氧化苦参碱调控CTLA-4...缓解小鼠类风湿关节炎的作用_岳晓琪.pdf

宁夏医科大学学报45卷类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以滑膜增生为特征的慢性炎性自身免疫病。调节性 T 细胞（regulatory T cell，Tregs）发挥免疫抑制作用，属于 CD4+T 细胞亚群，可诱导免疫耐受，预防自身免疫性疾病发生。其关键性表型特征在于表达叉头样转录因子 3（forkhead box protein 3，Foxp3）。Foxp3 在 CD4+调节性 T 细胞的分化、发育和功能稳定的过程中发挥着重要功能。研究发现，T 淋巴细胞数目减少或功能缺陷可能与 RA发病相关，特别是滤泡辅助性 T 细胞（follicularhelper T cells，Tfh）和 Treg 细胞失衡造成免疫功能的紊乱1-2。由调节性 T 细胞分化而来的滤泡调节性 T 细胞（follicular T regulatory cell，Tfr）表达Treg 细胞标记物细胞毒性 T 淋巴细胞相关蛋白 4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4）和 Foxp3。Tfr 细胞产生白细胞介素（interlenkin，IL）-1R2 和 IL-1Ra 抑制 Tfh 活化，并通过CTLA-4 抑制 B7-1 和 B7-2 在生发中心（germinal center，GC）B 细胞的表达，具有抑制 GC 形成和 B 细胞发育的功能3-4。滤泡辅助性 T 细胞对于B 细胞的激活、抗体类别转换和 GC 的形成至关重要。Tfh 细胞的特征在于高度表达程序性死亡受体-1（programmed death receptor-1，PD-1）分子，主要抑制 T 细胞抗原受体（T cell receptor，TCR）和 CD28 共刺激。研究5发现，Tfh 细胞对同源 B细胞呈递的抗原敏感，Tfh 细胞 PD-1 的高表达反映了抗原刺激的经历，尤其是在 GC 内6。CTLA-4（CD152）是 T 细胞上的一种跨膜受体，可以与 CD28 竞争性结合 B7 分子配体诱导 T 细胞无反应性，参与免疫反应的负性调节7。氧化苦参碱（oxymatrine，OMT）是从宁夏道地药材苦参中提取的单体生物碱8。本团队前期研究9-10发现，OMT 可纠正胶原诱导性关节炎炎（collagen-induced arthritis，CIA）小鼠脾 Tfr 细胞和Tfh 细胞的数量失衡，降低自身抗体的产生，从而缓解小鼠的 RA，但未涉及 T 细胞负向免疫调控机制的研究。本研究拟通过建立 CIA 小鼠模型，探讨OMT 是否可调节 T 细胞 CTLA-4 和 PD-1 的表达氧化苦参碱调控 CTLA-4 和 PD-1 缓解小鼠类风湿关节炎的作用岳晓琪，牛腾耀，詹静慧，高强，张艳丽（宁夏医科大学基础医学院病原生物学与免疫学系，银川750004）摘要：目的观察氧化苦参碱（oxymatrine，OMT）通过免疫负调控机制对小鼠胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）的缓解作用。方法将 DBA/1J 小鼠随机分为正常组、模型组、OMT 组和地塞米松组，每组9 只。采用胶原和佐剂等体积混合背部皮下多点注射诱导 DBA/1J 小鼠，构建 CIA 小鼠模型。OMT 组和地塞米松组分别用氧化苦参碱和地塞米松进行腹腔注射，正常组注射同等剂量的生理盐水。采用实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）法检测脾淋巴细胞叉头样转录因子 P3（forkhead box protein3，Foxp3）、细胞毒性 T 淋巴细胞相关蛋白-4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein-4，CTLA-4）和程序性死亡受体-1（programmed cell deathprotein-1，PD-1）的 mRNA 表达水平。采用苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）观察关节滑膜组织的异位生发中心。采用免疫组织化学法和 Western blot 检测 Foxp3 及 CTLA-4 和 PD-1 的表达。结果OMT可缓解 CIA 小鼠关节肿胀度并降低其关节评分，增加脾淋巴细胞和关节组织 Foxp3 及 CTLA-4 的表达，降低PD-1 的表达（P 均0.05），并减少炎性细胞大面积浸润。结论OMT 可能经增加调节性（Foxp3+）T 细胞 CTLA-4 的表达但降低 PD-1 的表达而缓解 RA。