子宫内膜癌中LncRNA FAM83H-AS1的表达以及与患者临床病理特征和预后的关系.pdf

临床医学研究子宫内膜癌中L n c R N AF AM8 3 H-A S 1的表达以及与患者临床病理特征和预后的关系宋晓霞1,刘玉玲2,张琦31郑州人民医院 妇产科,郑州4 5 0 0 5 3;2郑州大学第二附属医院 妇产科,郑州4 5 0 0 0 0;3重庆市长寿区妇幼保健院,重庆4 0 1 2 0 0摘要 目的:检测人子宫内膜癌组织及癌旁组织中L n c R NAF AM8 3 H-A S 1的表达水平,并通过细胞学实验验证L n c R NAF AM8 3 H-A S 1对子宫内膜癌细胞增殖、侵袭和转移的影响。方法:通过细胞增值实验、细胞克隆形成实验、E d U染色、流式细胞术、T r a n s w e l l迁移以及侵袭实验等方法分析在过表达或者敲低L n c R NAF AM8 3 H-A S 1的子宫内膜癌细胞的生长增殖能力与 凋亡水平的变化。结果:(1)L n c R NAF AM8 3 H-A S 1在子宫内膜癌组织中的表达水平明显增高;(2)敲低L n c R NAF AM8 3 H-A S 1削弱子宫内膜癌细胞的增殖活性;(3)敲低L n c R NAF AM8 3 H-A S 1促进子宫内膜癌细胞的凋亡;(4)敲低L n c R NAF AM8 3 H-A S 1抑制子宫内膜癌细胞的迁移与侵袭。结论:L n c R NAF AM8 3 H-A S 1阳性可能与子宫内膜癌的发生发展有关,并可能与促进癌细胞的转移有关。关键词 子宫内膜癌;L n c R NA;F AM8 3 H-A S 1;转移中图分类号 R 7 3 7.3 3E x p r e s s i o no fL n c R N AF AM8 3 H-A S 1 i ne n d o m e t r i a l c a r c i n o m aa n d i t sr e l a t i o n s h i pw i t hc l i n i c o p a t h o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c sa n dp r o g n o s i sS ONGX i a o x i a1 L I UY u l i ng2 Z h a ngQi31D e p a r t m e n to fg y n e c o l o g ya n do b s t e t r i c s P e o p l e s H o s p i t a lo fZ h e n g z h o u Z h e n g z h o u4 5 0 0 5 3 CHN 2D e p a r t m e n to fg y n e c o l o g ya n do b s t e t r i c s t h eS e c o n dA f f i l i a t e dH o s p i t a lo fZ h e n g z h o uU n i v e r s i t y Z h e n g z h o u4 5 0 0 0 0 CHN 3C h o n g q i n gC h a n g s h o uD i s t r i c tM a t e r n a l a n dC h i l dH e a l t hH o s p i t a l C h o n g q i n g4 0 1 2 0 0 CHNA b s t r a c t O b j e c t i v e T od e t e c t t h ee x p r e s s i o nl e v e lo f l n c R NAF AM8 3 H-A S 1i nh u m a ne n d o m e t r i a lc a n c e rt i s s u e sa n da d j a c e n tt i s s u e s a n dv e r i f yt h ee f f e c to fl n c R NAF AM8 3 H-A S 1o nt h ep r o l i f e r a t i o n i n v a s i o na n d m e t a s t a s i so fe n d o m e t r i a l c a n c e rc e l l s t h r o u g hc y t o l o g i c a l e x p e r i m e n t s M e t h o d s T h eg r o w t ha n dp r o l i f e r a t i o na b i l i t ya n da p o p t o s i sl e v e l o f e n d o m e t r i a l c a n c e r c e l l so v e r e x p r e s s i n go rk n o c k d o w nL n c R NAF AM8 3 H-A S 1w e r e a n a l y z e db yc e l l p r o l i f e r a t i o nt e s t c e l l c l o n e f o r m a t i o n t e s t E d Us t