表达PEDV S蛋白重组仙台病毒的构建及其免疫原性研究.pdf

报（农业与生2023，44（4):43-5 0.6 7.慧，潘朔楠，等：表达PEDVS蛋白重组仙台病毒的构建及其免疫原性研究J.扬州大学学引文格式：邹静娴，孟Jul.2023Journal of Yangzhou University(Agricultural and Life Science Edition)2023年7 月Vol.44.No.4扬州大学学报生命科学版）第44卷第4期DOI:10.16872/ki.1671-4652.2023.04.06表达PEDVS蛋白重组仙台病毒的构建及其免疫原性研究邹静娴，孟慧，潘朔楠，陈振海12，牟春晓1，2*（1.扬州大学兽医学院，江苏扬州2 2 50 0 9；2.扬州大学江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州2 2 50 0 9）摘要：为构建表达猪流行性腹泻病毒（PEDV）S蛋白的重组仙台病毒（SeV），并评价其诱导的特异性免疫应答反应，利用PCR扩增得到PEDV中国流行株的全长S基因，构建含S基因的重组仙台病毒感染性克隆质粒（pBeloBAC-SeV-PEDV-S)，并拯救重组病毒SeV-PEDV-S。对重组病毒进行鉴定并测定其生长曲线以确定成功获得表达PEDVS蛋白的重组仙台病毒。将表达S蛋白的仙台病毒免疫小鼠；间接免疫荧光和Westernblot试验检测血清中特异性抗体的产生；利用脾脏淋巴细胞分离和流式细胞技术检测特异性T淋巴细胞增殖反应；对血清中的中和抗体效价进行评价。结果表明：重组仙台病毒能特异性表达PEDVS蛋白，且与野生型仙台病毒有一致的生长曲线；免疫小鼠后，重组仙台病毒能有效刺激小鼠产生特异性抗体，诱导较高的中和抗体水平，且能显著促进PEDV特异性T淋巴细胞增殖。综上，该试验为进一步研究重组仙台病毒在猪体上的免疫反应奠定了基础，也为新一代安全有效的PEDV活载体疫苗的研发提供了策略。关键词：猪流行性腹泻；S蛋白；重组仙台病毒；免疫原性中图分类号：S858.28文献标志码：A文章编号：16 7 1-46 52（2 0 2 30 4-0 0 43-0 8Construction and immunogenicity of a recombinant Sendaivirus expressing S protein of PEDVZOU Jingxian,MENG Hui,PAN Shuonan,CHEN Zhenhail.?,MOU Chunxiaol.?(1.College of Veterinary Medicine,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China;2.Jiangsu Co-Innovation Center for Prevention and Control of Important AnimalDiseases and Zoonosis,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China)ABSTRACT:To construct the recombinant Sendai virus(SeV)expressing S protein of porcine epidemic diarrhea virus(PEDV)and evaluate the immunogenicity of this recombinant virus.The full length S gene of PEDV was amplified andcloned into the plasmid pBeloBAC-SeV to get pBeloBAC-SeV-PEDV-S,and then the recombinant virus SeV-PEDV-S wasrescued.The recombinant virus was identified and the growth curve was determined.After the mice immunized with SeV-PEDV-S,the specific antibody of PEDV in serum was detected by indirect immunofluorescence and Western blot.Theproliferation