紫心甘薯IbMYB1上游7个调控蛋白的互作与表达分析.pdf

收稿日期：2023-04-19基金项目：广东省基础与应用基础研究基金（2022A1515110300）作者简介：付丹文（1986），女，博士，助理研究员，研究方向为园艺作物遗传育种及分子生物学，E-mail：通信作者：高峰（1962），男，博士，教授，研究方向为紫薯花色素合成调控，E-mail：广东农业科学 2023，50（6）：1-9Guangdong Agricultural Sciences DOI:10.16768/j.issn.1004-874X.2023.06.001付丹文，陈亚慧，杨少华，高峰.紫心甘薯 IbMYB1 上游 7 个调控蛋白的互作与表达分析J.广东农业科学，2023，50（6）：1-9.紫心甘薯 IbMYB1 上游 7 个调控蛋白的互作与表达分析付丹文1,2，陈亚慧1，杨少华1，高 峰1（1.华南师范大学生命科学学院，广东 广州 510631；2.广东省科学院南繁种业研究所，广东 广州 510315）摘 要：【目的】对前期筛选到的紫心甘薯 IbMYB1 上游 7 个调控蛋白（IbERF1、IbPDC、IbPGP19、IbSCF、IbWRKY1、IbJOX4 和 IbEIN3-2）的互作与表达进行分析，进一步阐明花色素苷在特定时空合成与积累的调控网络。【方法】采用酵母双杂交和双分子荧光互补试验，对 7 个调控因子之间的相互作用进行检测，使用荧光定量 PCR 对紫心甘薯和白心甘薯根不同发育时期花色素苷合成调控和筛选的上游调控因子进行基因表达特征分析。【结果】IbERF1 与 IbSCF、IbWRKY1 存在相互作用。双分子荧光互补试验证实了酵母双杂交的试验结果。IbERF1 基因在紫心甘薯根不同时期的表达量均低于白心甘薯，且随着根中花色素苷的积累其表达量逐渐降低，IbWRKY1 和 IbSCF 基因在紫心甘薯和白心甘薯根不同发育时期中的表达量，与花色素苷的积累无明显的相关关系。【结论】IbMYB1 上游调控蛋白 IbERF1、IbSCF 可分别与 IbWRKY1 形成复合物，以转录复合体的形式共同调控 IbMYB1 表达。推测 IbERF1 可能负调控花色素苷的合成，IbSCF 和 IbWRKY1 参与紫心甘薯花色素苷的合成与调控，可能还存在更为复杂的机制。关键词：紫心甘薯；花色素苷生物合成；转录因子 IbMYB1；上游调控蛋白互作；表达分析中图分类号：S531 文献标志码：A 文章编号：1004-874X（20 23）06-0001-09Interaction and Expression Analysis of 7 Transcription Proteins Upstream of IbMYB1 in Purple-Fleshed Sweet PotatoFU Danwen1,2，CHEN Yahui1，YANG Shaohua1，GAO Feng1（1.School of Life Sciences,South China Normal University,Guangzhou 510631,China;2.Institute of Nanfan&Seed Industry,Guangdong Academy of Sciences,Guangzhou 510315,China）付丹文（1986），博士，助理研究员，主要研究方向为园艺作物遗传育种及分子生物学，现任职广东省科学院南繁种业研究所甘蔗育种研究室。近 5 年主持广东省自然科学基金青年基金 1项，参与广东省甘蔗剑麻产业技术体系创新团队甘蔗抗性育种岗位专家等项目 18 项，在Frontiers in Plant SciecneBMC GenomicsBMC Plant Biology广东农业科学甘蔗糖业等国内外期刊发表论文 28篇，其中以第一作者发表 11篇；授权发明专利 11项，其中排名第一有 5项，排名前三有 9项。优秀青年学者论坛2【研究意义】甘薯Ipomoea batatas（L）.Lam.是重要的粮食、饲料和工业原料作物。花色素苷具有抗氧化和清除自由基的作用，对肝脏和眼睛具有保护作用，对糖尿病具有一定的治疗作用1。紫心甘薯的块根生长于土壤中，处于完全黑暗的环境，内部能大量积累花色素苷，其花色素苷积累部位具有一定的特殊性。