a i n i n g f l o wc y t o m e t r y T r a n s w e l lm i g r a t i o na n d i n v a s i o n t e s t R e s u l t s 1 T h ee x p r e s s i o n l e v e l o fL n c R NAF AM8 3 H-A S 1i ne n d o m e t r i a lc a r c i n o m aw a ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d 2 K n o c k i n gd o w nL n c R NAF AM8 3 H-A S 1w e a k e n e dt h ep r o l i f e r a t i o na c t i v i t yo fe n d o m e t r i a lc a r c i n o m ac e l l s 3 K n o c k d o w nL n c R NAF AM8 3 H-A S 1p r o m o t e sa p o p t o s i so fe n d o m e t r i a lc a r c i n o m ac e l l s 4 K n o c k d o w no fL n c R NAF AM8 3 H-A S 1i n h i b i t st h em i g r a t i o na n d i n v a s i o no f e n d o m e t r i a l c a n c e r c e l l s C o n c l u s i o n T h ep o s i t i v ee x p r e s s i o no fL n c R NAF AM8 3 H-A S 1m a yb er e l a t e dt ot h eo c c u r r e n c ea n dd e v e l o p m e n to fe n d o m e t r i a lc a r c i n o m a a n dm a yb er e l a t e dt ot h ep r o m o t i o no f531河南大学学报(医学版),2 0 2 3,4 2(2)收稿日期:2 0 2 2-1 1-1 6基金项目:河南省科技攻关计划(2 2 2 1 0 2 3 1 0 4 8 8);河南省医学科技攻关联合共建项目(LHG J 2 0 2 2 0 7 9 4)作者简介:宋晓霞(1 9 8 1-),女,博士,副主任医师。研究方向:妇科肿瘤的基础与临床研究。通信作者,E-m a i l:s x x 1 1 3 01 6 3.c o m河南大学学报 医学版 c a n c e r c e l lm e t a s t a s i s K e yw o r d s e n d o m e t r i a l c a r c i n o m a l n c R NA F AM8 3 H-A S 1 m e t a s t a s i s 子宫内膜癌(E n d o m e t r i a lC a n c e r,E C)是女性生殖系统常见的恶性肿瘤,我国子宫内膜癌的发病率位居女性恶性肿瘤的第二位,随着我国人口老龄化的 加 剧,其 发 病 率 和 死 亡 率 均 呈 逐 年 上 升 趋势1-2。目前,子宫内膜癌的发病和转移机制尚不清楚。长链非编码R NA(l o n gn o n-c o d i n gR NA,L n-c R NA)是一类长度大于2 0 0个核苷酸,不编码蛋白质的功能性R NA分子3-4。虽然L n c R NA不具有编码蛋白质的功能,但能够通过调节mR NA剪切、降解和翻译等生理过程发挥作用5。序列相似性家族8 3成员H反义R NA1(F AM8 3 H-A S 1)是一种与癌症进展密切相关的L n c R NA,其异常的高表达水平与多种癌症的发生发展密切相关。目前还没有F AM8 3 H-A S 1在子宫内膜癌中的作用及其机制相关研究,F AM8 3 H-A S 1对子宫内膜癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用仍不清楚。本研究主要通过检测人子宫内膜癌组织及癌旁组织中L n c R NAF AM8 3 H-A S 1的表达水平,并通过细胞学实验验证L n c R NAF AM8 3 H-A S 1对子宫内膜癌细胞增殖、侵袭和转移的影响。1 材料与方法1.1 主要材料 本研究搜集2 0 1 8年1 0月至2 0 2 0年1 0月就诊于郑州人民医院的3 9例子宫内膜癌患者的肿瘤组织以及配对的癌旁组织,其中包括子宫内膜样癌2 0例(其中G 15例,G 27例,G 38例),非内膜样癌1 9例(其中包括浆液性癌1 0例,粘液性癌5例,透明细胞癌4例)。组织标本于手术期间取得,并立即在-8 0下冷冻直到下一步使用。在实验样本收集之前,从每个参与者处获得了书面知情同意,研究方案经郑州人民医院临床研究伦理委员会批准备案。纳入标准:年龄2 57 5岁;符合 妇产科常见疾病指南5中子宫内膜癌诊断标准;经病理组织学检查确诊者;入院前3个月无性激素类药物治疗史者;术前未接受过放疗、化疗等抗肿瘤治疗方案者;依从性良好。