of PEDV specific T lymphocyte was analyzed through spleen lymphocyte isolation and flow cytometry.In ad-dition,the neutralizing antibody titer in serum was also evaluated.The results showed that the recombinant virus SeV-PEDV-S had the similar growth curve with the wild SeV.SeV-PEDV-S effectively stimulated the PEDV specific antibod-ies,induced a high level of neutralizing antibody titers,and significantly promoted the proliferation of PEDV specific Tlymphocytes in the mice.This study provided the theoretical basis for further research on the immune response of SeV-PEDV-S in pigs,and also provided strategies for the development of safe and effective PEDV live vector vaccine.KEY WORDS:porcine epidemic diarrhea;S protein;recombinant Sendai virus;immunogenicity收稿日期：2 0 2 3-0 1-0 4基金项目：江苏省农业科技自主创新资金项目CX(21)2014；广西重点研发计划项目（桂科AB21238003；江苏省高校优势学科建设工程项目（PAPD）。作者简介：邹静娴（2 0 0 1一），女，江苏镇江人，扬州大学学生，主要从事猪病毒学研究。*通信作者，牟春晓，扬州大学讲师、硕导，主要从事猪病毒学研究；E-mail：y t q x mc x 16 3.c o m。44第44卷扬州大学学报（农业商生命科学版）猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PED V）是一种肠道冠状病毒，能引起感染猪严重呕吐、水样腹泻、脱水等症状。各年龄段猪均易感PEDV，感染仔猪后发病急，病死率高达100%。197 0 年在欧洲首先发现PEDVG1型2 ，2 0 10 年一种高致病性PEDV突变体（G2型）在中国出现，随后快速传播至北美、欧洲和亚洲等许多国家3。目前，变异PEDV已成为导致仔猪腹泻和高病死率的主要病原体，给全球养猪业造成重大经济损失。PEDVORF2编码的纤突糖蛋白（spike，S)属于亚稳态的I类融合蛋白，主要负责病毒与宿主细胞的吸附和膜融合，包括受体结合片段S1（17 8 9a a）和膜融合片段S2（7 90 138 3a a）2 个部分。S1包含优势抗原COE区域（4996 38 aa)及2 个B淋巴细胞位点（7 447 55和7 56 7 7 1aa），S2 的胞外区有胰酶切割位点4。S蛋白在与宿主细胞受体的相互作用以及进入宿主细胞的过程中发挥着重要作用，还与病毒的体外适应性生长及体内毒力衰减密切相关5。更重要的是，S蛋白是诱导机体发生中和抗体反应的关键蛋白，因此S蛋白是设计开发PEDV疫苗的首选抗原蛋白。2011年以来，我国大部分地区的猪场大规模暴发PED，新生仔猪病死率达90%以上，说明以CV777毒株为基础的商品化PEDV灭活、弱毒等传统疫苗和免疫方式难以控制变异株的流行。因此，利用基因工程技术研发新型疫苗成为当前的热点。随着哺乳动物细胞中的基因传递和表达技术在现代生物学中的广泛应用，先进的基因传递工具，如反转录病毒载体、腺病毒载体和阳离子脂质试剂等，对基因治疗和核酸疫苗起到重要的推动作用6 。尽管目前已开发出多种DNA载体复合物，但重组病毒载体因为其基因表达能力强和感染宿主效果好等优势，仍是传递靶标基因的主要选择。仙台病毒（Sendai virus，Se V)又称乙型副流感病毒，属于副黏病毒属，1953年在日本分离获得。近年来学者对仙台病毒在细胞生物学和工业上有着广泛的研究，发现仙台病毒能作为重组病毒载体用于核酸疫苗的研发。