).Nestin immunoreactivity is veryweak in vessel tissue,showing the red fluorescence(arrow)B:In the retina of sham operated controleyes,nestin expression is lightly increased on 2 hours afteroperationC:In the retina ofmodel eyes,nestin expression ismoderately increased on 2 hoursD:Inthe retina ofmodel eyes,nestin expression ismoderately increased on 1 dayE:In the retina of sham control eyes,nestin expression is lightly increased on 3 daysafter operationF:In the retina ofmodel eyes,nestin expression ismarkedly increased on 3 daysG:In the retina of sham control eyes,nestin expression returnalmost normal in 1 weekH:In the retina of model eyes,nestin expression is extremely intense and peak in 1 weekI:In the retina of model eyes,nestinexpression remains strongly till 3 weeksRPE:retinal pigment epitheliumONL:outer nuclear layerOPL:outer plexifor m layerI NL:inner nuclear layerIPL:inner plexiform layerRGCs layer:ganglion cells layerNFL:nerve fiber layer3 讨论Mller细胞是视网膜中主要的神经胶质细胞,胞体位于内核层,其细长的突起贯穿视网膜全层,足板与RGCs关系密切并构成内界膜。Mller细胞对维持视网膜的正常功能起重要作用,在病理情况下会发生一系列反应。Mller细胞对神经元损伤、变性和再生所产生的一系列反应已有报道3-5。在这些情况下,Mller细胞会通过改变中间丝蛋白产物产生一系列胶质化反应6。正常情况下Mller细胞不表达GFAP1,7。GFAP是位于RGCs层和神经纤维层的星形胶质细胞的标记物。在缺血8、慢性缺氧9、光损伤10、视网膜脱离11 等病理情况下,可以在Mller细胞上诱导出强烈的GFAP表达,因此,有研究将GFAP作为视网膜损伤的一种生物标记物用于基础研究。本研究用视网膜铺片的方法证明了这一点。除了GFAP,nestin是另外一类中间丝蛋白,近年来被广泛应用于神经干细胞的研究,用来作为神经干细胞/神经前体细胞的标记物,分化成熟的神经元不表达nestin12。Walcott等13 在视网膜中发现了nestin阳性细胞,认为这些nestin阳性细胞是视网膜前体细042Chin Ophthal Res,March 2010,Vol.28,No.3图4 模型组术后不同时间点nestin蛋白的W estern blot半定量分析 A:Nestin为一相对分子质量约220 000的蛋白条带,假手术组各时间点均未出现肉眼可辨的nestin蛋白条带 B:模型组术后2 h nestin蛋白量较假手术组未出现明显的差异,术后1 d才出现可见的差异。从术后3 d开始,术眼nestin蛋白表达量均明显增加,与对照组比较差异均有统计学意义(F=111314,P0105)Fig.4Western blot analysis of nestin protein in retina in model groupcompared with sham groupA:Western blots displayed distinct protein bandswith an anticipated molecular weight about 220 0001Protein levels were almostnot detected in all sham groupsB:Therewas no significant difference of nestinexpression in model eyes compared with sham group at 2 hours after operation.Nestin protein showed visible increase on 1 day after operation.It is noticeablyincreased from 3 day through 3 weeks after operation.Significant difference wasseen inmodel group comparedwith sham group from 1 day through 3 weeks afteroperation(F=111314,P0105)图5Nestin和GFAP在视网膜铺片上的表达 Aa:正常组大鼠视网膜Mller细胞不表达GFAPAb:正常组大鼠视网膜Mller细胞不表达nestin(箭头)Ac:Aa和Ab的融合图像 