排除标准:脑外伤、中枢神经系统感染引起的痴呆等;精神疾病患者;酗酒或药物滥用史患者;心肝肾严重功能障碍患者;合并其他肿瘤性疾病者;血液性系统疾病患者。4种子宫内膜癌细胞系(HE C-1 B,HE C-1 A,i s h i k a w a以及R L-9 5 2)和1株正常子宫内膜上皮细胞系(h E E C)购自湖南丰晖生物科技有限公司(湖南)。1.2 主要方法1.2.1 qR T-P C R 采用q R T-P C R分析了在临床上收集的3 9例子宫内膜癌患者的肿瘤组织以及配对的癌旁组织中F AM8 3 H-A S 1的表达水平。具体步骤:通过T R-I z o l试剂(T h e r m o f i s h e rs c i e n t i f i c,U S A)提取,并且使用N a n o D r o p10 0 0分光光度计(T h e r m o f i s h e rs c i e n t i f i c,U S A)测 定 蛋 白 质 浓 度。使 用A g i l e n t2 1 0 0生物分析仪(A g i l e n tT e c h n o l o g i e s)评估提取的R NA的质量,使用P r i m e S c r i p ts y n t h e s i sc D NAk i t(T a k a r aB i o t e c h n o l o g y,J a p a n)反转录合成c D-NA,S Y B RG r e e nP C R M a s t e rM i x(T a k a r aB i o-t e c h n o l o g y,J a p a n)进行q P C R,将GA P DH mR NA含量标准化。引物序列如下:F AM8 3 H-A S 1:(R)5-AG C T C C A C C T C C C G G G T T C A C G-3(F)5 -C G T GAA C C C G G GAG G T G GAG C T 3。逆转录反应体系按照说明书严格进行。1.2.2 构建低表达F AM8 3 H-A S 1的子宫内膜癌细胞系 靶向F AM8 3 H-A S 1的s h R N A由生工生物科技有限公司(S a n g o nB i o t e c h,S h a n g h a i,C h i n a)合成,并插入p L K O.1-T R C克隆载体(A d d g e n e)中,靶向序列分别为:-C T T G C G A T C G G G T C G A T C G A T C T-T A G C T T T G C G A-3(s h R N A 1)和5 -G T C C G-T A G C T A G C T A A A G T C G A T T C G A T C G T A C A A G A-3(s h R N A-2)。另外将p L K O.1-T R C对照载体用作对照的空载体(命名为S c r-s h R N A)。1.2.3 细胞增殖实验(C C K-8法)转染后2 4h收集细胞并进行重悬,将细胞密度为11 06个/m L,浓度为21 05个/m L的单细胞悬液接种到9 6孔板中,并在细胞接种后9 6h进行细胞计数试剂盒8(C C K-8)测定(B e y o t i m e,C h i-n a)。9 6h后取出孔板,将1 0L C C K-8溶液添加到每个孔中并在3 7下孵育2h后,使用酶标仪(B i o-R a dL a b o r a t o r i e s,U S A)在4 5 0n m的波长下分析631J o u r n a l o fH e n a nU n i v e r s i t y M e d i c a lS c i e n c e 2 0 2 3 4 2 2 细胞的增殖活性。将来自三个独立实验的结果取平均值进行分析。1.2.4 T UN E L染色 首先用P B S或H B S S洗涤一次。如果细胞贴得不牢,可以干燥样品使细胞贴得更牢;用4%多聚甲醛固定细胞3 0m i n;用P B S或H B S S洗涤一次;加入含0.3%T r i t o n X-1 0 0的P B S,室 温 孵 育5m i n;在样品上加5 0LTUN E L检测液,3 7避光孵育6 0m i n;P B S或H B S S洗涤3次。最后用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为4 5 0-5 0 0n m,发射波长范围为5 1 5-5 6 5n m。1.2.5 E d U染色 显微镜下观察细胞,配制2E d U工作液,加入2E d U工作液,孵育-固定-弃去培养液,用4%多聚甲醛溶液来固定,固定时间2 0m i n。洗涤-渗透剂-洗涤,E d U检测。1.2.6 流式细胞术 使用胰酶消化细胞,10 0 0r p m离心收集所有细胞;使用4预冷的P B S洗涤细胞2次;用0.5m LP B S悬浮细胞,缓慢加入到预冷的7 0%乙醇溶液中(用P B S配制,-2 0预冷),快速混匀,使用封口膜封口,-2 0固定过夜;将固定过的细胞以4,10 0 0 r p m,离心5m i n,弃上清液,转移到E P管中,用P B S洗涤2次。计数细胞,调整细胞密度为11 0 6个细胞/m L,取1 m L进行试验。