仙台病毒作为病毒载体的优势在于免疫原性强；与细胞表面受体的识别、吸附、融合时间短，感染过程不受细胞周期的影响；外源基因表达效率高且可调控；病毒复制周期完全在胞质中，安全性高；基因组为不分节段的单股负链RNA，重组概率大大降低；可在多种宿主的组织中表达6 。目前，应用反向遗传学技术开发的新一代仙台病毒载体，不仅可进一步提高载体的安全性，还可增加载体的容量，降低机体抗病毒免疫反应。另外，仙台病毒经呼吸道黏膜感染，能诱导良好的黏膜免疫反应，由于机体的“共同黏膜免疫系统”，使得仙台病毒更适合作为黏膜免疫的重组疫苗载体，有效地抵抗黏膜感染的病毒。本研究拟将PEDV流行株S蛋白全长基因插人仙台病毒基因组P基因与M基因之间，构建能表达PEDVS蛋白的重组仙台病毒；利用大肠埃希菌原核表达纯化PEDV截短S蛋白（6 41140 bp）作为对照，以小鼠为模型评价并比较重组仙台病毒表达和大肠埃希菌表达的S蛋白所诱导的PEDV特异性免疫反应，为评价该重组仙台病毒在猪体上的免疫原性和免疫效力奠定基础。1材料与方法1.1供试材料1.1.1质粒、细胞、病毒和试验动物原核表达载体pET-30（a）、仙台病毒（SeV）载体系统包括病毒基因组骨架载体pBeloBAC-SeV以及辅助质粒pCAGGS-T7-opt、p CA G G S-Se V-NP、p CA G G S-Se V-P、p CA G G S-Se V-L和对照质粒pBeloBAC-SeV-GFP为本实验室保存；猪睾丸细胞（ST）、乳仓鼠肾细胞（BHK-21）和非洲绿猴肾细胞（Ve r o)由本实验室保存；E.coliTop10和BL21(DE3）感受态细胞由本实验室制备并保存；PEDV-GX6/2021毒株（GenBank登录号为OP603897）、Se V毒株为本实验室保存；6 周龄BALB/c小鼠购自扬州大学比较医学中心1.1.2主要试剂病毒RNA提取试剂盒、DNA聚合酶PrimeStar Max、T 4D NA 连接酶和限制性内切酶等为日本TaKaRa公司产品；反转录试剂盒为北京全式金生物技术公司产品；PCR纯化试剂盒、胶回收试剂盒45邹静娴等：表达PEDVS蛋白重组仙台病毒的构建及其免疫原性研究第4期和质粒提取试剂盒均为美国Omega公司产品；超敏ECL化学发光试剂盒为苏州新赛美生物科技公司产品；His单克隆抗体、HRP标记的羊抗鼠IgG抗体、Dylight488标记的羊抗鼠IgG抗体为上海生工生物工程公司产品；DMEM培养基和胎牛血清均为美国Gibco公司产品；Lipofectamine30oo和CFSE荧光染料为美国Invitrogen公司产品；RIPA组织细胞裂解液、IPTG、淋巴细胞分离液、脱脂牛奶等为北京索莱宝生物科技公司产品；PVDF膜和弗氏佐剂为美国Sigma公司产品；SeVP蛋白单克隆抗体、PEDVS蛋白单克隆抗体为本实验室保存。1.2引物的设计与合成根据PEDV-GX6/2021毒株全基因序列，设计扩增截短的PEDVS基因（6 41140 bp）的特异性引物，引物F1为5-CTGGGATCCGATGTCACCAGGTGCTCAG-3，引物R1为5-CCGGGAATTCGTAAGTGTCACTTTAAG-3，在上游引物5 端引人酶切位点BamHI，在下游引物5 端引人酶切位点EcoRI，用于构建原核表达S蛋白的重组质粒；另设计扩增全长PEDVS基因（4140 bp)的特异性引物，引物F2为5-GCTTTCACGGCGCGCCACCATGAAGTCTTTAACCTACTTCTGGTTGTTCTTACC-3，引物R2为5-AGGATGGGACGTCTTAAACTTCGTAAGGTTGAAGTCTAGGAC-3,在上游引物5 端引人酶切位点AscI，在下游引物5 端引人酶切位点Aat，用于构建重组表达S蛋白的SeV感染性克隆质粒。引物由上海生工生物工程公司合成。1.3原核表达PEDVS蛋白重组质粒的构建使用病毒RNA提取试剂盒提取PEDV-GX6/2021毒株全基因组RNA，并将其反转录成cDNA。以该cDNA为模板、F1和R1为引物PCR扩增截短的S基因。将扩增的S基因进行胶回收纯化，利用酶切位点BamHI和EcoRI连人载体pET-30（a），构建重组质粒pET-30（a)-PED V-S，PCR鉴定和序列测定验证后保存备用。