厦门同安湾赤潮水样中细菌的分离鉴定.pdf

第 2 7卷增刊 1 2 0 0 8年 4月 海洋环境科学 MARI NE ENVI RONMENTAL S CI ENCE Vo 1 27，S u p p1 Ap ril 2 0 0 8 厦 门同安湾赤潮水样 中细菌的分 离鉴定 戴 红(厦门市海洋与渔业环境监测站，福建 厦 门 3 6 1 0 0 5)摘要：从 2 0 0 7年厦 门同安湾冬季中肋 骨条藻赤潮 的水样 中分离鉴定细菌。结果表 明：通过 培养、分 离、纯化、革兰 氏染色 与镜检，确认分离出革兰氏阴性杆菌；由法 国梅里埃品牌 A T B E x p r e s s i o n自动细菌鉴定仪进行细菌 自动鉴定，最终鉴定 出菌 株 2株一腔隙莫拉氏菌和大肠埃希 氏菌，这 2株菌株 均为条件致病菌。关键 词：同安湾；赤潮；细菌；分离；鉴定 中图分类号：Q 9 3 6 文献标识 码：A 文章编号：1 0 0 7-6 3 3 6(2 0 0 8)增刊 1-0 0 4 2-0 3 I s o l a t i o n a n d I d e nt i fic a t i o n o f mi c r o b e f r o m r e d t i de i n To ng a n b a y，Xi a m e n DAI Ho n g (X i a m e n Ma r i n eF i s h e ri e s E n v i o r n m e n t a l Mo n i t o ri n g S t a t i o n，X i a m e n 3 6 1 0 0 5，C h i n a)Ab s t r a c t：Ba s e d o n t h e mi c r o b e d a t a，t h e mi c rob e s we r e i s o l a t e d a n d i d e n t i fi e d f r o m a S k e l e t o n e ma c o s t a t u m r e d t i d e i n T o n g n b a y，Xi a me n i n wi n t e r i n 2 0 0 7T h e r e s u l t s s h o we d t h a t Mo r a x e l l a l a c u n a t a an d E s c h e r i c h i a c a l i we r i d e n t i fi e d f r o m s a mp l e s b y c uh i v a t i n g，s e p a r a t i n g，s u b l i m a t i n g，G r a m s t a i n i n g，o b s e r v i n g b y a m i c ros c o p e a n d i d e n t i in g b y A T B E x p r e s s i o n mi c rob e s A u t o m a t i s m Ke y wo r d s：To n g a n b a y；red t i d e；mi c rob e；i s o l a t i o n；i d e n t ific a t i o n 近年，随着赤潮的深入研究，细菌正引起人们 的重 视，国内外不断有关于菌藻关系的研究报道“J。细菌 在 自然生态系统中作为分解者具有不可忽视的作用，细 菌在海洋有机质(特别是难分解的复杂有机物)的分解和 无机营养再生的过程中起着很重要 的作用，为赤潮藻类 的生长提供营养盐和必要的生长因子。细菌也可以通过 直接或间接的作用抑制藻类的生长，甚至裂解藻细胞，从 而表现为杀藻效应 J。因此，在赤潮水样 中分离鉴定出 细菌菌株，一方面可抑制对赤潮生物有促成作用的细菌 进而治理赤潮，另一方面可利用抑制藻类生长的细菌治 理赤潮。厦门作为一个旅游观光业发达的海湾城市，人 们与海水有较多的接触，对海水 中特别是在赤潮中的有 害菌需有特别关注。因此对赤潮水样中细菌的分离与鉴 定有其重要的意义。有关厦门海域赤潮的调查研究 已有不少 J，但侧 重点均在物理、化学方面，至今未有关于细菌的报道。赤 潮水样中存在哪些细菌在国内未见任何报道。