4,10 0 0r p m,离心5m i n取细胞沉淀;加入9 0 0LP B S缓冲液重悬细胞;加入1 0 0LR N a s e A溶液,使R N a s e A终浓度为1 0 0g/m L),3 7孵育3 0 m i n;4,10 0 0 r p m i n离心5m i n,弃去上清液;加入4 5 0LP B S悬浮细胞,加入4 5 0LP I染液,避光冰置2 0m i n;上流式细胞仪检测,分析记录结果。1.2.7 T r a n s w e l l实验 采用了T r a n s w e l l实验分析了H E C-1 A和H E C-1 B细胞的迁移和侵袭能力的改变。M a t r i g e l胶4过夜,提前开制冰机,枪盒预冷。M a t r i g e l胶的原液为8.6m g/m L。用无血清培养基将M a t r i g e l胶分别配制成1 0 0g/m L和3 0g/m L的溶液;向2 4孔板的每孔中加入4 0 0L体积、浓度为3 0m g/m L的M a t r i g e l胶溶液,将t r a n s w e l l小室置于溶液内,再滴加2 0 0L浓度为3 0m g/m L的M a t r i g e l胶溶液,冰上放置1h后吸弃溶液、晾干;将1 0 0n g/m L的M a t r i g e l胶溶液吹打均匀后,吸取1 0 0u L缓慢滴加于t r a n s w e l l上室基底膜上。晃动均匀后置于3 7培养箱内放置0.5h;将细胞在无血清培养基中培养过夜;将小室放入含有6 0 0L无血清培养基的2 4孔板小孔中后,放置孵育箱活化3 0m i n以上;消化细胞,将其制成单细胞悬液,吸取1m L至标记好的1.5m LE P管内,离心后用无血清培养基重悬细胞。调整细胞浓度为2 1 0 5个/m L的单细胞悬液;取2 0 0L细胞悬液加入到小室上室中,在小室的下室中加入6 0 0L含1 5%F B S的R P M I-1 6 4 0培养基,放于孵育箱中培养2 4h;弃培养基,用含4%多聚甲醛的固定液室温固定细胞2 0m i n,接着用0.1%结晶紫染色2 0m i n,然后用棉签擦去小室上层细胞,冲洗晾干小室;于倒置显微镜下采集图像(1 0 0),随机选取6个不同视野计数分析。1.3 数据分析方法对实验数据的分析使用G r a p h P a dP r i s m8.0软件,对于临床样本分析,使用p a i r e d-t-t e s t检测数据间的显著性差异,对于细胞实验,使用o n e-W a yANOVA或者T w o-W a yANOVA方差分析,方差分析之后使用T u k e y sm u l t i p l ec o m p a r i s o nt e s t进行独立检验,P0.0 5)。但是,在F AM8 3 H-A S 1阳性的患者中,具有更高的F I GO分期,此外,731河南大学学报(医学版),2 0 2 3,4 2(2)河南大学学报 医学版 研究还发现,非内膜样癌F AM8 3 H-A S 1的表达水平更高,且肿瘤的组织学分级越高,就更具有转移的可能,预示着预后情况更为不佳。见表1。表1 子宫内膜癌肿瘤组织中F A M8 3 H-A S 1的表达水平与子宫内膜癌临床病理特征相关性临床资料例数肿瘤组织中F AM8 3 H-A S 1的表达水平阴性(%)阳性(%)P年龄 6 0岁2 18(3 8.1)1 3(6 1.9)6 0岁1 81 1(6 1.1)7(3 8.9)0.8 2 3肿瘤直径 2 c m1 37(5 3.9)6(4 6.1)2 c m2 61 2(4 6.2)1 4(5 3.8)0.9 9 9组织学分类 内膜样癌2 01 2(6 0.0)8(4 0.0)非内膜样癌1 97(3 6.8)1 2(6 3.2)0.2 8 0临床F I G O分期+1 48(5 7.1)6(4 2.9)+2 51 1(4 4.0)1 4(5 6.0)0.0 1 2淋巴结转移 无97(7 7.8)2(2 2.2)有3 01 2(4 0.0)1 8(6 0.0)0.0 0 1组织学分级 G 188(1 0 0.0)0(0.0)G 21 35(3 8.5)8(6 1.5)G 31 87(3 8.9)1 1(6 1.1)0.0 5)。但是,在高表达F AM8 3 H-A S 1的患者中,具有更高的F I G O分期,此外,研究还发现,非内膜样癌F AM8 3 H-A S 1的表达水平更高,且肿瘤的组织学分级更高,就更具有转移的可能,预示着预后情况更为不佳。进一步使用L i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0转染试剂盒将靶向F AM8 3 H-A S 1的s h R N A质粒转染至子宫内膜癌细胞H E C-1 A和H E C-1 B细胞中,通过q R T-P C R检测s h R-N A的转染效率。随后的实验发现敲低F AM8 3 H-A S 1会显著抑制子宫内膜癌细胞在体外的增殖,其主要表现在低表达F AM8 3 H-A S 1 H E C-1 A和H E C-1 B的子宫内膜癌细胞的增殖活性被显著抑制,在平板上形成的克隆数量也显著减少。