1.4原核表达PEDVS蛋白诱导表达与纯化将重组质粒pET-30（a)-PED V-S转化至BL21（D E3）感受态细胞中，挑取单菌落培养过夜，按照1：10 0 的比例扩大培养，当细菌D600mm值达到0.40.6 时，加人0.2 mmolL-1IPTG于16 诱导培养2 0 h；50 0 0 r min-1离心10 min收集菌体并超声破碎，分别收集全菌、上清、沉淀，加人5蛋白质电泳缓冲液煮沸，经SDS-PAGE检测，验证S蛋白表达位置及可溶性，同时设置pET-30(a)空载体作为阴性对照。将收集的重组蛋白样品进一步切胶纯化，SDS-PAGE电泳后将蛋白胶转至预冷的KCI溶液（0.2 5m m o l L-1）中5min，使蛋白质条带呈现白色。根据先前实验室确定的S蛋白表达的位置，切下含目的蛋白的胶条与PBS溶液混合装入透析袋中，SDS-PAGE电泳液进行电洗脱，3h后去掉胶块，上清装入透析袋中并透析过夜。次日，检测原核表达的S蛋白浓度并浓缩至1mgmL-1。同时取少量纯化后的蛋白质进行SDS-PAGE电泳检测蛋白质纯度。1.5重组仙台病毒感染性克隆的构建以方法1.3中获得的PEDVcDNA为模板，F2和R2为引物进行PCR扩增全长S基因。将扩增的S基因进行胶回收纯化，用AscI和AatI对S基因片段和载体pBeloBAC-SeV进行双酶切，并用T4DNA连接酶构建重组SeV感染性克隆质粒pBeloBAC-SeV-PEDV-S，PCR鉴定和序列测定验证后保存备用。1.6重组仙台病毒的拯救与鉴定将pBeloBAC-SeV-PEDV-S及其辅助质粒，按pCAGGS-T7-opt 0.4g、p CA G G S-Se V-NP0.2 g、pCAGGS-SeV-P 0.2 g、p CA G G S-Se V-L 0.6 g、p Be l o BA C-Se V-PED V-S 1.1 g 的比例,利用 Lipo-fectamine3000转染至BHK-21细胞中，同时设置转染pBeloBAC-SeV-GFP及辅助质粒作为阳性对照；37、5%CO，培养至阳性对照细胞出现明显的绿色荧光时，收获转染pBeloBAC-SeV-PEDV-S的细胞上清，获得SeV-PEDV-S重组病毒。将重组病毒 SeV-PEDV-S进一步感染ST细胞，并设置未感染病毒的细胞为对照，37、5%CO246第44卷扬州大学学报（农业与生命科学版）培养，观察细胞病变并进行间接免疫荧光染色（IFA）。细胞单层用4%多聚甲醛进行室温固定10 min，PBS清洗后，将0.2%TritonX-100和4%BSA按1：1的比例混匀加人细胞单层进行细胞膜打孔和封闭孵育30 min；随后，运用SeVP蛋白单克隆抗体作为一抗37 孵育1h，D y l i g h t 48 8 标记羊抗鼠IgG作为二抗室温避光孵育1h；最后使用倒置荧光显微镜观察绿色荧光，以检测重组病毒SeV-PEDV-S是否成功拯救。1.7重组仙台病毒生长曲线的测定将ST细胞铺于6 孔板中，以MOI=0.01分别感染SeV和SeV-PEDV-S，同时设置未接毒细胞作为对照；置于37、5%CO，条件下孵育2 h后，弃去上清并加人含2%血清的培养基；继续培养6、12、2 4、36、48、6 0 h，分别收集病毒液并进行病毒效价测定，将ST细胞铺于96 孔板中，收集的病毒液用含2%血清的培养基梯度稀释后感染ST细胞，每孔10 0 L，每个梯度设置4个重复；置于37、5%CO2条件下孵育2 h，每孔补加50 L含2%血清的培养基继续培养；观察细胞病变情况并标记，按照Karber法计算病毒效价1.8PEDVS蛋白表达的勺Westernblot鉴定将重组病毒SeV-PEDV-S感染ST细胞，并设置未接毒细胞作为对照，37、5%COz培养48 h后，RIPA缓冲液裂解细胞，取上清进行SDS-PAGE电泳。将分离胶的蛋白质电转移至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，T BST 清洗后，以PEDVS蛋白单克隆抗体作为一抗孵育过夜，HRP标记羊抗鼠IgG作为二抗室温孵育2 h，最后使用超敏ECL化学发光试剂盒进行显影，观察条带。取纯化后的原核表达S蛋白进行SDS-PAGE电泳，同时设置对照。按照上述Westernblot试验方法，以S蛋白单克隆抗体作为一抗，HRP标记羊抗鼠IgG作为二抗检测原核表达S蛋白的特异性。1.9小鼠的免疫与抗S蛋白特异性抗体的鉴定取36 只6 周龄BALB/c雌性小鼠，随机均分为4组，分别以滴鼻和每只皮下注射2 50 L的方式免疫SeV-PEDV-S组(10 6.2 TCIDsomL-1)、Se V组(10 TCIDsomL-1)）、PED V-S蛋白组(1mgmL-1+弗氏佐剂和DMEM组。