Ba:模型组术后1周Mller细胞的足板出现GFAP的诱导表达 Bb:模型组术后1周Mller细胞的足板出现nestin的诱导表达(箭头)Bc:Ba和Bb的融合图像,显示术后1周Mller细胞的足板上出现2种蛋白(nestin/GFAP)的诱导表达(箭头)(标尺=50m)图6 免疫电镜下模型组术后1周nestin染色结果 A:可见细长的nestin阳性纤维(箭头)(标尺=5m)B:阳性染色位于Mller细胞细长的突起中,而细胞核无阳性表达(标尺=2m)Fig.5The expression of nestin and GFAP in whole2mounted retinaeAa:GFAP was absent expressed in Mller cells in normal ratAb:Nestin was absentexpressed inMller cells of normal rat(arrow)Ac:the merge image of Aa and AbBa:At 1 week after operation,GFAP expression was induced in Mllerglial cells end2feetBb:At 1 week after operation,nestin expression was induced in Mller glial cells end2feet(arrow)Bc:The merge image of Ba and Bbshowed that nestin and GFAP are concurrently induced in Mller glial cell end2feet(arrow)(bar=50m)Fig.6The result of nestin staining inpostoperative 1 week under the immunoelectron microscopeA:Positive nestin stainingwas found(arrows)(bar=5m)B:The positive staining located inthe processus ofMller cells(bar=2m)胞。成熟的哺乳动物视网膜中nestin阳性的视网膜干细胞主要位于睫状体无色素上皮处且数量极少14-15。本研究发现成年大鼠视网膜中未见nestin表达,但在成功制作高眼压模型后,出现了nestin的诱导表达,免疫荧光双标显示这些nestin阳性细胞同时表达Mller细胞的标记物GS,从数量上来看,本研究结果显示这些nestin阳性细胞是神经干细胞。Kohno等16最近也报道激光损伤视网膜后在Mller细胞上出现nestin的诱导表达。Fischer等17研究发现另外一种与nestin属于同一类的抗体transitin,成年鸡眼玻璃体腔注射NMDA后可以在Mller细胞上诱导出transitin的表达。综上所述,nestin不仅可以在神经干/神经前体细142眼科研究2010年3月第28卷第3期胞表达,在视网膜损伤时也可以在Mller细胞表达,因此将nestin作为神经干细胞的标记物需要进一步探讨。同时本研究在视网膜铺片中发现,同属于神经胶质细胞的星形胶质细胞在视网膜损伤后并不表达nestin。眼压升高后,Mller细胞上nestin诱导表达的变化趋势与RGCs的受损相一致,Mller细胞的反应早于RGCs的改变,而且反应更强烈。免疫组织化学染色和Western blot结果均显示,术后3 d时nestin和GFAP在Mller细胞上诱导表达均明显升高,此时RGCs的数量与对照组相比差异无统计学意义,直到术后1周才出现明显减少。Mller细胞对视网膜损伤这种高敏感、早反应性可能具有视网膜保护作用,另一方面,它也可能感受到周围微环境的改变而发出神经变性的信号。目前可以肯定的是nestin和GFAP在Mller细胞上的诱导表达是对视网膜损伤的一种反应性改变,其确切意义需进一步探讨。Nestin是视网膜损伤一个潜在的、非常有用的标记物:其作为中间丝蛋白的一种构成细胞骨架,非常容易识别;并且视网膜损伤后,nestin在Mller细胞上的诱导表达快速而且强烈。本研究结果显示,眼压升高可以诱导Mller细胞表达GFAP和nestin,至术后3周一直保持在较高水平,其机制和意义有待进一步探讨。Nestin和GFAP一样可以作为视网膜损伤的生物标记物用于基础研究。(志谢:感谢新加坡国立大学解剖学系林荣安教授对实验过程给予的指导)参考文献1Wang X,Tay SS,Ng YK.An immunohistochemical study of neuronaland glial cell reactions in retinae of rats with experimental glaucomaJ.Exp Brain Res,2000,132(4)476-4842Xue LP,Lu J,Cao Q,et al.Nestin expression in Mller glial cells inpostnatal rat retina and its upregulation followingoptic nerve transectionJ.Neuroscience,2006,143(1)117-1273Battisti WP,Wang J,Bozek K,et al.Macrophages,microglia,andastrocytes are rapidly activ