关键词：类风湿关节炎；氧化苦参碱；叉头样转录因子 P3；细胞毒性 T 淋巴细胞相关蛋白-4；程序性死亡受体-1中图分类号：R259文献标识码：ADOI：10.16050/ki.issn1674-6309.2023.03.002收稿日期：2022-09-19基金项目：国家自然科学基金项目（82160780）作者简介：岳晓琪，在读硕士研究生，研究方向：自身免疫病学。E-mail：通信作者：张艳丽，女，教授，博士研究生导师，研究方向：自身免疫病学。E-mail：文章编号：1674-6309（2023）03-0224-06论著第 45 卷3 期2023 年 3 月宁夏医科大学学报Journal of Ningxia Medical University2243期而缓解 RA。1材料与方法1.1材料1.1.1动物模型建立从北京维通利华实验动物技术有限公司购买 36 只 SPF 级、67 周龄、体质量 1822 g/只的雄性 DBA/1J 小鼠 SCXK（京2016-0011），饲养于宁夏医科大学实验动物中心。1.1.2药物地塞米松磷酸钠注射液（产品批号：兽 070011145）5 mg/（2 mL/支）购自吉林省华牧动物保健品有限公司；OMT（产品批号：20200102）购自宁夏紫荆花药业股份有限公司，纯度 99%。1.1.3试剂牛源性型胶原（产品批号：20022）、不完全弗氏佐剂（批号：7002）及完全弗氏佐剂（批号：7001）购于 Chondrex 公司；实时荧光定量试剂盒（批号：RR820A）、逆转录试剂盒（批号：RR036A）均购于 TaKaRa 公司；HRP 标记的山羊抗鼠 IgG（批号：RS0001）、HRP 标记的山羊抗兔 IgG（批号：RS0002）、兔抗 Foxp3 多克隆抗体（批号：YT6169）、兔抗CTLA-4多克隆抗体（批号：YT5933）、小鼠抗-actin 多克隆抗体（批号：YM3128）均购于 ImmunoWay 公司；小鼠抗 PD-1 多克隆抗体（批号：ab52587）购于 Abcam 公司。1.1.4实验仪器RT-qPCR 仪（上海枫岭生物技术有限公司，型号：FTC-3000H）；酶标仪（ThermoFisher 飞公司，型号：1510）；凝胶成像仪（GE，型号：AI600 images）；电泳仪（美国 Bio-Rad 公司，型号：Universal Power Supply）；乳化仪（上海昂尼仪器仪表有限公司，型号：AD145S-P）。1.2方法1.2.1构建 CIA 小鼠模型将 DBA/1J 小鼠随机分为正常组、模型组、OMT 组和地塞米松组，每组 9 只。将体积比 11 完全乳化后的牛源性型胶原与等体积完全弗氏佐剂皮下多点注射于除正常组以外的各组小鼠背部以及尾部，0.1 mL/只，正常组注射等体积生理盐水，21 d 后改用不完全弗氏佐剂同样的方式加强免疫。造模后第 15 天，地塞米松组采取药物干预措施，持续 7 d，腹腔注射地塞米松 2.8 mg kg-1，7 d 后以 1.4 mg kg-1剂量维持；OMT 组依据 Wang 等11和本课题组前期研究，本次实验 OMT 的浓度为 180 mg kg-1；每次0.1 mL/只，每日给药 1 次，直至造模结束；正常组和模型组注射等体积生理盐水。治疗 30 d 后根据相关动物伦理规定处死全部小鼠。1.2.2观测和评估 CIA 小鼠的关节炎指数（arthritis index，AI）和关节肿胀度由同一个检测人员每隔 3 d 对小鼠关节肿胀程度进行 AI 分级评分，评分标准见表 1，小鼠足红肿程度评为 04 分，最高为 16 分，AI 评分 1 分为造模成功12。在评分的过程中使用游标卡尺测量并计算 CIA 小鼠关节肿胀度 关节肿胀度=踝关节厚度爪关节厚度，连续记录至第 45 天。表 1AI 评分标准评分标准分值/分无关节红肿0踝关节或足趾轻度红肿1踝关节中度红肿2包括趾关节在内的全足明显红肿3全足明显红肿伴关节变形、功能障碍41.2.3苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosinstaining，HE）观察关节滑膜组织的异位 GC将关节和脾脏切片提前置于 68 烘箱中 2 h 以上，进行固定和脱水处理后，苏木精染色 10 min，1%盐酸乙醇溶液处理 10 s，氨水返蓝 20 s，超纯水冲洗 1 min，1%伊红染色 1 min，完成后续步骤以后滴加中性树胶封片观察。1.2.4免疫组化法检测小鼠踝关节滑膜中Foxp3、CTLA-4 和 PD-1 的表达无菌取小鼠踝关节滑膜并脱钙处理，对脱钙后的小鼠踝关节进行固定、脱水、透明、浸蜡、包埋及切片和脱蜡处理。