首免后第3、5周分别加强免疫。第3次免疫后10 d对各组小鼠进行采血，并运用分离的血清作为一抗进行IFA和Westernblot试验，鉴定小鼠血清中特异性抗体产生情况。以方法1.6 中IFA试验鉴定小鼠血清中特异性抗体的产生情况，PEDV按MOI=0.05感染Vero细胞，48 h后弃去培养基，以小鼠血清作为一抗（1：2 0 0 稀释），Dylight488标记羊抗鼠IgG作为二抗分别进行孵育，最后观察特异性绿色荧光。以分离的SeV-PEDV-S组小鼠血清作为一抗，HRP标记羊抗鼠IgG作为二抗，以方法1.7 中Westernblot试验检测血清中特异性抗体的产生情况1.10免疫后小鼠血清中和抗体的测定对第3次免疫后10 d的小鼠血清进行中和抗体滴度测定，将PEDV（10 0 T C I D s o）与倍比稀释的血清等体积混合，37 作用1h后加到96 孔板培养的Vero细胞单层上，37、5%CO，吸附2 h后弃去上清，加入正常培养基继续培养2 3d；显微镜下观察并记录病变产生情况，血清抗体中和PEDV的滴度按照Karber方法计算。1.11免疫后小鼠T淋巴细胞增殖的检测第3次免疫后10 d每组选取5只小鼠，处死并无菌分离小鼠脾脏，并研磨成单细胞悬液，利用淋巴细胞分离液分离T淋巴细胞并计数。按照10 7 个mL-1的浓度加人CFSE荧光染色液，37 避光孵育10 min，随后加人预冷且含10%血清的培养基终止染色反应，PBS清洗后获得绿色荧光标记的T淋巴细胞。分别向每个免疫组的T淋巴细胞中加人10 5TCIDs。的PEDV，置于37、5%CO2条件下培养45d，收集细胞并用流式细胞术检测每组中T淋巴细胞的增殖情况。采用FCSExpress4软件对流式细胞检测数据进行分析。1.12统计学分析所有试验数据均采用双尾t检验进行统计分析，数据以土SD表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。异47邹静娴等：表达PEDVS蛋白重组仙台病毒的构建及其免疫原性研究第4期2结果与分析2.1原核表达PEDVS蛋白重组质粒的鉴定使用S基因特异性引物，以PEDVcDNA为模板，成功扩增出目的基因片段10 7 7 bp（图1）。将该片段克隆至pET-30（a）载体中，构建重组质粒pET-30（a)-PED V-S，酶切重组质粒鉴定，根据核酸电泳结果，得到了重组质粒（图1）。2.2原核表达PEDVS蛋白的表达纯化与鉴定重组质粒pET-30（a）-PED V-S转化至感受态细胞BL21(DE3）中，使用IPTG低温诱导蛋白表达，收集细菌并超声破碎。根据SDS-PAGE电泳结果可以发现，截短的S蛋白主要在细菌裂解沉淀中表达，蛋白质大小约为39.3ku，融合6 XHis标签后大小约为45ku，符合预期结果。经过切胶纯化后，获得纯度和浓度较高的重组PEDVS蛋白（图2.A）。对原核表达S蛋白的特异性进行West-ernblot检测，结果发现，原核表达S蛋白泳道出现特M11M223bpbp20001500500010007501500750图1原核表达PEDVS蛋白重组质粒的构建*Fig.1The construction of recombinantplasmidpET-30(a)-PEDV-S*M1.DL2000DNA分子量标准，1.截短S基因PCR扩增；M2.DL5000DNA分子量标准，2.重组质粒pET-30（a）-PEDV-S酶切鉴定，3.重组质粒pET-30(a)-PEDV-S电泳鉴定。*Ml.DL2000 DNA marker,1.PCR amplification of trun-cated S gene;M2.DL5000 DNA marker,2.identification ofpET-30(a)-PEDV-S by reconstriction enzymes,3.identification ofpET-30(a)-PEDV-S by agarose gel electrophoresis.条带，融合蛋白分子量约为45ku，符合预期结果，而对照样品泳道中未出现特异条带（图2.B）。AM1234567BM12kuku606045453535图2 原原核表达PEDVS蛋白的表达纯化与鉴定Fig.2 The expression,purification,and identification of PEDV S protein*A图中，M.