而且,进一步通过T U N E L染色发现,敲低F AM8 3 H-A S 1会显著促进H E C-1 A与H E C-1 B细胞中的凋亡小体的形成,从而揭示了低表达F AM8 3 H-A S 1会明显促进子宫内膜癌细胞的凋亡。以上结果说明,L n c R N AF AM8 3 H-A S 1高表达可能与子宫内膜癌的发生发展有关,并可能与促进癌细胞的转移有关。但是由于样本数量较少,L n c R N AF AM8 3 H-A S 1在子宫内膜癌发病机制中的作用以及表达与调控机制有待于进一步研究,此外,该基因是否可作为子宫内膜癌患者的易感筛查指标,以及如何找到有效下调L n c R N AF AM8 3 H-A S 1的方法,是我们下一步研究的目标。参考文献 1 YU H L YA Q H S HE N G C W e ta l L n c R NAS NHG 5 an e wb u d d i n gs t a ri nh u m a nc a n c e r s J G e n e 2 0 2 0 7 4 9 1 4 4 7 2 4 2 HE R R I N G TON CS P OU L S OM R C OA T E SPJ R e c e n ta d v a n c e si np a t h o l o g y t h e2 0 2 0a n n u a lr e v i e wi s s u eo ft h eJ o u r n a lo fP a t h o l o g y J JP a t h o l 2 0 2 0 2 5 0 5 4 7 5-4 7 9 3 DG u p t a C l i n i c a l b e h a v i o r a n dt r e a t m e n t o f e n d o m e t r i a lc a n c e r J A d vE x pM e dB i o l 2 0 1 7 9 4 3 4 7-7 4 4 W u R u i f a n g S u Y u w e n Wu H a i j i n g e ta l C h a r a c-t e r s f u n c t i o n sa n dc l i n i c a l p e r s p e c t i v e so f l o n gn o n-c o d-i n gR NA s r e v i e w J M o lG e n e tG e n o m i c s 2 0 1 6 2 9 1 3 1 0 1 3-1 0 3 3 5 中国抗癌协会妇科肿瘤专业委员会 子宫内膜癌诊断与治疗指南 第 四 版 J 中 国 实 用 妇 科 与 产 科 杂 志 2 0 1 8 3 4 8 5 2-5 8 6 S ON GCY Z HANGJL Z HAOZY e t a l D L E U 1 af u n c t i o n a l l o n gn o n c o d i n g R NAi nt u m o r i g e n e s i s J C u r rP h a r mD e s 2 0 2 0 2 6 1 7 4 2-1 7 4 8 7 WAN GRl Z OUL D o w n r e g u l a t i o no fL n c R NA-ME G 3p r o m o t e s HT R 8 S V n e oc e l l sa p o p t o s i sa n da t t e n u a t e si t sm i g r a t i o nb yr e p r e s s i n gN o t c h 1s i g n a l i np r e e c l a m p-s i a J R e p r o d u c t i o n 2 0 2 0 1 6 0 2 1-2 9 8 P I U L A T SJM GU E R R AE G I L-MA R T N M e t a l M o l e c u l a ra p p r o a c h e sf o rc l a s s i f y i n ge n d o m e t r i a lc a r c i-n o m a J G y n e c o lO n c o l 2 0 1 7 1 4 5 1 2 0 0-2 0 7 9 G u p t aD C l i n i c a l b e h a v i o r a n dt r e a t m e n t o f e n d o m e t r i a lc a n c e r J A d vE x pM e dB i o l 2 0 1 7 9 4 3 4 7-7 4 1 0 GUOC S ONG WQ S UNP e ta l L n c R NA-G A S 5i n d u c e sP T E Ne x p r e s s i o nt h r o u g hi n h i b i t i n g m i R-1 0 3i ne n d o m e t r i a l c a n c e r c e l l s J JB i o m e dS c i 2 0 1 5 2 2 1 0 0 0 1 5-0 2 1责任编辑:刘红林041J o u r n a l o fH e n a nU n i v e r s i t y M e d i c a lS c i e n c e 2 0 2 3 4 2 2