目前，对于植物的花、果、茎、叶等地上部分花色素苷合成以及环境信号因子影响的分子机制有了一定认识，尤其是光照对花色素苷合成的调控机制及信号传导过程已比较清楚2。对于非依光型或无法直接接受光照的植物根、块根或块茎中花色素苷合成调控机制及信号传递过程却不明了。紫心甘薯具有重要的开发价值，对其进行非依光型及植物地下部分花色素苷合成的调控机制研究，可以丰富和深化植物花色素苷生物合成分子调控的基础理论，为紫心甘薯高花色素苷品种选育提供新的遗传标记，为其分子育种筛选出合适的操作元件或改造靶标，还可为提高块根中色素含量提供新的思路。【前人研究进展】花色素是类黄酮家族最大的分支，类黄酮是一类以黄烷 C6-C3-C6 为骨架的衍生物，是普遍存在的植物次生代谢产物。根据黄烷骨架上烃基和甲氧基的数目和位置，花色素可以分为六类：花葵素、花青素、花翠素、甲基花青素、牵牛花色素和锦葵色素3。植物花色素苷是原位合成的，由一系列的酶催化完成。随后，由谷胱甘肽-S-转移酶将花色素苷由细胞质转移至液泡，并储藏于液泡中3。在植物体内，特定花色素苷是否合成、合成多少及合成部位主要是由其合成途径中多个结构基因的表达水平决定，而表达水平受转录因子的调控4。参与植物花色素苷合成酶基因表达调控的转录因子主要有三类：MYB、bHLH（也称 MYC）和 WD40。其中，R2R3-MYB 型转录因子直接与花色素苷生物合成酶基因的启动子区域结合，从而激活其转录表达。R2R3-MYB 参与植物花色素苷生物合成已有较多报道，如 R2R3-MYB 转录因子 GhMYB1a参与调控非洲菊花青素和黄酮醇积累5；茄子中 R2R3-MYB 转录因子 SmMYB75 受光诱导，在花瓣中特异性表达，调控茄子花青素的积累6；毛白杨中 R2R3-MYB 转录因子 MYB6，主要在幼叶中表达，MYB6 的过表达上调类黄酮生物合成基因的表达，导致花青素和原花青素的积累显著增加7；R2R3-MYB 转录因子 MdMYB114 促进苹果果皮中花色素苷的积累8；葡萄紫色叶和茎中，2 号染色体上的 VvMYBA1 表达上调，14号染色体上 VvMYBA5、VvMYBA6 和 VvMYBA7调控葡萄营养组织花色素苷的积累，1 组 R2R3-MYB 负调控葡萄营养组织花色素苷的积累9，LMMYB 参与番茄果实颜色的形成10，CsMYB4-5、CsMYB4-6 和 CsMYB4-7 参与调控茶树树叶花青素积累11。【本研究切入点】已有研究表明，紫心甘薯中 R2R3-MYB 转录因子 IbMYB1 通过与花色素苷Abstract:【Objective】The interaction and expression of 7 upstream transcription proteins(IbERF1,IbPDC,IbPGP19,IbSCF,IbWRKY1,IbJOX4 and IbEIN3-2)of purple-fleshed sweet potato IbMYB1 were analyzed to further elucidate the regulatory network of anthocyanin synthesis and accumulation in specific time and space.【Method】Yeast two-hybrid and BiFC experiment were used to detect the interactions between the 7 upstream transcription regulators.RT-qPCR was used to analyze the gene expression traits of an thocyanin synthesis regulation and upstream regulators in purple-fleshed sweet potato and white-fleshed sweet potato at roots different developmental stages.