蛋白质分子量标准，1.pET-30（a)全菌，2.pET-30a)上清，3.pET-30(a)沉淀，4.pET-30（a)-PED V-S全菌，5.pET-30（a)-PED V-S上清，6.pET-30（a)-PED V-S沉淀，7.纯化的S蛋白；B图中，M.蛋白质分子量标准，1.BL21DE3）上清，2.纯化的S蛋白。*InfigureA，M.p r o t e i n m a r k e r，1.p ET-30(a)whole cell,2.pET-30(a)supernatant,3.pET-30(a)precipitation,4.pET-30(a)-PEDV-S whole cell,5.pET-30(a)-PEDV-S supernatant,6.pET-30(a)-PEDV-S precipitation,7.purified S protein;In figure B,M.Protein marker,1.BL21(DE3)supernatant,2.purified S protein.2.3重组仙台病毒感染性克隆的鉴定将扩增得到的全长S基因克隆于pBeloBAC-SeV，构建重组质粒pBeloBAC-SeV-PEDV-S并进行PCR扩增鉴定重组质粒。根据核酸电泳结果，成功扩增出4140 bp的S基因片段（图3.B），鉴定发现，成功得到重组质粒pBeloBAC-SeV-PEDV-S（图3.C）。2.4重组仙台病毒的鉴定为获得SeV-PEDV-S重组病毒，将pBeloBAC-SeV-PEDV-S及其辅助质粒按比例转染细胞，同时转染pBeloBAC-SeV-GFP和辅助质粒作为阳性对照。逐日观察阳性对照的绿色荧光强度，结果发现第4天阳性对照有明显的绿色荧光，收集转染pBeloBAC-SeV-PEDV-S的细胞上清接种ST细胞，经观察转染pBeloBAC-SeV-PEDV-S的细胞上清能引起细胞病变，且IFA检测有特异性荧光，而对照细胞中未出现特异性荧光和细胞病变（图4.A），说明成功获得SeV-PEDV-S重组病毒。运用Westernblot试验对SeV-PEDV-S重组病毒中S蛋白的特异性进行检测，结果发现，SeV-PEDV-S重组病毒感染的细胞样品泳道出现特异条带，分子量约为18 0 ku，而对照样品泳道中未出现特异条带（图4.B)。通过且毒价48第44卷扬州大学学报（农业与生命科学版）3leader-NPPMFHM-5trailerAPEDVSBM11CM223bpbp25.000TsOpC17terminstor1500050007500SODB3000500020002.50020.000PEDV-S115.000图3童重组仙台病毒感染性克隆的构建与鉴定Fig.3The construction and identification of the recombinant SeV plasmid*A图中，重组质粒pBeloBAC-SeV-PEDV-S构建示意图；B图中，M1.DL5000DNA分子量标准，1.全长S基因PCR扩增（4140 bp)；C图中，M2.DL15000DNA分子量标准，2.重组质粒pBeloBAC-SeV-PEDV-S电泳鉴定，3.重组质粒pBeloBAC-SeV-PEDV-S 的 PCR 鉴定。*In figure A,the construction diagram of recombinant plasmid pBeloBAC-SeV-PEDV-S;In figure B,M1.DL5000 DNA marker,1.PCR amplification of S gene(4 140 bp);In figure C,M2.DL15000 DNA marker,2.identification of pBeloBAC-SeV-PEDV-S by agarose gel electrophoresis,3.identification of pBeloBAC-SeV-PEDV-S by PCR.对重组仙台病毒生长曲线的测定，发现该SeV-PEDV-S重组病毒与野生型SeV生长趋势一致，为 10 6.2 TCID5o mL-1(图 4.C)BM12AmockSeV-PEDV-Sku18014010075C8-SeV-SeV-PEDV-S642061224364860时间time/h图4重组仙台病毒的鉴定和生长曲线的测定Fig.4The determination and growth curve of recombinant Sev*A.SeV-PEDV-S感染后的细胞病变观察和IFA鉴定，标尺为50 m；B.W e s t e r n b l o t 试验检测SeV-PEDV-S中S蛋白的表达，M.