本研究从 2 0 0 7年 1 月 1 2日厦门同安湾湾口靠近五通一侧的海域 发生的中肋骨条藻(S k e l e t o n e m a c o s t a t u m)赤潮水样中分 离与鉴定细菌，对该次赤潮水样中的细菌进行培养、分离 和纯化，并对菌株的形态、生理生化特征及鉴定结果进行 分析，从而鉴定出菌种，为研究赤潮水样中的细菌提供基 础数据。1 材料与方法 1 1 样品采集 依据 海洋赤潮监测技术规程 ，赤潮现场人工监 测的采样频率为每天一次，采样时间选择在一天中叶绿 素、D O、p H三要素的最高值时段(依据我单位水质 自动监 测浮标的实时数据)，用无菌采样瓶按 海洋监测 第七部 分：近海污染生态调查和生物监测 采集离水面约 l O c m处海水水样，采样站点如图 1，1号站为浮标位置，2号 站为细菌采样点。1 2 细 菌培养 水样按每 1 0 0 m L加 1 m L(1+2 0 0 0)吐温 8 O溶液，充 分摇匀，使样品中的细菌细胞分散成单一细胞。以无菌 收稿 日期：2 0 0 7 1 2-2 8，修订 日期：2 0 0 8-03 1 0 作者简介：戴红(1 9 7 8 一)，女，助理工程师，从事海 洋微生物研究。维普资讯 http:/ 增刊 1 戴红：厦 门同安湾赤潮水样 中细菌的分离鉴定 增 4 3 24。24。2 4 E 图 1 同安湾赤潮采样 站点 Fi g 1 Di s t r i b u t i o n o f r e d t i d e s t a t i o ns 操作方法吸取 1 m L水样注入 盛有 9 m L灭菌 陈海 水 的试 管内混匀，并 依 同法 依 次 连续 稀 释 至 所需 要 的稀 释 度。取 稀释好的水样 0 1 mL，滴人 制好的 2 2 1 6 E平皿上，用灭 菌玻璃 刮棒将菌液涂 抹均 匀，平放 于超 净工 作 台上 2 0 3 0 m i n，使菌液渗入培养基。将此平皿置2 5 C恒温箱内培 养 2 7 d。1 3 细菌分离与纯化 取 菌落 数在 3 0 3 0 0个之 间而且 菌落 之间分 离生 长 较好 的平 皿，无 菌 操 作 挑 选 不 同 形 态、颜 色 的 菌 落，在 2 2 1 6 E培养基 上进行 平 板划 线分 离，将 此 平皿 置 2 5 C恒 温箱内培养 2 7 d。经 3 5次的平板划线分离后如果菌 落形态、颜 色较一致，则 进行 革 兰 氏染色 后镜 检(由于从 微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定 保证是纯培养，因此还要结合显微镜检测个体形态特征 后才能确定)。1 4 革兰氏染色和镜检 取菌种培养物 常规 涂 片用 结 晶紫 进行 染色，再用 碘 液媒染，然后用 乙醇脱 色，最后用 番红 复染。在 显微 镜下 观察个体形态特征，如果发现还有杂菌则继续进行平板 划线分离，直至镜检个体形态特征一致。镜检中细胞保 留蓝紫 色的细菌 为革 兰 氏阳性 菌，细胞 为红 色 的细菌 为 革兰 氏阴性 菌。1 5氧化 酶测定 取一片滤纸 于玻 片上，以一滴 无 菌蒸馏 水湿 润纸片，用玻璃或木棍挑取菌落于湿润的滤纸上，加一滴 O X试 剂，在 1 2 m i n内呈现紫色者，则 为阳性反应。1 6 接触酶试验 用接种环 将 一菌 落 放 于载 玻 片 的 中央，加一 滴 3 H：O：于菌落上，立 即观察有无气 泡出现，出现气 泡者 为 1 3 性。1 7接种 由于本研究使用 的是法国梅里埃品牌 A T B E x p r e s s i o n自动细 菌鉴定 系统，需根 据革 兰氏染色、镜 检、氧化酶 测定、接触 酶试 验结果选择试剂条，本研 究选用 I D 3 2 G N 和 I D 3 2 E两种试剂条进行分析，其中I D 3 2 G N鉴定条用 于革兰氏阴性杆菌的鉴定，I D 3 2 E用于肠杆菌科和其它 革兰 氏阴性杆菌 的鉴定。从 经分离纯化好 的平板 上挑取 一个或 几个 形态一致 的菌落，接人一 支装 有 2 m L无 菌 0 8 5 N a C 1 的安 瓿瓶 内，用 A T B分液器混匀(避免形成气泡)，使菌落均匀悬 浮于无 菌 0 8 5 N a C 1 溶 液 中，用 A T B浊度 计检 测，浊度 应相 当于 0 5 Mc F a r l a n d标 准。