【Result】IbERF1 interacted with IbSCF and IbWRKY1.BiFC experiment confirmed the results of yeast two-hybrid experiment.The expression level of IbERF1 gene in purple-fleshed sweet potato roots was lower than that in white-fleshed sweet potato at different periods,and the expression level decreased gradually with the accumulation of anthocyanin in root.The expression levels of IbWRKY1 and IbSCF genes in the roots of purple-fleshed sweet potato and white-fleshed sweet potato at different developmental stages showed no significant positive or negative correlation with anthocyanin accumulation.【Conclusion】The upstream regulatory proteins IbERF1 can form a complex with IbSCF and IbWRKY1,respectively to co-regulate the expression of IbMYB1 in the form of a transcription complex.It is speculated that IbERF1 may negatively regulate anthocyanin synthesis,and IbSCF and IbWRKY1 may be involved in the synthesis and regulation of anthocyanin in purple-fleshed sweet potato.Key words:purple-fleshed sweet potato;anthocyanin biosynthesis;transcription factor IbMYB1;transcription proteins interaction;expression analysis3合成途径酶基因启动子的直接结合激活其表达，从而促进花色素苷的合成12。IbMYB1 基因在转基因黄肉甘薯中超表达，导致一系列花色素苷合成酶基因表达上调，花色素苷含量增加，出现黄中带紫的“双色”薯肉，抗氧化性显著提高13。IbMYB1 基因的上游转录调控因子的调控机制目前尚不明确。本研究前期利用已克隆的 IbMYB1启动子序列，分别进行酵母单杂交文库筛选，以筛选其上游转录调控因子，并对筛选出的上游转录调控因子与靶基因关系、亚细胞定位、自激活活性以及它们之间的相互作用进行研究，筛选得到的 7 个 IbMYB1 上游转录调控因子分别为IbERF1、IbPDC、IbPGP19、IbSCF、IbWRKY1、IbJOX4 和 IbEIN3-2。【拟解决的关键问题】本研究对 7 个 IbMYB1 上游调控蛋白的互作与表达进行分析，进一步阐明花色素苷在特定时空合成与积累的调控网络。1 材料与方法1.1 试验材料供试材料为紫心甘薯品系A5和白心甘薯禺北白，采自华南师范大学生物园。野生型拟南芥（Arabidopsis thaliana）种子保存于华南师范大学生命科学学院实验室。载体 pCambia1300由华南师范大学生命科学学院高彩吉老师提供；载 体 pSAT4-nEYP-C1 和 pSAT4-cEYP-C1 由 华南师范大学生命科学学院王亚琴老师提供；载体pGADT7 和 pGBKT7 由华南师范大学生命科学学院实验室保存。1.2 试验方法1.2.1 植 物 总 RNA 提 取、纯 度 鉴 定 及 反 转录 使用植物总 RNA 小提试剂盒（Magen），进行紫心甘薯块根 RNA 的提取，具体方法参照试剂盒操作步骤。从所得 RNA 溶液中吸取 2 L 总RNA，使用 Nano Drop ND1000 微量测定分光光度计测定 RNA 浓度并进行纯度鉴定，测定结果为OD260/OD280 2.0，OD260/OD280 2.0，可用于反转录试验，同时吸取 5 L 总 RNA 进行琼脂糖凝胶电泳检测其纯度。