蛋白质分子量标准，1.SeV感染的ST细胞样品，2.SeV-PEDV-S感染的ST细胞样品；C.重组仙台病毒的生长曲线测定。*A.thecytopathological observation and IFAidentification afterSeV-PEDV-S infection,bar is 50 m;B.detection of S protein expression in SeV-PEDV-S by Western blot,M.pro-tein marker,1.SeV infected ST cells,2.SeV-PEDV-S infected ST cells;C.the growth curve of recombinant SeV.2.5免疫后小鼠血清特异性抗体的产生以各免疫组小鼠第3次免疫10 Od后采集的血清作为一抗，对PEDV感染的Vero细胞进行IFA和Westernblot试验，以验证各组免疫后小鼠体内是否产生S蛋白的特异性抗体，结果发现，SeV-PEDV-S免疫的小鼠血清作为一抗，在IFA和Westernblot试验中均具有较好的特异性（图5.A、B）。PED V-S49邹静娴等：表达PEDVS蛋白重组仙台病毒的构建及其免疫原性研究第4期蛋白组血清在IFA试验中出现特异性荧光（图5.A），而其他免疫组的小鼠血清均没有特异性荧光和特异性条带出现。这说明SeV-PEDV-S免疫能显著的诱导小鼠产生抗PEDVS蛋白的特异性抗体。2.6免疫后小鼠血清中和抗体效价的评价为比较不同组免疫小鼠产生的抗S蛋白抗体对流行毒株PEDV-GX6/2021的中和活性，对第3次免疫后10 d的小鼠血清中和抗体滴度进行测定，结果显示，SeV-PEDV-S免疫组血清对PEDV-GX6/2021毒株有中和作用，平均中和滴度为1：8 0，而其他免疫组血清均没有中和活性（图6），说明SeV-PEDV-S诱导小鼠产生的抗PEDVS蛋白的特异性抗体能有效地发挥中和活性。2.7免疫后小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖ADMEMSeVBkuM1218014010075SeV-PEDV-SPEDV-S图5免疫后小鼠血清中特异性抗体的检测Fig.5The anti-PEDV S antibody in immunized mice*A.IFA试验鉴定血清中特异性抗体，标尺为50 m；B.W e s t e r n b l o t 检测血清中特异性抗体，M.蛋白质分子量标准，1.对照小鼠血清，2.SeV-PEDV-S免疫的小鼠血清。*Aidentification of S-specific antibodies byIFA，b a r is50 m;B.detection of S-specific antibodies by Western blot,M.proteinmarker,1.serum of control mice,2.SeV-PEDV-S immunized mouse serum.为检测不同组小鼠的特异性T细胞免疫，对免疫后的小鼠脾脏T淋巴细胞进行分离和标记，PEDV病原刺激后，检测T淋巴细胞的增殖情况，结果发现，SeV-PEDV-S组T细胞的增殖活性显著高于其他组（图7），说明SeV-PEDV-S能有效激活小鼠的特异性T淋巴细胞反应。100*A25B*80%2060Isotype15400.03%DMEM100.07%SeV20523.3%SeV-PEDV-S00T1T2T3T40.65%PEDV-ST1T2T3T4处理treatments100101102 103104处理treatments图6免疫后小鼠血清中和抗体效价图7免疫后小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖Fig.6The neutralization activitiesFig.7 The T lymphocyte proliferative activity in immunized miceofimmunizedmiceserumT 1.D M EM；T 2.Se V；T 3.Se V-PED V-S；T 4.PED V-S。*P 0.0 1。