分别将兔抗 Foxp3 多克隆抗体、兔抗 CTLA-4 多克隆抗体和小鼠抗 PD-1 多克隆抗体 11 000 稀释后室温孵育 3 h。滴加适量的 HRP 标记的山羊抗鼠或兔 IgG 抗体，室温孵育 30 min，用 PBS 冲洗3 次。滴加现配 DBA 显色液并不断地观察颜色变化情况，8 min 后终止显色反应。封片，干燥后在显微镜下进行观察并记录。1.2.5小鼠脾脏淋巴细胞的制备无菌条件下取脱颈处死小鼠的新鲜脾脏，充分研磨脾脏；在15 mL 离心管中加入 4 mL 小鼠淋巴细胞分离液，800g 离心 30 min；吸取云雾状白膜层，用PBS 补齐至 5 mL，再 250g 离心 10 min，弃上清并收集脾脏淋巴细胞沉淀。1.2.6小鼠脾脏淋巴细胞中总 RNA 提取及qPCR 检测将上述得到的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）根据试剂盒说明书进行总 RNA 提取，收集总 RNA 反转录合成 cDNA，引物序列见表 2。反应条件：95 的条件下变性 5 s，60 的条件下退火 10 s，72 的条件下延伸 5 s，循环 40 次；通过 2-ct计算mRNA 的相对表达量。岳晓琪，等.氧化苦参碱调控CTLA-4和PD-1缓解小鼠类风湿关节炎的作用225宁夏医科大学学报45卷基因名称上游引物下游引物CXCR55-GAAAACGAAGCGGAAACTAGAG-35-AGGAAGATGACAATGTGGTAGG-3PD-15-TGTGTGGTATTGTCGGGACTTTGC-35-TTGCTTTGGGTTGCTTTCCGTTTG-3Foxp35-TTTCACCTATGCCACCCTTATC-35-CATGCGAGTAAACCAATGGTAG-3CTLA-45-GCGGCAGACAAATGACCAAATGAC-35-CAACAGCTCTCAGTCCTTGGATGG-31.2.7Western blot 检测 Foxp3、CTLA-4 和 PD-1蛋白的表达水平将收集好的小鼠脾细胞于冰上裂解 25 min 后 4 12 000g 离心 5 min，提取上清即为全蛋白。使用 BCA 蛋白定量法检测提取蛋白的总量，经 8%的 SDS-PAGE 凝胶电泳，转膜后使用 5%的脱脂奶粉封闭 2 h。将兔抗Foxp3 多克隆抗体（11 000）、兔抗 CTLA-4 多克隆抗体（11 000）、兔抗 PD-1 多克隆抗体（1500）滴加于目的条带，4 孵育过夜。随后二抗室温孵育 2 h，PBS 洗涤后滴加 ECL 发光液曝光，随后采用 Image J 软件对条带进行分析。1.3统计学方法采用 SPSS 17.0 统计学软件进行数据分析，计量资料以均数标准差（xs）表示。多组间比较采用 one-way ANOVA 分析，两两比较采用 LSD-t 检验。P0.05 为差异具有统计学意义。2结果2.1OMT 缓解 CIA 小鼠关节肿胀度并降低关节评分从初次免疫后开始计算到第 15 天，模型组、地塞米松组、OMT 组的小鼠关节与正常组相比差异无明显变化。第 15 天以后，相比正常组，模型组、地塞米松组、OMT 组的小鼠关节肿胀度和评分开始升高。在初次免疫 18 d 后，相比于模型组，OMT 组与地塞米松组关节肿胀度和关节评分的升高较为缓慢，并且随着给药时间的延长，其肿胀程度逐渐缓解，关节评分亦降低（P 均0.05），见图 1A。HE 结果显示，正常组的小鼠关节腔内几乎不存在炎性细胞的浸润，模型组小鼠炎性细胞呈大面积浸润，OMT 组炎性细胞浸润程度有所改善，见图 1B。2.2OMT处理增加CIA小鼠脾脏淋巴细胞Foxp3、CTLA-4 表达并降低 PD-1 表达通过 RT-qPCR 和 Western blot 检测位于脾脏淋巴细胞的 Foxp3、CTLA-4 和 PD-1 的 mRNA 和蛋白表达水平。采用免疫组化法检测小鼠后肢踝表 2引物序列A.关节 AI 评分和肿胀度比较；模型组、地塞米松组、OMT 组与正常组比较#P0.05；OMT 组、地塞米松型与模型组比较*P0.05；B.HE 染色观察小鼠踝关节滑膜组织（HE400）。图 1OMT 对 CIA 小鼠关节的影响AB121086420151050#*免疫后时间/d正常组模型组OMT 组地塞米松组关节评分/分关节肿胀度/mm2免疫后时间/d正常组模型组OMT 组05 10 15 20 25 30 35 40 45 50051015202530354045502263期关节滑膜中 Foxp3、CTLA-4 和 PD-1 的表达情况，结果显示，与正常组相比，模型组的脾脏淋巴细胞CTLA-4 和 Foxp3 的 mRNA 和蛋白表达量降低，PD-1 的mRNA 和蛋白表达量升高（P 均0.05）。