紫外检测能看到两条清晰可区分的主带（28S 和 18S）的 RNA，表明 RNA 无降解，用于后续反转录试验。按照 Takara 说明书合成 cDNA 第一链，-20 保存备用。1.2.2 目的片段与表达载体的连接 以紫心甘薯块根 cDNA 为模板，用 TaKaRa 高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase 扩增两端带有不同酶切位点末端的目的片段序列，PCR 产物使用琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒（Magen）纯化回收，具体方法参照试剂盒操作步骤。使用 TaKaRa 限制性内切酶对质粒进行双酶切，反应条件为37，连接 30 min。经电泳检测正确的酶切产物进行切胶回收。使用 Clon Express II One Step Cloning Kit试剂盒（Vazyme）将目的片段和表达载体进行连接，反应条件为 37，连接 30 min。连接产物转化 DH5 感受态细胞。取阳性菌落进行菌落 PCR检测，取扩增得到与目的片段大小一致的阳性菌种的菌液 200 L，送至上海生工生物有限公司进行测序。测序正确的菌液中加入 20%的灭菌甘油于 1.5 mL 离心管，-80 冰箱保存。1.2.3 pGBKT-7-上游调控因子载体的毒性检测 将前期筛选得到的 7 个 IbMYB1 上游调控因子（IbERF1、IbPGP19、IbPDC、IbEIN3-2、IbJOX4、IbSCF 和 IbWRKY1），分别构建 pGBKT-7-上游调控因子酵母重组表达载体，将重组载体与空载体 pGBKT-7 分别转到酵母 Y2HGold 细胞，将转化的酵母菌液均匀涂布在 SD/-Trp 培养基，观察重组表达载体与空载体酵母菌株生长情况，进行毒性检测。选择载体中 EcoR 和 BamH 作为目的片段插入的酶切位点，合成引物序列。LB 固体培养基含 Kan 抗性，使用 Magen 质粒小量提取试剂盒提取构建好的酵母重组表达载体质粒，-20 保存。1.2.4 pGBKT-7-IbERF1菌株最低AbA浓度的确定自激活试验结果显示，pGBKT-7-IbERF1 菌株具有自激活活性，需确定抑制其自激活活性的最低金 担 子 素 A（AbA）浓 度。从 Y2HpAGBKT-7-IbERF1、阳性对照和阴性对照的培养皿中挑取较大的单克隆菌落，将 0.9%NaCl 重悬溶液稀释成 10-1、10-2和 10-3浓度梯度。吸取 10 L 重悬菌液于相应缺素培养基和添加不同浓度AbA 的缺素培养基上培养。若在某浓度下菌落Y2HpAGBKT-7-IbERF1和阴性对照不生长，而阳性对照正常生长，则该浓度为该酵母菌株的最低 AbA 浓度，可用于后续试验。1.2.5 酵母双杂交载体的构建与 Y2HGold 酵母转化 使用酵母双杂交的方法，研究 7 个 IbMYB1上游调控因子的相互作用。构建酵母双杂交试验4所需的载体，通过转化酵母 Y2H 验证蛋白与蛋白之间的相互作用，将 IbERF1 构建到 pGADT-7 载体中，将 IbPGP19、IbPDC、IbEIN3-2、IbJOX4、IbSCF 和 IbWRKY1 构 建 到 pGBKT-7 载 体 中。LB 固体培养基含 Kan 抗性，使用 Magen 质粒小量提取试剂盒提取构建好的酵母重组表达载体质粒，-20 保存。酵母转化参照Yeastmaker Yeast Transformation System 2 进行，取 5 L Yeastmaker Carrier DNA 于95 水浴 5 min 使其变性，快速置于冰上至温度降至 4（重复 1 次）。在已预冷的 1.5 mL 离心管中依次加入 500 L PEG/LiAc（50 L TE、50 L LiAc、400 L PEG4000）、5 L 变 性 的Yeastmaker Carrier DNA、100 ng 重组融合表达质粒、50 L Y2HGold 感受态细胞，涡旋混匀，置于 30 恒温培养箱中孵化 30 min（期间每隔 10 min 轻轻倒混数次）。