I D 3 2 G N试 剂条接 种：从 0 5 Mc F a r l a n d标 准 的菌悬 液取 2 0 0 Ix L加 入 一 支 装 有 A U X培 养 基 的 安 瓿 瓶，用 A T B分 液器混匀(避 免形成气 泡)。用 A T B分液器 按 1 3 5 L 孑 L 将其分 加在鉴定试剂条 的各孑 L 中，盖上鉴定 试剂条 的盖子，于3 0 C的培养箱中培养 2 4 h。I D 3 2 E试 剂条接种：用 A T B分液器按 5 5汕 L 孑 L 将其 分加在鉴定试剂条的各孑 L 中，其中鸟氨酸脱羧酶(O D C)、精氨酸 双 水 解 酶(A D H)、赖 氨 酸 脱 羧 酶(L D C)、脲 酶(U R E)、L 一 阿拉伯糖醇(L A R L)、半乳糖酸盐(G A T)、5 一 酮 葡萄糖酸(5 K G)7个 小孑 L 各用 2滴矿 物油覆盖，盖上 鉴定 试剂条的盖子，于3 7的培养箱中好氧培养 2 4 h。由于培养箱通气可能引起鉴定试剂条小孑 L 内基物干 燥，因此将鉴定试剂条放在含少量水的外套盒内，以免干 燥 而无法 测定。1 8 细 菌鉴定 用 I D 3 2 E鉴定试剂条需先在吲哚反应小孑 L 内加 1 滴 J a me s 试剂，用软的吸水纸轻轻擦干培养好的 I D 3 2 G N 和 I D 3 2 E两种试剂条底部 可能存在 的水 分，将 培养好 的 试剂条放人 A T B E x p r e s s i o n自动细菌鉴定仪，按仪器操作 规程进行 自动鉴 定。如果 分析 结果 出 现鉴别 力 低、可疑 编码、鉴定 不可靠则还 需培 养 2 4 h。如 果培 养 2 4 h后结 果仍不理想，则可能是菌株不纯，应继续分离 与纯化。2结果 与讨 论 本研究从该次赤潮水样 中最 终获得 2株菌株一 腔隙 莫拉 氏菌(Mo r a x e U a l a c u n a t a)和大肠埃希 氏菌(E s c h e n c h i a c a l 1)，本文对其菌落形态、生化特征等试验结果结合他 人 的研究 结果 逐一进行 阐述。2 1 培 养及镜检特性 将赤 潮水 样按上文描述 的方法 在 2 2 1 6 E培养 基上培 养后 出现 的菌落光滑、微 凸、圆整、乳 白色或 白黄色，有特 殊气味。经 3 5次的分离与纯化后菌落形态、颜色较一 致，进行革兰 氏染色后镜 检。革 兰 氏染 色及镜 检结 果：两 种颜色 的菌株均 为革 兰 氏 阴性 菌，显 微镜 下 菌株形 态 均 为杆状。2 2 细菌鉴定 按以上的方法进行细菌自动鉴定前的准备并进行 自 动鉴定。结果显 示：由 白黄 色菌 落分 离 与纯 化后 的菌株 维普资讯 http:/ 增 4 4 海洋环境科学 第 2 7卷 最终鉴定为腔隙莫拉氏菌(置信度为 9 4 7 一 9 8 2)；由乳白色菌落分离与纯化后的菌株最终有两种结果，分 别鉴定为腔隙莫拉氏菌(置信度为9 5 3)和大肠埃希氏 菌(置信度为9 3 O)。2 3 生物学特性 大肠埃希氏菌属于革兰氏阴性兼性厌氧杆菌，属于 肠杆菌科(E n t e r o b a c t e r i a c e a e)埃希氏菌属(E s c h e r i e h i a)。肠杆菌科是一群生物学性状相似的革兰阴性杆菌，大多 菌株寄居在人和动物肠道中，可随着人和动物的排泄物 广泛分布于水、土壤和腐败的物质中。大多数是肠道的 正常菌群，但当机体状态改变或细菌进入肠道以外的部 位，也可作为条件致病菌而引起感染，如菌血症、脑膜炎、肺炎、肾盂肾炎或伤口感染等。大肠埃希氏菌是引起 内 感染的较重要肠杆菌科细菌。该菌大小为(0 31 0)m(1 0 6 0)m、无芽孢、多数菌种有鞭毛，对营养要 求不高，在普通培养基上生长良好，兼性厌氧，发酵葡萄 糖产酸或产酸产气，还原硝酸盐为亚硝酸盐，不分解尿 素，一般不产生 硫化氢。大肠 埃希 氏菌某 些 菌株 动力 可 为阴性，迟缓发酵或不发酵乳糖，不产气，通常称为大肠 埃希氏菌不活泼株，易与志贺菌相?昆淆。大肠埃希氏菌 某些血清型可引起人类腹泻，如致病性大肠埃希菌、产肠 毒素大肠埃希菌、侵袭性大肠埃希菌、肠出血性大肠埃希 菌和肠聚集性大肠埃希菌。腔隙莫拉氏菌为革兰氏阴性球杆菌，属于奈瑟氏球 菌科(N e i s s e r i a c e a e)莫拉氏菌属(Mo r a x e l l a)为寄生菌。