与模型组相比较，OMT 组、地塞米松组的脾脏淋巴细胞 PD-1 mRNA 和蛋白表达量降低，CTLA-4 和Foxp3 的 mRNA 和蛋白表达量升高（P 均0.05），见图 2A、图 2B。小鼠踝关节滑膜中免疫组化检测结果与脾脏淋巴细胞中的结果相一致，见图 2C。3讨论RA 是一种滑膜和关节结构的炎症变化、间充质组织中广泛纤维蛋白样变性以及骨结构的萎缩和稀疏的慢性全身性疾病，自身抗体的异常产生是其发病的主要机制之一13-15。CIA 动物模型在临床特征和免疫学改变等方面与人类 RA相似，在 RA 的研究中被广泛应用16-18。本课题组前期研究19发现，OMT 可下调 CIA 小鼠脾滤泡辅助性 T 细胞和 B 细胞数量，抑制小鼠血清 IL-21表达，缓解关节炎症，但对免疫负调控的分子机制未做探讨。RA 的发展与淋巴细胞免疫紊乱和异常活化的淋巴细胞亚群密切相关，特别是在 CD4+T 细胞相关的亚群中20-22。IL-21 通过诱导 CD4+T 分化为 Tfh 细胞，与 GC B 细胞表面的 IL-21 受体结合，促进 B 细胞向浆细胞分化并最终产生大量抗体，从而导致关节滑膜损伤23-24。在 CD4+T 细胞分化为负性免疫调控细胞 Treg 的过程中，IL-21和转化生长因子（TGF-）起着重要的作用，Treg细胞诱导免疫耐受从而发挥免疫抑制作用，预防自身免疫性相关疾病的发生。Tfr 细胞由 Treg 细胞分化而来，它与 Treg 细胞具有某些共同的特A.RT-qPCR 检测小鼠脾脏淋巴细胞 Foxp3、CTLA-4 和 PD-1 的 mRNA 相对水平；B.Western blot 检测小鼠脾脏淋巴细胞Foxp3、CTLA-4 和 PD-1 相对蛋白表达量；C.免疫组化检测小鼠踝关节滑膜 Foxp3、CTLA-4 和 PD-1 的表达（IHC400）；与正常组比较#P0.05；与模型组比较*P0.05。图 2OMT 对 CIA 小鼠脾脏淋巴细胞 Foxp3、CTLA-4、PD-1 表达的影响岳晓琪，等.氧化苦参碱调控CTLA-4和PD-1缓解小鼠类风湿关节炎的作用ABC正常组模型组OMT 组地塞米松组Foxp3 的相对 mRNA 水平CTLA-4 的相对 mRNA 水平PD-1 的相对 mRNA 水平543210432102520151050#*正常组模型组OMT 组地塞米松组正常组模型组OMT 组地塞米松组正常组模型组OMT 组地塞米松组正常组模型组OMT 组地塞米松组正常组模型组OMT 组地塞米松组正常组模型组OMT 组地塞米松组正常组模型组OMT 组地塞米松组#*CTLA-4Foxp3PD-1-actin25 kDa47 kDa32 kDa43 kDaCTLA-4Foxp3PD-12.01.51.00.50.02.01.51.00.50.01.51.00.50.0CTLA-4/-actinFoxp3/-actinPD-1/-actin正常组模型组OMT 组地塞米松组#*#*正常组模型组OMT 组地塞米松组0.50.40.30.20.10.00.50.40.30.20.10.00.60.40.20.0正常组模型组OMT 组地塞米松组#*PD-1 阳性面积/%Foxp3 阳性面积/%CTLA-4 阳性面积/%2 mm2 mm2 mm2 mm2 mm2 mm2 mm2 mm2 mm2 mm2 mm2 mm227宁夏医科大学学报45卷征，高表达 Foxp3 和 CTLA4 还可促进机体分泌细胞炎性因子 IL-10 和 TGF-，具有抑制 GC 形成、Tfh 细胞和自身反应性 B 细胞发育的功能25。协同刺激分子 PD-1 与 PD-L1、PD-L2 结合可以抑制 T、B 细胞的活化与相关细胞因子的产生，在维持机体免疫耐受的过程中具有重要作用。研究5显示，当 Tfh 细胞的 PD-1 与组成表达PD-1 配体 1（PD-L1）的 B 细胞结合时，PD-1 进一步限制了 Tfh 细胞 CXCR3 的上调，使这些细胞向 GC 聚集，因此，PD-1 以共刺激非依赖和依赖的方式工作，控制 Tfh 细胞的组织定位和功能26-27。Tan 等28研究发现，PD-1/PD-L1 缺陷小鼠的血液和淋巴结中调节性 T 细胞（Foxp3+）增加，从而增强了抑制能力，并在体内有效地抑制了 Tfh 细胞。Foxp3+需要 CD28 和 ICOS 信号，但被 PD-1/PD-L1 抑制，因此，PD-1 亦会抑制 Tfr细胞的免疫负调控作用，调节进入外周血的 Tfr细胞数量。CTLA-4 通过与 T 淋巴细胞表面的CD28 竞争性结合 B7 分子配体参与了免疫反应进程中的负性调节7。