加入 20 L DMSO，轻混匀，置于 42 水浴中 15 min（期间每隔 5 min 轻轻倒混数次）。12 000 r/min 离心 30 s，弃上清，加入0.9%NaCl 溶液 1 mL，重悬菌体。吸取 200 L 转化后的酵母菌液，涂布于 SD/-Trp 培养皿。30 培养箱中倒置培养 4896 h。从缺陷培养基 SD/-Trp 培养皿上挑取阳性克隆，转移到含 AbA 的缺陷培养基 SD/-His/AbA，观察其生长情况。再从缺陷培养基 SD/-His/AbA 挑取阳性克隆，转移到缺陷培养基 SD/-His/AbA/X-a-Gal plus，30 避光条件培养23 d，观察酵母生长情况，拍照记录。1.2.6 双分子荧光互补载体的构建 将 IbERF1构建到 pSAT4-nEYFP-C1 载体中，将 IbSCF 和IbWRKY1 构建到 pSAT4-cEYFP-C1 载体中。将重组质粒转化拟南芥原生质体瞬时表达蛋白，在共聚焦显微镜下观察检测 GFP 信号并拍照，在活细胞内验证蛋白与蛋白之间的相互作用，选择pSAT4-nEYFP-C1 和 pSAT4-cEYFP-C1 载体中作为目的片段插入的酶切位点为 Bgl II 和 BamH I，合成引物序列。LB 固体培养基含 Amp 抗性，使用 Magen 质粒小量提取试剂盒提取质粒，-20 保存备用。1.2.7 拟南芥原生质体的制备与转化 拟南芥原生质体的制备：将配制好的酶解液于 55 水浴锅中预热，4周后选择抽苔前的野生型拟南芥叶片，将叶片下表皮撕掉迅速置于酶解液中。25、50 r/min 避光轻微振动酶解 50 min，至叶肉细胞酶解完全，显微镜下观察原生质体形态，当细胞较圆、透亮时状态较好。用等体积的 W5 稀释酶液，轻轻混匀，然后将洗干净的 75 m 尼龙网布用 W5 浸湿后过滤原生质体。800 r/min 离心 2 min，尽量吸去上清，用 1 mL W5 溶液重悬原生质体（3 次重复）。将原生质体重悬于 1 mL W5 溶液中，冰上放置 30 min，备用。拟南芥原生质体的转化：2 mL EP 管中加入1020 g 目的质粒，加入 100 L 拟南芥原生质体，轻轻混匀后立即放置冰上。加入 110 L PEG/CaCl2，轻弹离心管使之混匀，室温孵育 10 min。加入 220 L W5 溶液，颠倒离心管使其混匀，放置 1 min。再向离心管加入 440 L W5 溶液，轻轻颠倒，放置 1 min。最后向离心管加入 880 L W5溶液，颠倒混匀，放置 1 min。4 800 r/min 离心 3 min，吸去上清。原生质体用 500 L W5 溶液重悬，22 黑暗条件培养 1620 h。2 结果与分析2.1 pGBKT-7-上游调控因子载体的毒性检测pGBKT-7-上游调控因子毒性检测，观察pGBKT-7-上游调控因子载体与空载在 SD/-Trp培养基上单克隆菌落的生长情况，结果显示，试验组和对照单克隆菌落在数量和大小上无明显差异（图 1），说明 pGBKT-7-上游调控因子载体对酵母没有毒性。2.2 最低 AbA 浓度的确定将已检测的具有自激活活性的上游调控因子单克隆阳性菌体置于 10 L 0.9%NaCl 溶液重悬菌液，将重悬容液稀释为10-1、10-2和10-3浓度梯度，点在SD/-Trp 和SD/-Trp/AbA（100 1 000 ng/mL）培养基培养。结果显示，pGBKT7-IbERF1 自激活AbA 最低抑制浓度为 600 ng/mL。2.3 酵母双杂交检测 IbMYB1 上游调控因子之间的相互作用将具有自激活活性的 IbERF1 与 pGADT-7 连接构建重组载体，其余上游调控因子与 pGBKT-7连接构建重组载体，进行酵母双杂交试验检测其 相 互 作 用，结 果 显 示，IbERF1 与 IbSCF、IbWRKY1 存 在 相 互 作 用（图 2），IbERF1 与IbPDC、IbPGP19、IbJOX4 和 IbEIN3-2 不存在相互作用。