该菌细胞形状不同，从小披针 状类球形 菌到粗 短的杆 菌，大小为(0 8 1 2)m(1 5 3 0)m，成对 和短链 的 排列占优势，也有多形态的培养物，在细胞大小和形状(丝状和成长链)都有变化，严格好氧，最适温度 3 2 3 5 C，最适 p H 7 7 5，寄生于人和温血动物的粘膜上，也 可能是腐生菌，对青霉素高度敏感。本菌为条件致病菌，可 引起人类肺炎、脑脓肿 或脑膜炎、心 内膜炎、败血 症、中 耳炎、眼结膜炎等。本菌不溶血，不分解任何糖类，不产 生吲哚，在6 5 g L氯化钠肉汤中不生长。3 小结 3 1 随着赤潮 的深入 研究，细菌 正引起 人们 的重 视，近 来，国内外不断有关于菌藻关系的相关报道，但对赤潮现 场水样 中细菌的分离 与鉴定 这类基 础性研究 在 国内未见 任何报道。3 2经分 离、纯 化后，在 2 2 1 6 E培养基 上培养 后 出现的 菌落光滑、微凸、圆整、乳白色或白黄色，有特殊气味。3 3 革兰氏染色及镜检结果：两种颜色的菌株均为革兰 氏阴性菌，显微镜下 菌株形态均为杆状。3 4 由白黄色菌落分离与纯化后的菌株最终鉴定为腔隙 莫拉氏菌(置信度为9 4 7 一 9 8 2)；由乳 白色菌落分离 与纯化后的菌株最终有两种结果，分别鉴定为腔隙莫拉氏 菌(置信度为9 5 3)和大肠埃希氏菌(置信度为9 3 O)。腔隙莫拉 氏菌和大肠埃希 氏菌均 为条件致病 菌。参考文献：1 郑天凌，薛雄志，李福 东海 洋微 生物在环 境生态 中的作用 J 海洋科 学，1 9 9 4，(3)：3 5-3 8 2 K I R C HN E R M，S A HL I N G G，U H L I N G G，e t a 1 D o e s t h e r e d 2 t i d e 2 f o r mi n g d i n o fla g e l l a t e No t i l u c a s c i n t i l l a n s f e e d o n b a c t e-r i aJS a r s i a，1 9 9 6，8 1：4 5 46 3 F U K A MI KI s o l a t i o n a n d p r o p e r t i e s o f a b a c t e ri u m i n h i b i t i n g t h e g r o w t h o f G y m n o d i n i u m N a g a s a k i e n s e JN i p p o n S u i s a n G a k-k a i s h i，1 9 9 2，5 8(6)：1 0 7 3 1 0 7 7 4 I MA I I，I S HI A Y，S AK A G U C H I K，e t a 1 A l g i c i d a l m a r i n e b a c t e r i a i s o l a t e d f r o m n o rt h e m H i r o s h i ma B a y J F i s h e ri e s S c i e n c e，1 9 9 5，6 1(4)：6 2 8 63 6 5 郑天凌，田 蕴，苏建强海洋 赤潮生物 与厦 门海域 几种细菌 的生态关系研究 J 生态学报，2 0 0 2，2 2(1 2)：4 1-4 8 6 郑天凌，苏建强 海洋微生 物在赤潮 生消过程 中的作 用 J 水生生物学报，2 0 0 3，2 7(3)：2 9 1-2 9 5 7 张珞平，陈伟琪 厦 门西港 赤潮成 因的探讨 J 海洋环境科 学，1 9 9 2，l 1(3)：7 1 _ 7 4 8 张水浸 厦 门港 E u c a m p i a z o o d i a c u s赤潮 的形 成过程 及成 因 分析 A 厦门港赤潮调查 研究论文集 C 北京：海洋 出版 社，1 9 9 3 1 9-2 8 9 许 昆灿，暨卫东，周秋 麟，等 表观增 氧量在近 岸海域赤潮 快 速评价 与预 警 中 的应用 J 台湾海 峡，2 0 0 4，2 3(4)：4 1 7-4 2 2 1 O 国家海洋局 海洋 赤潮监测技 术规程 z 北京：国家海 洋局，2 0 0 2 1 1 G B 1 7 3 7 8 7-1 9 9 8，海洋监测规范 第 7部分：近海 污染生态 调查和生物监测 s 1 2 中国科 学院微生 物研究所译 伯杰 细菌鉴定手 册 第八版 s 北京：中国科学出版社，1 9 8 4 维普资讯 http:/