本实验结果显示，OMT 可降低 CIA 小鼠关节评分并缓解 CIA 小鼠关节肿胀度，增加脾淋巴细胞 Foxp3 及 CTLA-4 的表达，降低 PD-1 的表达。推测 OMT 可能通过降低PD-1 的表达、增加 CTLA-4 的表达调控 Foxp3+T细胞的数量和功能，从而缓解 RA，但详尽的负向免疫学调控机制还需后续深入研究。参考文献：1 Niu HQ，Li ZH，Zhao WP，et al.Sirolimus selectivelyincreases circulating Treg cell numbers and restoresthe Th17/Treg balance in rheumatoid arthritis patientswith low disease activity or in DAS28 remission whopreviouslyreceivedconventionaldisease-modifyinganti-rheumatic drugs J.Clin Exp Rheumatol，2020，38（1）：58-66.2 Ohmes J，Comdhr S，Akbarzadeh R，et al.Dysregulationand chronicity of pathogenic T cell responses in thepre-diseased stage of lupus J.Front Immunol，2022，10（13）：1007078.3Mesquita DJ，Cruvinel WM，Resende LS，et al.Follicularhelper T cell in immunity and autoimmunity J.BrazJ Med Biol Res，2016，49（5）：5209.4Kuan R，Agrawal DK，Thankam FG.Treg cells inatherosclerosis J.Mol Biol Rep，2021，48（5）：4897-4910.5 Shi J，Hou S，Fang Q，et al.PD-1 controls follicular Thelper cell positioning and function J.Immunity，2018，49（2）：264-274.6 Huang YY，Lin SD，Zhan F，et 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with the same dose of normal saline.ThemRNA expression levels of Foxp3，CTLA-4 and PD-1 in spleen lymphocytes were detected by RT-qPCR.HEstaining was used to observe the ectopic geriatric center of joint synovium.The expressions of Foxp3，CTLA-4and PD-1 were examined by immunohistochemistry and Western blot.ResultsOMT could significantly re-lieve the joint swelling degree and reduce the joint score of CIA mice，significantly increase the expression ofFoxp3 and CTLA-4 in spleen lymphocytes and joints，but decrease the expression of PD-1（P all0.05），and re-duce the large-scale inflammatory cell infiltration.ConclusionOMT may alleviate rheumatoid arthritis by in-creasing the expression of CTLA-4 on regulatory（Foxp3+）T cells but decreasing the expression of PD-1.Key words：rheumatoid arthritis；oxymatrine；forkhead box protein3；cytotoxic T-lymphocyte-associated protein4；programmed cell death protein 1岳晓琪，等.氧化苦参碱调控CTLA-4和PD-1缓解小鼠类风湿关节炎的作用229