5pGBKT-7 为对照，BK 为载体 pGBKT-7The control was strains that successfully transformed pGBKT-7,BK:pGBKT-7图 1 IbMYB1 启动子上游调控因子载体的毒性检测Fig.1 Vector toxicity detection of upstream transcription factors on the promoter of IbMYB1AD-T+BK-53 为阳性对照，AD-T+BK-Lam 为阴性对照The positive control was AD-T+BK-53,and the negative control was AD-T+BK-Lam图 2 酵母双杂交检测 IbMYB1 启动子上游调控因子的相互作用Fig.2 Interaction detection among upstream transcription factors on the promoter of IbMYB1 by yeast two-hybrid assay2.4 双分子荧光互补试验检测 IbMYB1 上游调控因子之间的相互作用用双分子荧光互补试验对酵母双杂交检测结果进行验证，检测上述蛋白在植物细胞中是否存在相互作用。将 IbERF1 与 EYFP 蛋白 N 端融合，IbSCF 和 IbWRKY1 与 EYFP 蛋白 C 端融合，然后将带 EYFP 蛋白 N 端的融合质粒和带 EYFP 蛋白 C 端的融合质粒转化到拟南芥原生质体中进行表达，若两个蛋白有相互作用，则 EYFP 蛋白N 端和 C 端靠近形成完整的蛋白，能检测到荧光信号。由图3可知，GFP 荧光蛋白在拟南芥原生质体里呈现组成型表达，在整个原生质体中均有表达，IbERF1-nYFP+cYFP 和 nYFP+IbSCF/IbWRKY1-cYFP 分别转到拟南芥原生质体中都未检测到荧光信号，说明这 3 个蛋白与空载并没有相互作用，而共转到拟南芥原生质体后能够检测到明显的荧光信号，且荧光信号均在细胞核内，说明 IbERF16蛋白与 IbSCF 和 IbWRKY1 蛋白在细胞核中可发生相互作用，两者形成复合物共同调控基因的表达。2.5 IbMYB1 上游调控因子表达分析从图 4 可以看出，不同发育时期紫心甘薯柴根、膨大根和块根中转录因子的表达量均高于白心甘薯根，说明花色素苷的合成需要这些转录因子的大量表达。IbERF1 基因在紫心甘薯根不同时期的表达量均低于白心甘薯，且随着根中花色素苷的积累其表达量逐渐减低，推测IbERF1 可能负调控花色素苷的合成。IbWRKY1与 IbSCF 基因在紫心甘薯和白心甘薯根不同发育时期中的表达量与花色素苷的积累没有呈现单一的正相关或者负相关，推测这些基因参与紫心甘薯花色素苷的合成与调控可能还存在更为复杂的机制。3 讨论花色素是目前发现最有效的天然抗氧化物质1，近年来广泛受到人们的青睐。紫心甘薯中调控花色素苷合成的关键转录因子 IbMYB1 上游转录调控因子之间存在的互作关系鲜有报道。本研究采用酵母双杂交试验，对 7 个 IbMYB1 上游调控因子（IbERF1、IbPDC、IbPGP19、IbSCF、IbWRKY1、IbJOX4 和 IbEIN3-2）之 间 的 相 互作用进行检测。结果显示，IbERF1 与 IbSCF、IbWRKY1 存在相互作用，双分子荧光互补试验证实了酵母双杂交的试验结果。乙烯响应因子 ERF 家族蛋白属于已知最大的转录因子家族，参与多个生理过程14。在植物中，转录因子 ERF 参与花色素苷生物合成的调控。比较紫心甘薯和白心甘薯的转录组数据显示，花色苷合成结构基因受转录因子在转录水平上调控，参与调控的转录因子有 MYB、bHLH、ERF 和 WRKY15。比较紫花和白花的转录组和代谢组数据可知，在紫色花中分别检测到 MYB、bHLH、AP2/ERF、WD40、WRKY 和 Zinc-fingerA：绿色荧光；B：叶绿体自发荧光；C：明场图；D：叠加图A：GFP；B：Chloroplast；C：Light field；D：Merged graph图 3 双分子荧光互补试验检测 IbERF1 与其他上游调控因子在拟南芥原生质体的相互作用Fig.3 Interaction detection among IbERF1 and other upstream transcription factors by BiFC experiment in Arabidopsis thaliana protoplast7FR：柴根，直径 2 mm；TR：膨大根，2 