A.流式 T 1.D M EM;T 2.Se V T 3.Se V-细胞术检测T淋巴细胞增殖；B.淋巴细胞增殖的统计。A。t h e d e t e c t i o n o f T l y m p h o-PEDV-S;T4.PEDV-S。*P 0.0 1。cyte proliferation on by flow cytometry;B.statistics on the lymphocyte proliferation.3讨论近年来，以PEDV为主要病原的猪腹泻疫情在中国、意大利、德国和美国等国家大规模发生，其中仔猪病死率达10 0%，给养猪业造成严重的经济损失。控制PED疫情最重要的方法之一是接种疫苗，亚洲国家常规使用的是PEDV减毒疫苗和灭活疫苗。在母猪分娩前进行疫苗接种，诱导母猪体内产生特异性抗体并分泌到乳汁中，通过乳汁将母源抗体传递给新生仔猪而获得免疫保护作用7。灭活疫苗虽然安全性高，但免疫有效期短，且需要适当的佐剂才能诱导有效的免疫反应8 。PEDV野毒株进行连续传代获得的减毒活疫苗，虽然对同源毒株有一定的防控作用，但难以控制变异株，且研发周期长，还存在重组的安全性问题 。因此，探究新型高效的疫苗是目前防控PEDV的关键策略。合适的抗原靶标是疫苗研发的首要因素。在冠状病毒编码的蛋白质中，S蛋白含有多个中和表位，是其主要的免疫原。多项研究指出，基于S蛋白不同结构域的抗原在免疫动物后显示出良好的免疫反应。利用猪细胞真核表达的重组S1蛋白免疫怀孕母猪后，可通过被动免疫保护新生仔猪免受PEDV50第44卷扬州大学学生命科学版）的感染10 。表达S蛋白的复制型重组人腺病毒免疫小鼠后能刺激小鼠产生特异性体液和细胞免疫应答。重组PEDVCOE区域的益生菌（乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌）在免疫动物后，发现S蛋白均有良好的免疫原性5,11。此外，昆虫细胞表达的带有 S、M 和E蛋白的包膜病毒样颗粒也能有效地诱导与灭活PEDV疫苗相同的中和抗体滴度12 。本研究选用PEDV流行毒株的S蛋白全长和截短的多肽免疫小鼠，能诱导特异性免疫反应。仙台病毒载体已在减毒活疫苗和基因治疗等领域进行了临床使用检验，其在分子生物学中的应用依赖于高效的外源基因表达、广泛的宿主细胞特异性、低致病性和强免疫原性等优势。仙台病毒与人副流感病毒1型（hPIV-1)具有相同的抗原性，能作为一种异种减毒活疫苗鼻内免疫诱导产生抗hPIV-1的免疫反应，且对人体无不良影响6 。表达H5N1流感病毒M2蛋白的重组仙台病毒鼻内免疫小鼠，不仅能诱导小鼠产生特异性免疫反应，还能对其他物种的流感病毒产生交叉保护作用13。表达口蹄疫病毒（FMDV）P1蛋白的重组仙台病毒能有效诱导BHK-21细胞产生IFN-和IFN-，免疫后可诱导较高水平的FMDV特异性ELISA抗体、中和抗体和干扰素表达141一个组织部位的黏膜感染或黏膜免疫可在机体其他的黏膜表面产生SIgA并提供免疫保护，这种现象称为“共同黏膜免疫系统 16 。由于并非所有的黏膜表面都是相互连接的，机体的黏膜表面可细化为“分隔”或“整合”的黏膜免疫系统17 。例如，鼻腔接种疫苗可保护阴道，通过气管上皮的免疫可赋予肠道免疫力18 。不同黏膜表面之间由黏膜淋巴结中活化的淋巴细胞迁移或“归巢”到黏膜表面来进行相互连接19。这种组织特异性迁移是由细胞上特异性黏附分子和趋化因子受体（47，CCR9)结合仅存在于黏膜组织上的配体完成2 0 。本研究中PEDV通过肠道黏膜感染机体，其疫苗能有效诱导黏膜免疫反应，对PEDV的防控至关重要。仙台病毒从呼吸道黏膜感染，作为诱导黏膜免疫反应的适合重组疫苗载体15。本研究中构建的重组仙台病毒(SeV-PEDV-S)经Western blot验证发现，全长 S蛋白的理论大小为150.8 ku，而实际表达的大小约为18 0 ku，说明仙台病毒可有效表达PEDVS蛋白并能对S蛋白进行糖基化修饰，从而保证S蛋白的正确折叠和发挥正常的生物学功能。SeV-PEDV-S在小鼠体内能诱导显著的PEDV特异性免疫反应，包括特异性抗体、中和抗体和细胞免疫水平。这证明SeV作为一种预防PEDV感染的新型疫苗载体具有巨大的潜力。4结论本研究中构建并拯救了表达PEDVS蛋白的重组仙台病毒（SeV-PEDV-S），经鉴定发现，SeV-PEDV-S能成功表达全长PEDVS蛋白，并能有效地对S蛋白进行修饰，确保S蛋白的正常生物学功能。此外，SeV-PEDV-S能诱导小鼠产生PE