mm 直径 5 mm；SR：块根，直径 5 mmFR:Fibrous roots,diameter 2 mm;TR:Thick roots,2 mm diameter 5 mm;SR:Storage roots,diameter 5 mm图 4 紫心甘薯与白心甘薯不同根系阶段花色素苷合成调控基因的相对表达量Fig.4 Relative expression levels of anthocyanin synthesis regulatory genes in purple-fleshed and white-fleshed sweet potato at different root stages 转录因子 14、9、1、33、4、12 个，其中上调的转录因子数量分别为 10、6、0、30、4、10 个16。转录因子 ERF 与 MYB 存在相互作用，转录因子 ERF 既可以与转录因子 MYB 蛋白结合调控花色素苷合成相关基因的表达，也可与 MYB 基因启动子结合调控其表达。在苹果的愈伤组织中过表达 MdERF1B，乙烯合成途径中的相关基因MdACO1、MdERF1 和 MdERF3 与花色素苷合成与调控相关的基因 MdCHS、MdCHI、MdF3H、MdDFR、MdANS、MdLAR、MdANR、MdMYB9和 MdMYB11 均显著上调，花色素苷和原花色素苷含量也明显上升。通过酵母双杂交、双分子荧光互补和 pull-down 试验结果显示，MdERF1B与 MdMYB9、MdMYB1 和 MdMYB11 蛋白存在相互作用。酵母单杂交和 EMSA 试验结果显示，MdERF1B 与 MdMYB9、MdMYB1 和 MdMYB11 的启动子具有相互作用。在 LUC 试验中，MdERF1B主要通过激活 MdMYB9 和 MdMYB11 启动子的活性来调控其基因表达17。在红皮梨中，PpERF24和 PpERF96 与 PpMYB114 调节蓝光诱导的花色素苷合成，PpERF24 和 PpERF96 加强 PpMYB114 和PpbHLH3 蛋白的相互作用，也加强 PpMYB114 诱导的结构基因的表达18。在红皮梨中，PpERF3与 PpMYB114、PpbHLH3 形成转录复合物调控红皮梨中花色素苷的合成19。WRKY 基因家族是高等植物转录因子家族中一个大家族，在植物生理过程和环境适应的转录调节中起重要作用20。在甘薯中，WRKY 蛋白（SPF1）的 cDNA 序列被首次克隆21。有报道发现，WRKY 参与花色素苷合成的调控，如 WRKY40 参与苹果中花色素苷8合成的调控22。SCF 蛋白（GID2）复合物介导了 DELLA 蛋白（GAI、RGA 和 RGL2）的泛素化和降解。本研究结果显示，IbERF1 与 IbSCF 和IbWRKY1 相互作用参与紫心甘薯中参与花色素苷合成的关键转录因子 IbMYB1 表达，为提高甘薯花色素苷含量的分子定向育种提供新的操作元件和研究思路。4 结论酵母双杂交与双分子荧光互补试验发现，紫心甘薯 IbMYB1 上游 7 个调控蛋白中，IbERF1 与IbSCF、IbWRKY1 存在相互作用。定量检测结果显示，IbERF1 基因在紫心甘薯根不同时期的表达量均低于白心甘薯，且随着根中花色素苷的积累其表达量逐渐降低，推测 IbERF1 可能负调控花色素苷的合成。IbWRKY1 和 IbSCF 基因在紫心甘薯和白心甘薯根不同发育时期中的表达量，与花色素苷的积累未呈现明显的正相关或者负相关关系，推测这些基因参与紫心甘薯花色素苷的合成与调控可能还存在更为复杂的机制。本研究结果为进一步深入阐释紫心甘薯块根及地下部分特异性合成与积累花色素苷的调控机理奠定基础。参考文献（References）：1 ZHANG Z,ZHOU B,WANG H,WANG F,SONG Y,LIU S,XI S.Maize purple plant pigment protects against fluoride-induced oxidative damage of liver and kidney in ratsJ.International Journal of 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